苯胺對小鼠成纖維細胞L929的體外毒性評價

蔣偉，朱洪坤，清江

上海出入境檢驗檢疫局工業(yè)品與原材料檢測技術(shù)中心，上海 200135

苯胺又稱阿尼林、胺基苯，主要由人工合成，廣泛用于印染、塑料、油漆、香料、制藥、農(nóng)藥、樹脂、橡膠助劑等行業(yè)[1]。苯胺純品為無色油狀液體，具有特殊氣味，可經(jīng)呼吸道、皮膚和消化道吸收，容易被忽視而引起職業(yè)中毒[2]。當前雖有苯胺毒理學(xué)數(shù)據(jù)，但多為動物活體實驗數(shù)據(jù)，相關(guān)細胞毒理學(xué)機制研究不多[3]。目前歐盟(英國)、巴西、韓國、美國、俄羅斯、澳大利亞、加拿大等15個國家和地區(qū)已禁止了化妝品動物實驗，我國預(yù)計也將采用分階段試行的策略，逐步禁止動物實驗。發(fā)展體外替代實驗是今后毒理學(xué)的發(fā)展趨勢，苯胺細胞毒理學(xué)實驗方法可作為經(jīng)典動物實驗方法的替代和補充[4]。L929細胞是國標中進行細胞毒性評價的常用細胞之一，我們擬用不同濃度的苯胺化合物處理L929細胞，觀察其生長變化趨勢。在細胞增殖、存活、凋亡以及胞外活性氧定量等方面進行檢測，以期評價苯胺化合物對L929細胞增殖效應(yīng)的影響，并初步探討其分子機制。該研究將為化妝品檢驗、環(huán)境化合物的毒性檢測等提供必要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。該研究將為危險化學(xué)品健康危害分類鑒定和風險評估提供論依據(jù)，并能從細胞水平為計算毒理學(xué)建模提供數(shù)據(jù)支持，是化學(xué)品風險管理的發(fā)展趨勢之一[5]。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料和儀器

H-DMEM細胞培養(yǎng)基和無酚紅培養(yǎng)基(Gibco)，胎牛血清(Gibco)，0.25%胰酶+0.04%EDTA(Gibco)，96孔培養(yǎng)板(Corning)，細胞凋亡檢測試劑盒(北京寶賽生物技術(shù)有限公司)，活性氧檢測試劑盒和總谷胱甘肽檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)，苯胺、DMSO、NaCl、KCl等常規(guī)化學(xué)試劑購自北京化學(xué)試劑公司。細胞培養(yǎng)箱(Thermo Forma, Steri-Cycle)、熒光顯微鏡(Lecai, AF6000)、流式細胞儀(BD, FACSCalibur)、酶標儀(Bio-Rad, iMark)、水浴鍋(上海赫田科學(xué)儀器有限公司，HH-M2)、微量加樣器(Eppendorf，100 μL-1 mL，50 μL-200 μL，10 μL-100 μL，2 μL-20 μL，0.1-2.5 μL)為實驗室常規(guī)儀器設(shè)備。L929細胞購自北京協(xié)和細胞庫，為實驗室常規(guī)留種液氮保存。

1.2 細胞培養(yǎng)

小鼠成纖維細胞L929，用H-DMEM+10%胎牛血清在37 ℃、95%空氣和5%CO2的條件下培養(yǎng)。隔天換液一次，每3～4天傳代一次。

1.3 細胞存活率檢測

采用MTT法檢測，將對數(shù)生長期L929細胞，接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔5×103個細胞，100 μg·孔-1，設(shè)空白對照組、正常組及實驗組，用不同濃度的苯胺化合物(0，0.001，0.01，0.1，1，10 μg·mL-1)處理細胞，24 h、48 h、72 h分別測定490 nm處吸光度，以反映細胞增殖趨勢。

1.4 細胞活力和凋亡檢測

常規(guī)步驟進行培養(yǎng)細胞的AO/PI染色，熒光顯微鏡下觀察，490 nm和510 nm激發(fā)熒光，可區(qū)分活細胞和死細胞。發(fā)綠色熒光的細胞為活細胞；發(fā)紅色熒光的細胞為死細胞。收集添加不同濃度苯胺化合物培養(yǎng)24 h的L929，利用Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒進行細胞凋亡的評價，按照試劑盒說明書操作。

1.5 細胞內(nèi)活性氧測定

不同濃度苯胺化合物處理24 h后的L929細胞(無酚紅培養(yǎng)基培養(yǎng))，按照ROS測定試劑盒說明書操作步驟進行，加入稀釋好的DCFH-DA探針，37 ℃孵育4 h后，胰酶消化收集細胞，PBS重懸，提取細胞總蛋白后，熒光酶標儀(488 nm)測定，同時設(shè)置未處理的空白對照組，檢測結(jié)果表示為熒光度值/毫克蛋白。

1.6 細胞內(nèi)GSH測定

不同濃度苯胺化合物處理24 h后的L929細胞，胰酶消化收集細胞，PBS洗滌2遍，重懸，勻漿后提取細胞總蛋白，并進行蛋白定量，然后取100 μL蛋白溶液，加入100 μL試劑一，3 500 r·min-1，離心10 min，取上清待用，接下來按照GSH測定試劑盒說明書操作步驟進行，分別設(shè)定空白孔、，標準孔和測定孔，混勻各種試劑，靜置5 min，分光光度計405 nm處測定OD值，根據(jù)說明書中的計算公式，得出細胞GSH含量，以吸光度值/毫克蛋白表示。

2 結(jié)果(Results)

2.1 不同濃度的苯胺處理L929細胞后的增殖結(jié)果

在體外細胞實驗中，對細胞毒性評價最常用的指標之一，就是MTT法檢測細胞增殖，通過490 nm處OD值的比較，可以間接反映出活細胞的數(shù)量，且在一定范圍內(nèi)，OD值越高說明細胞增殖結(jié)果更好。從圖1中可以看出，高濃度的苯胺化合物對L929細胞的生長具有顯著抑制作用，1 μg·mL-1和10 μg·mL-1的苯胺化合物作用下，24 h之后L929細胞就基本全部死亡，OD值檢測值和空白組基本一致。相比而言，0.001、0.01和0.1 μg·mL-1苯胺化合物的作用，在24 h檢測，細胞增殖狀態(tài)基本未受影響，和空白對照組基本一致。然而，0.1 μg·mL-1的苯胺在處理至48 h時，細胞數(shù)量顯著下降，說明該濃度對細胞的影響具有時間累積效應(yīng)，接下來培養(yǎng)至72 h，細胞數(shù)量基本降至0，這說明了細胞基本全部死亡。上述結(jié)果表明，盡管0.1 μg·mL-1的劑量并不高，苯胺化合物在初期的細胞生長抑制效應(yīng)也不明顯，但是特別要注意處理時間的延長可能會導(dǎo)致細胞嚴重受損，將會帶來嚴重后果。因此，我們根據(jù)細胞增殖結(jié)果，對后續(xù)的苯胺處理劑量和時間進行了優(yōu)化，選取0、0.001、0.01和0.1 μg·mL-1這4個濃度，以處理細胞24 h為檢測時間點。

2.2 不同濃度苯胺處理的L929細胞ROS含量變化

苯胺濃度分別為0、0.001、0.01和0.1 μg·mL-1，處理細胞24 h后檢測胞內(nèi)ROS含量，各組ROS含量分別為(41.39±4.60) U·mg-1、(80.19±11.36) U·mg-1、(101.36±3.58) U·mg-1以及(172.99±7.19) U·mg-1(如圖2所示)，結(jié)果表明，0.1 μg·mL-1苯胺處理細胞24 h后，胞內(nèi)ROS的含量較對照組顯著增加，說明細胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，已經(jīng)受到了明顯的損傷，繼續(xù)培養(yǎng)，有可能加劇凋亡或死亡，這也進一步說明了苯胺化合物的細胞毒性，低劑量的苯胺，對細胞的氧化應(yīng)激損傷效應(yīng)略有影響，但并不明顯，然而0.1 μg·mL-1苯胺處理24 h后的累積效應(yīng)足以引起細胞損傷。

圖1 MTT法檢測苯胺對L929細胞增殖的影響注： *代表與對照組相比，P<0.01。Fig. 1 The effect of phenylamines on L929 cell proliferation by MTT testNote: Compared with the control, * P<0.01.

圖2 苯胺暴露后L929細胞ROS含量變化注：*代表與對照組相比，P<0.01。Fig. 2 The detection of ROS content of L929 cell after exposure to phenylaminesNote: Compared with the control, * P<0.01.

2.3 不同濃度苯胺處理的L929細胞總谷胱甘肽含量變化

苯胺化合物濃度分別為0、0.001、0.01和0.1 μg·mL-1，處理細胞24 h后檢測總谷胱甘肽含量的變化情況，分別為(152.23±10.27) U·mg-1、(93.08±8.26) U·mg-1、(91.76±7.47) U·mg-1、(59.44±5.11) U·mg-1(如圖3所示)。從結(jié)果中可以看出，總谷胱甘肽的含量呈現(xiàn)下降趨勢，0.001、0.01 μg·mL-1這2個處理濃度的結(jié)果相差不大，但較對照組，總谷胱甘肽的含量下降約30%。由于GSH是一種低分子自由基清除劑，這說明即使低濃度的苯胺暴露，細胞外自由基的清除能力亦有所降低。與對照組相比，當苯胺處理濃度至0.1 μg·mL-1時，胞外GSH的含量顯著降低，說明細胞的活性氧清除能力受到很大抑制，這也是細胞受損的重要原因之一。

2.4 細胞活力的變化

在細胞體外培養(yǎng)過程中，細胞活力的檢測也是細胞狀態(tài)評價的重要指標之一。一般來說，我們選取AO/PI熒光染色來判定細胞活力?；罴毎尸F(xiàn)綠色熒光，死細胞呈現(xiàn)紅色熒光。苯胺化合物濃度分別為0、0.001、0.01和0.1 μg·mL-1作用L929細胞24 h后，細胞活力檢測結(jié)果如圖4所示，從圖中可以看出，貼壁細胞大部分呈現(xiàn)綠色熒光，說明細胞活力情況良好，0 μg·mL-1、0.001 μg·mL-1和0.01 μg·mL-1組僅有極少量的死細胞。當苯胺濃度加大至0.1 μg·mL-1時，從圖中可以明顯觀察到許多紅色熒光的死細胞，說明細胞活力受到了影響。

2.5 細胞凋亡結(jié)果檢測

濃度分別為0、0.001、0.01和0.1 μg·mL-1的苯胺化合物作用L929細胞24 h后流式細胞儀檢測細胞凋亡結(jié)果如圖5所示，從圖中可以看出，對照組細胞(0 μg·mL-1)的凋亡和壞死的總比例為18.92%；低濃度(0.001 μg·mL-1)的苯胺化合物處理的L929細胞，其凋亡和壞死的總比例為24.83%；0.01 μg·mL-1的苯胺化合物處理的L929細胞，其凋亡和壞死總比例為26.25%；上述3組數(shù)據(jù)之間差異不大。而在0.1 μg·mL-1的苯胺化合物作用下，細胞的凋亡和壞死的總比例顯著上升至92.5%，僅有7.5%的細胞為正常狀態(tài)。上述結(jié)果進一步說明了苯胺化合物，尤其是高濃度的苯胺化合物，將引起L929細胞的顯著凋亡，對細胞產(chǎn)生明顯損傷。

圖3 苯胺暴露后L929細胞GSH含量變化注：*代表與對照組相比，P<0.01。Fig. 3 The detection of GSH content of L929 cell after exposure to phenylaminesNote: Compared with the control, * P<0.01.

圖4 不同濃度苯胺處理L929細胞24 h后AO/PI染色結(jié)果注：A，0 μg·mL-1；B，0.001 μg·mL-1；C，0.01 μg·mL-1；D，0.1 μg·mL-1；標尺=200 μm。Fig. 4 AO/PI staining images of L929 after different concentration of phenylamines treatment within 24 hNote: A, 0 μg·mL-1; B, 0.001 μg·mL-1; C, 0.01 μg·mL-1; D, 0.1 μg·mL-1; bar=200 μm.

圖5 Annexin V-FITC染色流式細胞儀檢測細胞凋亡結(jié)果Fig. 5 Analysis of apoptotic/dead cell after treatment with different concentration of phenylamines for 24 h by FACS test with Annexin V-FITC staining

3 討論(Discussion)

近年來，我國多地時有苯胺車間發(fā)生爆炸、泄漏的事故發(fā)生，苯類化合物嚴重超標，對人民的生活和健康造成了嚴重影響。其中，作為強致癌物質(zhì)的苯胺，受到了人們的極大關(guān)注，苯胺中毒極易引起肝、腎毒性，且存在潛伏期，因此，苯胺化合物的毒理學(xué)評價研究至關(guān)重要[6-7]。本研究主要針對不同濃度的苯胺化合物對L929細胞的毒性影響進行了評價，將為苯胺化合物的細胞毒性閾值的確定和后期防護提供理論依據(jù)。

從細胞增殖情況來看，高濃度的苯胺化合物對細胞的增殖起到了明顯的抑制作用，隨著作用時間的延長，高濃度處理組的細胞基本上全部漂起、死亡，說明了高濃度的苯胺具有明顯的細胞毒性，這與賈莉等[8]的研究結(jié)果一致。進一步的細胞活力染色說明，在較高濃度的苯胺作用下，表達紅色熒光的死細胞逐漸增多，細胞膜的通透性變差，活力受到顯著影響。

研究表明，在正常的生理條件下，人體內(nèi)約有1%～5%的分子氧通過多種途徑產(chǎn)生氧自由基，但人體內(nèi)氧自由基的生成與清除處于動態(tài)平衡狀態(tài)。當某種原因?qū)е卵踝杂苫蛇^多或清除能力減弱時，體內(nèi)氧自由基就會增多[9]。過多的氧自由基通過損傷生物大分子、破壞細胞的結(jié)構(gòu)與功能，促使疾病的發(fā)生與發(fā)展[10]。Farias等[11]對苯胺衍生物進行了針對人乳腺癌細胞和雄性Ehrlich瘤小鼠的細胞毒性和抑瘤活性的評價。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，苯胺衍生物會導(dǎo)致細胞DNA損傷，促進DNA剪切酶活性，進而導(dǎo)致細胞凋亡發(fā)生，這與胞外ROS水平升高密切相關(guān)。以往有針對苯胺和氨基苯聯(lián)合細胞毒性的報道，且研究對象多為腫瘤細胞系，結(jié)果更偏向于硝基苯的增強細胞毒性[12-13]，然而并未明確苯胺化合物對正常細胞的細胞毒性作用，我們的研究結(jié)果顯示，單一苯胺化合物在濃度為0.1 μg·mL-1時24 h即可抑制正常細胞增殖，促進細胞凋亡，降低細胞活力等，進一步延長處理時間，細胞氧化應(yīng)激損傷加劇，胞外ROS含量顯著升高，胞外GSH含量顯著下降，表明細胞產(chǎn)生了不可逆的損傷。

此外，楊潔[14]研究了納米聚苯胺對巨噬細胞的細胞毒性，結(jié)果顯示0.1 μg·mL-1和1 μg·mL-1納米聚苯胺對巨噬細胞存活率無明顯影響，而10 μg·mL-1和100 μg·mL-1的納米聚苯胺顆粒均可使巨噬細胞活性氧水平升高和線粒體膜電位降低，進而導(dǎo)致巨噬細胞凋亡。Li等[15]研究了聚苯胺納米材料對大鼠腹腔巨噬細胞的體外細胞毒性，結(jié)果表明，當納米聚苯胺的濃度高于10 μg·mL-1時，會引起明顯的細胞損傷，巨噬細胞的膜結(jié)構(gòu)被破壞，胞外ROS水平升高，出現(xiàn)DNA損傷現(xiàn)象，同時Caspase-3蛋白的表達水平升高，說明細胞凋亡數(shù)量增多。與納米聚苯胺的細胞毒性結(jié)果相比，本研究結(jié)果中苯胺化合物的濃度閾值為0.1 μg·mL-1，遠小于納米聚苯胺的作用濃度，初步分析原因，可能與納米材料的特性有關(guān)，納米材料的小尺度特性可能在更高的濃度下才會對細胞產(chǎn)生細胞毒性作用，然而，相關(guān)的分子機制該需要進一步探討。