超聲波萃取方法對螺旋藻葉綠素含量的影響

楊軍 王艷菊 曹菊秀 白永文

摘 要：運用分光光度法對螺旋藻中葉綠素含量進行檢測，運用超聲波細胞破碎儀在不同萃取溫度、萃取時間及萃取劑條件下對葉綠素進行樣品前處理，再對含量進行測定。萃取溫度對測定螺旋藻中葉綠素含量具有一定影響作用，測定其含量的適宜萃取溫度為20～22℃；萃取時間對測定螺旋藻中葉綠素含量也具有影響，利用超聲波細胞破碎儀的適宜萃取時間為1.5～2h，比原來的8h大幅減少；此外，萃取劑對螺旋藻葉綠素含量的影響最大。萃取劑不宜選擇單一的有機溶劑，通過不同的體積比混合乙醇和丙酮后，能夠促進葉綠素檢測結果含量明顯提高，通過實驗發(fā)現，最適宜的萃取劑為1：1：1的乙醇（分析純）、丙酮（分析純）、乙醚（分析純）混合劑。

關鍵詞：超聲波萃??；螺旋藻；葉綠素含量

中圖分類號：S968 文獻標識碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20180833001

螺旋藻中含有豐富的葉綠素，而葉綠素對血紅素水平具有有效的改善作用，可促進血液循環(huán)系統功能提高。螺旋藻葉綠素含量這一指標可用于估測藻類的生產力和生物量。葉綠素的可見光波段的吸收光譜，在藍光和紅光處各有一顯著的吸收峰，吸收峰的位置和消光值的大小隨葉綠素種類不同而有所不同，葉綠素a最大的吸收光波長在420～663nm，葉綠素b的最大吸收波長范圍在460～645nm。目前使用的7種檢測葉綠素試樣的制備方法可總結為常溫常壓條件下的研磨法和浸提法。

研磨法，對試樣進行研磨，以此來提取試樣中的葉綠素含量，將研磨好的葉綠素提取液過濾洗滌，定容到容量瓶中，進行分光光度法分析。在該方法的測定過程中研磨方法可能對于葉綠素含量存在一定的影響。

浸提法，將試樣制備均勻，將這些均勻的試樣放入盛有提取液的容量瓶中封口，至于黑暗中直接浸提，用分光光度計測量。不過浸提法的測定用時較久，而且不同浸提液測定的值也可能存在比較大的差異性。

檢測葉綠素的標準方法均為分光光度法，但采用的分光光度計的測定波長有所差異，波長范圍為620～720nm。通過對目前所有檢測方法比較分析，研磨法試樣制備，耗時較長，對檢驗人員的研磨經驗要求較高，復現性和穩(wěn)定性不好；浸提法試樣制備方法比較粗糙，達不到充分提取葉綠素的狀態(tài)。超聲波萃取法對的試樣制備、萃取液選擇、波長的確定等程序進行逐一優(yōu)化、結合、改進，實現螺旋藻中葉綠素檢測方法簡化，效率得以較大提升，重復的穩(wěn)定性更好。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

由云南省螺旋藻產品質量檢驗中心提供螺旋藻原料。主要試劑為乙醇（分析純）、丙酮（分析純）、乙醚（分析純）。

1.2 設備和儀器

電子天平：型號BSA224S-CW；最大稱量220g；精度0.1mg。

超聲波細胞破碎儀：型號Scientz-650E；功率5～650W可調；脈沖0.1～99.9s可調；定時0～999min設置。

雙束紫外可見分光光度計：設備型號TU1901；功率200W；等級Ⅱ級。

另外還有電熱恒溫鼓風干燥箱等輔助設備。

1.3 方法

準確稱取螺旋藻粉樣品0.2g（精確0.1mg）置入50mL比色管中，加入按照1：1：1比例配制好的乙醇（分析純）、丙酮（分析純）、乙醚（分析純）混合溶劑25mL后，用超聲波細胞破碎儀超聲1h，傾出到250mL的分液漏斗中，加入50mL乙醚繼續(xù)進行萃取，在萃取液中加入100mL超純水，輕蕩、靜置，棄去下層溶液，萃取溶液經過10g無水硫酸鈉收集于100mL容量瓶中，用乙醚定容。

1.3.1 萃取溫度

對稱取的0.2g（精確0.1mg）螺旋藻粉樣品，置入50mL比色管后，加入25mL混合萃取劑，用超聲波細胞破碎儀進行超聲。溫度當控制在正常室溫，最佳溫度為20～22℃，溫度太低會導致有機溶劑結晶，溫度偏高會導致有機溶劑快速揮發(fā)，均不利于樣品前期處理的效果。

1.3.2 萃取時間

對稱取的0.2g（精確0.1mg）螺旋藻粉樣品，置入50mL比色管后，加入25mL混合萃取劑，用超聲波細胞破碎儀進行超聲。溫度當控制在正常室溫，最佳溫度為20～22℃，萃取時間分為3個節(jié)點，分別為0.5h、1.0h、1.5h，每個進行3次重復處理，對最優(yōu)萃取時間下萃取液的吸光度進行有效檢測。

1.3.3 萃取劑

對稱取的0.2g（精確0.1mg）螺旋藻粉樣品，置入50mL比色管后，分別加入25mL的C1（分析純的乙醇）、C2（分析純的丙酮）、C3（分析純的乙醚）、C4（按照1：1：1比例配制好的混合溶劑）共4種萃取劑，在20～22℃環(huán)境下進行萃取，用超聲波細胞破碎儀超聲1.0h，傾出到250mL的分液漏斗中，加入50mL乙醚繼續(xù)進行萃取，在萃取液中加入100mL超純水，輕蕩、靜置，棄去下層溶液，萃取溶液經過10g無水硫酸鈉收集于100mL容量瓶總，用乙醚定容后，對不同萃取液進行檢測，準確記錄結果進行有效比對。

1.3.4 計算葉綠素含量

經萃取后的溶液，用乙醚定容至刻度后，立即用紫外可見分光光度計在642nm及660nm波長處進行吸光值測定，1cm比色皿，用乙醚作空白。按照葉綠素質量分數的相關公式對其質量分數進行準確計算，測定結果以平行試驗的算術平均值計，保留到小數點后1位。

2 結果

2.1 螺旋藻中葉綠素含量受萃取溫度的影響情況

見表1。

葉綠素含量受不同萃取溫度的影響明顯。在20～22℃萃取溫度條件下，螺旋藻中葉綠素含量最高，在低于20℃條件下萃取，測得的含量偏低，在大于23℃條件下，也明顯偏低。可見，萃取溫度對測定螺旋藻葉綠素含量具有顯著影響作用，通過分析，萃取溫度的高低直接影響到有機溶劑對樣品的萃取效果，故而影響最終葉綠素的檢測結果。

2.2 螺旋藻中葉綠素含量受萃取時間的影響情況

見表2。

可見，萃取時間對葉綠素含量有一定的影響。在1.5h萃取時間下，葉綠素含量最高，在大于2h萃取時間時，對葉綠素含量已經沒有多少變化，顯得多余。在低于1h萃取時間下，相比于其他萃取時間，葉綠素含量與其之間的差異明顯?？梢?，萃取溫度對測定螺旋藻葉綠素含量具有一定的影響，測定其含量的最佳萃取時間為1.5h。

2.3 螺旋藻中葉綠素含量受萃取劑的影響情況

不同萃取劑對葉綠素含量的影響顯著。常規(guī)方法使用的萃取劑為乙醚，通過試驗，發(fā)現單一萃取劑對樣品的萃取效果并不理想。本試驗使用4種萃取劑，分別是C1（分析純的乙醇）、C2（分析純的丙酮）、C3（分析純的乙醚）、C4（按照1：1：1比例配制好的混合溶劑）共4種萃取劑，葉綠素通過C4萃取劑萃取，其存在最高的含量，且與C1、C2、C3萃取劑之間的差異明顯，可見，萃取劑不適宜選擇單一的乙醇、丙酮或乙醚，通過相同的體積比按照1：1：1比例配制的乙醇（分析純）、丙酮（分析純）、乙醚（分析純）混合溶劑，能夠促進螺旋藻中葉綠素含量顯著提高。

3 結論

螺旋藻是古老的微生物之一，分布在熱帶、亞熱帶地區(qū)。是一類低等生物，由單細胞或多細胞組成的絲狀體，圓柱形，呈疏松或緊密的有規(guī)則的螺旋旋形彎曲，故而得名。作為地球上最古老的物種之一，因各種生物活性物質和營養(yǎng)物質存在于螺旋藻中，因此該物質屬于優(yōu)質菌體蛋白，且具有“食藥同源”的作用，被人類食用已有100多年的歷史。聯合國糧農組織把螺旋藻認定為“2l世紀最理想的食品”。螺旋藻中的極大螺旋藻、鈍頂螺旋藻兩個品種允許作為保健食品的原料。螺旋藻中蛋白質含量比例較高，高達60%～70%，且消化吸收率高達95%以上，還含有豐富的類胡蘿卜素和B族維生素，具有較高的營養(yǎng)價值。

本文在使用紫外可見分光光度法測定螺旋藻中葉綠素含量過程中，利用超聲波細胞破碎儀進行樣品處理，同時加入混合有機溶劑，探究出溫度、時間、萃取劑等相關影響因素，旨在對葉綠素含量進行快速測定。通過實驗發(fā)現，最佳萃取溫度為20～22℃，利用超聲波細胞破碎儀的適宜萃取時間為1.5～2h，萃取劑為乙醇（分析純）、丙酮（分析純）、乙醚（分析純）按照1：1：1比例配置的混合溶劑。此方法與以往樣品處理方法最不同地方是利用了超聲波細胞破碎儀和使用了混合溶劑，極大的縮短了樣品處置時間，從以前的8h，縮短到2h以內。上述方法操作簡單易行，具有良好的萃取效果，確保能夠有效運用紫外可見分光光度法對藻類葉綠素含量進行準確測定。

參考文獻

[1]羅光宏，許耀照，何琳，等.影響分光光度法測定螺旋藻葉綠素含量的因素分析[J].食品科學，2014，35（14）：151-154.

[2]付麗麗，金晶，吉美萍，等.螺旋藻葉綠素a提取方法探討[J].應用化工，2015，44（12）：2196-2198.