林丹通過MAPK和UPR通路與干擾線粒體功能誘導(dǎo)黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)腫瘤細胞遷移

沈佳穎，于振洋,*，尹大強，李文哲

1. 同濟大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200092 2. 上海污染控制與生態(tài)安全研究院，上海 200092 3. 同濟大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，上海 200092

環(huán)境污染物與癌癥發(fā)病率、死亡率之間的關(guān)聯(lián)，是環(huán)境健康領(lǐng)域的熱點問題。與環(huán)境污染物如何誘導(dǎo)癌癥發(fā)病的研究相比，環(huán)境污染物如何增加癌癥死亡率的研究尚需開展。近期研究表明，超過90%的癌癥致死是源于腫瘤細胞的侵襲與遷移[1]。因而，腫瘤細胞遷移能夠發(fā)揮指示癌癥死亡的關(guān)鍵作用[1]。因此，探索污染物能否誘發(fā)腫瘤細胞遷移，對于闡述污染物增加癌癥死亡率至關(guān)重要。

分子水平的研究表明，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路和未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)在細胞受胞外信號刺激后能被迅速激活，通過參與細胞生存、增殖、凋亡與血管生成等過程幫助細胞恢復(fù)穩(wěn)態(tài)的內(nèi)在調(diào)控機制[2-3]。MAPK信號通路(包含p38、JNK和MEKK等關(guān)鍵調(diào)控基因)中，p38下調(diào)能夠介導(dǎo)腫瘤細胞侵襲和遷移[4]。已有研究表明，具備致癌性的鎘能激活MAPK通路并促進腫瘤細胞遷移[5-7]。UPR通路(包含Ire1、ATF4和PERK等主要基因)，主要通過微環(huán)境中的未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)來抵抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ER stress)，為腫瘤細胞存活、侵襲和進一步遷移提供有利條件[8-9]。因此，MAPK、UPR信號通路中基因調(diào)控的變化，能夠為揭示污染物增加癌癥死亡率的潛在機制提供依據(jù)。

林丹(γ-六氯環(huán)己烷，γ-HCH)是一種曾被廣泛施用的有機氯農(nóng)藥(OCP)。因為林丹具有顯著的持久性與毒性，全球已大范圍禁用該農(nóng)藥，但環(huán)境介質(zhì)中仍能普遍檢出該農(nóng)藥[10]。因此，林丹的毒性效應(yīng)依然備受關(guān)注。大量研究顯示，林丹會對細胞存活率[11]、生殖系統(tǒng)[12]、神經(jīng)系統(tǒng)[13]等在內(nèi)的多種組織和器官造成負面效應(yīng)。這其中最為嚴峻的是積累于人體內(nèi)的林丹等物質(zhì)已被證實與癌癥致死密切相關(guān)[14-15]。截至目前，林丹能否誘導(dǎo)MAPK、UPR信號通路變化并誘發(fā)腫瘤細胞遷移尚需進一步研究提供直接證據(jù)。

黑腹果蠅是一種理想的模式生物，具有個體小、繁殖力強、生長周期短、易于飼養(yǎng)和操作等優(yōu)勢，廣泛用于遺傳學(xué)研究[16]。此外，黑腹果蠅已于2000年完成基因組全序列測序與標注，使其適宜于開展基因表達水平的檢測，為解釋環(huán)境污染物的毒性機制提供基礎(chǔ)。黑腹果蠅與哺乳動物在腫瘤信號通路上高度保守，約有75%的人類疾病基因能在果蠅體內(nèi)找到同源基因[16]?；贛APK和UPR通路的果蠅研究也表明，黑腹果蠅是解釋人類疾病發(fā)生機制的優(yōu)良載體[17-18]。

本研究將果蠅暴露于不同濃度的林丹中，進行實時聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)檢測其中關(guān)鍵基因的相對表達量，但2條通路并未有顯著激活。考慮到MAPK與UPR作為腫瘤發(fā)生過程中關(guān)鍵通路，本研究利用果蠅展開腫瘤遷移率的觀察統(tǒng)計，研究發(fā)現(xiàn)1 000 μg·L-1林丹暴露下的果蠅相較于對照組產(chǎn)生了明顯的遷移促進作用。為進一步了解林丹作用的潛在機制，我們對1 000 μg·L-1林丹暴露后和對照組的三齡幼蟲分別進行RNA測序。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)林丹對于果蠅腫瘤細胞遷移的促進作用，并從基因表達角度解釋了影響腫瘤細胞遷移的潛在機制。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗化合物

林丹(γ-HCH, C6H6Cl6, ≥ 97%, Sigma-Aldrich, USA)用二甲基亞砜(DMSO, 99%, Sigma-Aldrich)溶解后，通過含0.1% DMSO (V/V)的無菌水稀釋成10.0 mg·L-1的儲備液。儲備液用含0.1% DMSO的無菌水依次稀釋至1 000、10和0.1 μg·L-1，作為暴露液。所有溶液儲存于4 ℃。

1.2 果蠅培養(yǎng)

將黑腹果蠅培養(yǎng)于普通固體培養(yǎng)基中，放置于25 ℃、60%濕度的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，接受12 h光照和12 h黑暗交替，并每3～5 d將果蠅轉(zhuǎn)入新鮮培養(yǎng)基內(nèi)。

固體培養(yǎng)基[19]包含市售的紅糖、玉米粉、酵母、瓊脂(生物純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)和丙酸(分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)。配制1 L培養(yǎng)基需先量取1 L超純水待用。用超純水溶解135 g紅糖和7 g瓊脂粉混合物，在鍋內(nèi)煮沸溶液，而后加入溶解的85 g玉米粉，不斷攪拌直至再次燒開。待糊狀培養(yǎng)基冷卻至70 ℃左右時加入8 g酵母與4 mL丙酸，趁熱倒入玻璃管中，加塞，冷卻凝固備用。

1.3 暴露實驗與樣品保存

林丹暴露體系即在每10 g普通培養(yǎng)基未凝固前分別加入不同濃度的林丹暴露液200 μL，混合均勻。每一濃度的暴露體系及空白對照體系內(nèi)同時投放6只處女蠅與6只雄蠅進行雜交。同一濃度設(shè)置10組平行組。將各濃度組長至三齡幼蟲階段的樣品分管保存于1.5 mL離心管(Eppendorf)，液氮速凍后放入-80 ℃儲存，以備后續(xù)檢測。

表1 黑腹果蠅目標基因的引物模板序列Table 1 The template strand sequence for the primer pairs of the target genes in Drosophila melanogaster

1.4 基因表達定量分析

MAPK和UPR通路中的關(guān)鍵基因的表達量通過SYBR染料法進行熒光定量[20]。目標基因(包括管家基因GAPDH1)的引物序列見表1。利用RNAiso Plus Total RNA extraction reagent (Cat# 9109, TAKARA)并根據(jù)廠商的操作流程提取果蠅體內(nèi)的總RNA。總RNA經(jīng)RNAClean XP Kit (Cat A63987, Beckman Coulter, Inc. Kraemer Boulevard Brea, CA, USA)和RNase-Free DNase Set (Cat#79254, QIAGEN, GmBH, Germany)純化后備用。純化后的RNA通過ReverTra Ace qPCR Kit(TOYOBO)進行反轉(zhuǎn)錄，采用SYBR Green Master Mix進行染色后，利用7900 HT Sequence Detection System (ABI, USA)進行基因表達量的檢測。

1.5 RNA測序分析

果蠅樣本的RNA序列利用雙向RNA測序方法[21]進行測試。由1.4得到的RNA片段經(jīng)過一鏈cDNA合成、二鏈cDNA合成、末端補平、3’末端腺苷酸化、接頭連接、PCR擴增、文庫質(zhì)控等過程，按照cBot User Guide所示的流程，在Illumina測序儀配套的cBot上完成Cluster生成和第一向測序引物雜交，并上機測序。序列結(jié)果由Illumina提供的數(shù)據(jù)收集軟件實時分析。

利用Seqtk過濾原始測序數(shù)據(jù)，通過Hisat2 (version:2.0.4)的算法進行基因組映射。在轉(zhuǎn)錄組測序中，映射到基因區(qū)域的reads數(shù)目用以估計基因表達的水平，為使不同基因和樣本間的基因表達水平有可比性，將reads轉(zhuǎn)化為FPKM進行標準化。

得到的差異基因應(yīng)用edgeR進行差異分析，根據(jù)FPKM值計算差異表達倍數(shù)，即Fold-change，以P-value表達顯著性差異。差異表達倍數(shù)以log2形式表示。差異基因同時滿足P-value<0.05與 Fold-change≥2。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

目標基因的相對表達量采用2-ΔΔCt方法[22]計算，以相對于管家基因的相對表達量變化倍數(shù)表示。RNA測序分析利用差異變化倍數(shù)定量基因的相對表達量。在富集分析中，富集的基因功能與通路通過GO (Gene Ontology)與KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫進行查詢。腫瘤細胞遷移率以平均值±標準誤差的形式在圖中顯示。暴露組與對照組的樣本差異通過Origin Pro 8.5 (Origin Lab Corp., USA)進行方差分析(ANOVA)，當(dāng)P<0.05時，被認為具有樣本間的顯著性差異。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 MAPK和UPR通路參與林丹的毒性效應(yīng)調(diào)控

暴露于1 000 μg·L-1林丹體系與對照組的三齡幼蟲樣本目標基因的相對表達量借助RT-PCR方法測得，結(jié)果如圖1 (Fig. 1)所示。在19個目標基因中，其中7個基因呈現(xiàn)上調(diào)，12個呈現(xiàn)下調(diào)。結(jié)果顯示，林丹顯著下調(diào)了MAPK通路中MEKK、p38α基因(P<0.05)，也顯著下調(diào)了UPR通路中的ATF4、Ire1、PERK和XBP1基因(P<0.05)。

圖1 MAPK與UPR通路中相對表達量下調(diào)與上調(diào)的目的基因注：數(shù)據(jù)表達為平均值±標準誤差；相比于對照組有顯著性差異*** P<0.001，** P<0.01，* P<0.05。Fig. 1 Down- and up-regulations of relative expression of target genes in MAPK and UPR pathwayNote: Data was expressed as the mean ± standard deviation; compared with the control, *** P<0.001, ** P<0.01, * P<0.05.

MEK、MEKK、JNK和p38是MAPK通路中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，而MAPK通路已被證實與腫瘤生成、腫瘤細胞遷移密切相關(guān)。MEKK與p38α相對于對照組的顯著下調(diào)(P<0.05)，證實了MAPK通路參與了林丹的毒性效應(yīng)。下調(diào)的p38α不僅能夠抑制腫瘤細胞的凋亡能力，而且能夠調(diào)控腫瘤細胞遷移[23]?？偟膩碚f，活化的MAPK很可能通過削弱腫瘤細胞自噬與凋亡能力來調(diào)節(jié)腫瘤細胞遷移。

PERK、Ire1和ATF4作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激感應(yīng)子，被認為是UPR的重要標志物，也是腫瘤細胞生存與遷移的相關(guān)通路。環(huán)境污染物的研究表明，具備致癌性的狄氏劑[24]和三丁基錫[25]會通過上調(diào)UPR通路，誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。本研究中，林丹顯著下調(diào)PERK (P<0.05)和Ire1 (P<0.001)，同時抑制其下游基因XBP1 (P<0.01)和ATF4 (P<0.001) (圖1)的表達。這種不同的結(jié)果可能源于林丹與狄氏劑和三丁基錫具有不同的致毒機制，尚需進一步的研究。

2.2 林丹暴露促進腫瘤細胞遷移

林丹對MAPK與UPR通路基因表達的抑制效應(yīng)表明林丹具有促進腫瘤細胞遷移的能力。為驗證該推斷，本研究采用Rasv12/lgl-/-眼-觸角成蟲盤可視化腫瘤遷移品系[26]探索林丹對腫瘤細胞遷移的影響。經(jīng)綠色熒光蛋白(GFP)標記的致癌基因Rasv12眼部表達品系結(jié)合突變的lgl基因(lgl-/-)會攜帶大量原位增殖腫瘤組織，部分能夠產(chǎn)生遷移行為。絕大多數(shù)異位的腫瘤細胞會逐步占領(lǐng)腦腹神經(jīng)索(VNC)及其他遠端組織，如圖2所示(Fig.2)。在不同濃度林丹的暴露下，不僅腫瘤遷移率發(fā)生了顯著變化，如圖3所示(Fig.3)，同時遷移量也有所差異，如圖4所示(Fig.4)。相較于對照組的遷移率(45.9%)，林丹在0.1、10、1 000 μg·L-1暴露下對三齡幼蟲的腫瘤遷移率依次升高至48.6% (P>0.05)，60.2% (P<0.05)和69.2% (P<0.05)水平。1 000 μg·L-1林丹暴露水平的三齡幼蟲的腫瘤組織較對照組明顯體積增大，組織邊界模糊，遷移量更大(圖4)。該結(jié)果說明林丹的確表現(xiàn)出促進腫瘤細胞遷移的能力，并表現(xiàn)出明確的濃度依賴性。

圖2 Rasv12/lgl-/-可視化腫瘤遷移品系示意圖Fig. 2 Visible tumor migration stain of Rasv12/lgl-/-

圖3 不同濃度林丹暴露組與對照組間果蠅腫瘤細胞遷移率注：遷移率以平均值±標準誤差的方式表達，** 相比于對照組具有顯著性差異(P<0.01)。Fig. 3 Comparison of tumor cell migration rate in D. melanogaster between different concentrations of lindane and the control (0.1%DMSO)Note: Migration rate were expressed as the mean ± standard deviation; **, significantly different from the control (P<0.01).

圖4 腫瘤遷移示意圖注：(a-c)依次為無腫瘤幼蟲個體、產(chǎn)生腫瘤但未遷移幼蟲個體及產(chǎn)生遷移的幼蟲；(d-f)依次為未發(fā)生遷移(腦腹神經(jīng)索(VNC)上未出現(xiàn)綠色熒光、白色箭頭所示區(qū)域)的組織、發(fā)生部分遷移的組織(白色箭頭所示區(qū)域)及嚴重遷移的組織(白色箭頭所示區(qū)域)；(g-i)依次為未產(chǎn)生腫瘤細胞的VNC、局部出現(xiàn)腫瘤的VNC及大面積出現(xiàn)腫瘤的VNC。Fig. 4 Migration of tumor cells under fluorescence microscopeNote: (a-c), the larvae without tumor/with tumor but not migrate/with metastatic tumor, respectively. (d-f), the tumor tissues without migration/with slight migration/with significant migration to VNC (white arrow area), respectively. (g-i), the VNC without tumor cells/tumor cells partly located in the VNC/tumor cells located in large area of the VNC.

結(jié)果顯示，高濃度林丹暴露會顯著促進腫瘤細胞的遷移。腫瘤細胞遷移作為區(qū)分良性與惡性腫瘤的一項重要標志，同時也是癌癥致死的主要原因[1]。早期的研究發(fā)現(xiàn)，林丹能夠誘導(dǎo)大鼠與小鼠腎臟、肝臟和卵巢腫瘤的發(fā)生[27]。但該效應(yīng)受到來自小鼠肝臟體內(nèi)和體外實驗的懷疑[28]。甚至有林丹與癌癥的研究得到了相反的結(jié)論，即較高濃度林丹(100 mg·L-1)甚至能降低腫瘤發(fā)病率[29]。這些互相沖突的結(jié)論無法明確林丹對癌癥及其致死性的貢獻水平，降低了人們對林丹健康風(fēng)險的戒防。本研究中，林丹誘導(dǎo)腫瘤細胞遷移能力的結(jié)果表明了林丹可以增加惡性腫瘤的發(fā)生率及致死率。與此值得注意的是，苯并[a]芘[30]、六氯苯[31]、雙酚A和四氯二苯并二惡英[32]等致癌性較為明確的環(huán)境污染物也能夠誘導(dǎo)腫瘤細胞遷移。也就是說，無論林丹是否在腫瘤發(fā)生初期就存在誘導(dǎo)效應(yīng)，其健康風(fēng)險都應(yīng)受到更系統(tǒng)的關(guān)注。

2.3 林丹暴露對差異基因的影響

為進一步探究林丹對腫瘤細胞遷移的作用機制，本研究對暴露于1 000 μg·L-1林丹體系與對照組的三齡幼蟲樣本進行了RNA測序分析，基因的表達量以變化倍數(shù)值(log2-fold)表示。林丹的暴露造成了380個基因表達量變化超過1.5倍(P<0.05)，包含169個上調(diào)基因和211個下調(diào)基因(數(shù)據(jù)未顯示)。

上調(diào)基因所調(diào)控的生理功能主要涵蓋水解酶活性(22個基因，平均表達量變化1.95倍)、神經(jīng)系統(tǒng)過程(15個基因，平均表達量變化2.69倍)、細胞分化(11個基因，平均表達量變化3.07倍)、含磷酸鹽化合物代謝(9個基因，平均表達量變化1.93倍)、應(yīng)激(特別是對化學(xué)刺激感知的6個基因，平均表達量變化3.49倍)和細胞邊界(7個基因，平均表達量變化2.12倍)。上調(diào)組中表達量變化最大的典型基因如表2(Table 2)所示。

下調(diào)基因組的相應(yīng)功能主要包含對熱和缺氧的應(yīng)激(28個基因，平均表達量變化2.83倍)、水解酶活性(20個基因，平均表達量變化2.30倍)、細胞分化(7個基因，平均表達量變化2.42倍)、含磷酸鹽物質(zhì)代謝(6個基因，平均表達量變化3.95倍)、線粒體呼吸鏈(5個基因，平均表達量變化3.07倍)、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育(5個基因，平均表達量變化2.81倍)和細胞邊界(4個基因，平均表達量變化2.85倍)。下調(diào)基因所涉及的基因功能與上調(diào)組有所不同。在下調(diào)基因中，線粒體細胞色素c氧化酶亞基II (mt:CoII)在林丹暴露后未能檢測到(表2)。

表2 林丹暴露下的幼蟲體內(nèi)典型差異基因信息Table 2 Typical differential gene information in lindane-exposed larvae

注：aInf表示未檢出。

Note：aInf, not detected; FC stands for fold changes.

篩選得到的典型差異基因，絕大多數(shù)參與調(diào)控蛋白編碼，在生物過程中多方面地發(fā)揮效應(yīng)。一方面，這些基因能夠改變線粒體功能，對腫瘤的遷移提供必要條件。研究顯示，上調(diào)的Obp99b基因很可能造成線粒體功能障礙，從而為腫瘤細胞遷移提供有利的先決條件[33]。與此同時，表達量下調(diào)最大的mt:CoII基因能調(diào)控細胞色素c氧化酶活性、線粒體呼吸鏈、氧化磷酸化和跨膜轉(zhuǎn)運體活性[34]。低表達量的mt:CoII被認為是結(jié)腸癌的標志物[35]。mt:CoII表達水平低至無法檢出，打破了腫瘤生成中線粒體功能和細胞凋亡的穩(wěn)定性，以此破壞細胞器功能完整性，形成惡性循環(huán)[36]。由此可見，林丹對腫瘤細胞遷移的刺激作用極有可能是通過線粒體功能障礙實現(xiàn)的。

另一方面，差異基因能改變果蠅的生長發(fā)育與節(jié)律，這既是癌癥對個體帶來的影響，反過來同樣也能影響癌癥進程[37]。Obp99家族是果蠅嗅覺系統(tǒng)最先感知化學(xué)刺激的基因，對果蠅的生殖與生存極為重要[38]。此外，Obp99b也具有調(diào)節(jié)壽命的作用[39]。而Gyc-89Da在神經(jīng)突觸傳遞中的表達是幼蟲與成蟲蛻皮的必要條件[40]?？梢酝茰y，林丹的神經(jīng)毒性，抑制了Gyc-89Da的表達從而阻斷了果蠅生長的中間環(huán)節(jié)。果蠅生長發(fā)育與節(jié)律在腫瘤遷移過程中的變化及其對腫瘤遷移的影響將在后期研究中進一步探究。

測序結(jié)果也顯示HSP70Aa和HSP70Ab這2個熱休克蛋白調(diào)控基因顯著下調(diào)，其對應(yīng)的表達量變化分別為3.30和3.27倍(P<0.001)。先前的研究認為，激活的HSP70能促進肝癌細胞的遷移[41]，與本研究的結(jié)果相反。這種不一致尚需進一步研究。

表3 差異基因分類、對應(yīng)的GO條目與富集因子Table 3 Differential genes' classification, corresponding GO term and enrichment factors

續(xù)表3GO功能IDGO_IDGO條目GO_term上調(diào)基因數(shù)Up-regulationnumber下調(diào)基因數(shù)Down-regulationnumber富集因子EnrichmentfactorP值P value分子功能MF(molecular function)GO:0003824catalytic activity1841271.243.32E-04GO:0016787hydrolase activity85821.474.96E-06GO:0008233peptidase activity29401.846.43E-06GO:0005215transporter activity38311.284.70E-02GO:0022857transmembrane transporter activity35291.371.57E-02GO:0022891substrate-specific transmembrane transporter activity33241.421.25E-02GO:0046914transition metal ion binding38151.028.08E-01GO:0004175endopeptidase activity21311.894.30E-05GO:0008236serine-type peptidase activity14312.405.06E-07GO:0017171serine hydrolase activity14312.385.96E-07GO:0016491oxidoreductase activity26171.134.03E-01GO:0004252serine-type endopeptidase activity14282.448.07E-07GO:0016818hydrolase activity, acting on acid anhydrides, in phosphorus-containing anhydrides24121.038.00E-01GO:0016817hydrolase activity, acting on acid anhydrides24121.028.16E-01GO:0016788hydrolase activity, acting on ester bonds20141.241.95E-01GO:0008324cation transmembrane transporter activity15141.212.82E-01GO:0016887ATPase activity16101.203.13E-01GO:0042623ATPase activity, coupled1481.174.01E-01GO:0016746transferase activity, transferring acyl groups1451.633.95E-02GO:0042578phosphoric ester hydrolase activity1181.546.34E-02GO:0015077monovalent inorganic cation transmembrane transporter activity1181.233.18E-01GO:0016747transferase activity, transferring acyl groups other than amino-acyl groups1351.742.59E-02GO:0016791phosphatase activity1161.634.97E-02GO:0008509anion transmembrane transporter activity1161.605.97E-02GO:0008061chitin binding792.431.66E-03GO:0008237metallopeptidase activity1061.743.39E-02GO:0004553hydrolase activity, hydrolyzing O-glycosyl compounds692.462.00E-03GO:0016798hydrolase activity, acting on glycosyl bonds692.303.73E-03

注：GO為基因本體。

Note： GO stands for Gene Ontology.

圖5 林丹暴露下差異基因的KEGG通路分析Fig. 5 KEGG pathway analysis based on differential genes at lindane exposure

2.4 林丹誘導(dǎo)的差異基因富集分析

通過測序篩選出的差異基因借助GO數(shù)據(jù)庫進行富集分析。差異基因被歸類為生物過程(BP)、細胞成分(CC)和分子功能(MF)。差異基因的分類及其對應(yīng)的GO條目和富集因子如表3(Table 3)所示。在BP、CC、MF三個分類中，超過15個差異基因的對應(yīng)GO條目數(shù)分別為23、6和28個。

在BP分類中，不同的GO條目的富集因子從1.09到2.83不等，均值為1.59。其中具有顯著性差異的條目主要涉及蛋白質(zhì)水解過程(83個基因，平均表達量變化1.59倍)、跨膜轉(zhuǎn)運(43個基因，平均表達量變化1.54倍)和免疫反應(yīng)(20個基因，平均表達量變化2.53倍)。這其中蛋白質(zhì)水解包含最多的差異基因數(shù)，其富集因子為1.59 (P<0.001)。圖1(Fig.1)中顯著上調(diào)的tobi基因(2.56-fold，P<0.001)能夠參與調(diào)控糖基水解酶活性[42]，也證實了胞內(nèi)水解過程在林丹暴露下發(fā)生了明顯變化。此外，也有研究指出，胞外基質(zhì)(ECM)中蛋白質(zhì)水解通過改變腫瘤細胞微環(huán)境，積極地促進BP過程中腫瘤生長與遷移[43]。簡單地說，水解酶(包括蛋白水解酶)調(diào)控ECM和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)，從而激活血管生成、腫瘤生長、侵襲與遷移[44]。研究表明，蛋白水解酶(如SIAH2)會經(jīng)由ERBB/RAS通路影響著人類腫瘤細胞焦點粘連、細胞連接和運動能力[45]。另外，線粒體基質(zhì)、線粒體膜中的蛋白質(zhì)水解可能引發(fā)線粒體應(yīng)激以維持腫瘤細胞的存活[46]。已有的研究和當(dāng)前的結(jié)果均指向蛋白酶是調(diào)控林丹誘導(dǎo)的腫瘤細胞遷移的原因之一。蛋白酶催化下細胞間粘連與通訊的變化是腫瘤細胞離開原灶侵襲基膜的重要環(huán)節(jié)[1]。本研究中發(fā)現(xiàn)的上調(diào)的tal-3A即能加速上皮細胞形態(tài)變化(表2)。同時，差異基因中也顯示細胞邊界的異常變化受到7個上調(diào)基因和4個下調(diào)基因的控制(數(shù)據(jù)未顯示)。但這一環(huán)節(jié)仍需進一步驗證。在BP分類中，線粒體轉(zhuǎn)運過程表現(xiàn)出最大富集因子(2.83,P<0.001) (表3)。線粒體轉(zhuǎn)運是細胞能量供應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，為腫瘤細胞的生長和增殖提供必不可少的基礎(chǔ)[47]。林丹被發(fā)現(xiàn)作為一種代謝干擾物，能通過調(diào)節(jié)線粒體增加胞內(nèi)ATP水平[11]。同時，圖1(Fig.1)中受林丹影響而表現(xiàn)上調(diào)的tobi基因也被證明能促進碳水化合物代謝來為腫瘤細胞供能[42]。上述結(jié)果所反映的高能量供給與代謝為腫瘤細胞的增殖與形成帶來優(yōu)勢[48]。換言之，線粒體轉(zhuǎn)運過程和代謝的變化或許是林丹刺激腫瘤細胞遷移的原因之一。

在CC分類中，富集因子變化從1.35到1.88，平均值為1.60(表3)。在此條目中，線粒體膜具有最大富集因子為1.88。而胞外區(qū)域包含最多差異基因數(shù)(84)。結(jié)果表明，線粒體膜與胞外區(qū)域均發(fā)生了顯著變化(P<0.01)。一方面，線粒體膜可以通過調(diào)節(jié)ATP、活性氧生成和胞內(nèi)鈣信號通路來參與腫瘤細胞遷移[49]。另一方面，包含ECM在內(nèi)的胞外區(qū)域被認為是能量代謝與癌癥進展的重要位點[50]。總的來說，林丹的暴露改變了細胞成分，導(dǎo)致了腫瘤微環(huán)境的改變。

在MF分類中，不同GO條目的富集因子分布范圍為1.02到2.46，均值為1.61(表3)。其中“催化活性”涉及最多差異基因(311)，包括水解酶(P<0.01)、蛋白酶(P<0.001)、轉(zhuǎn)移酶(P<0.05)和磷酸酶(P<0.05)。糖基水解酶活性是其中富集因子最大的條目，其富集因子為2.46(表3)。早期研究表明，林丹等物質(zhì)能增加淡水魚糖酵解反應(yīng)速率[51]，與本研究的結(jié)果相一致。其他高富集程度的水解酶(如UCH-L3[52]和UCH37[53])也被報道在腫瘤細胞遷移中起到關(guān)鍵作用。富集因子為1.74的轉(zhuǎn)移酶(表3)，如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶，也與癌癥轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[54]。此外，富集因子為1.63的磷酸酶(如MAPK phosphatase-5)同樣被當(dāng)作多環(huán)芳烴介導(dǎo)的腫瘤細胞遷移過程中的重要角色[55]。這些高富集的酶活性加強了能量代謝并促進了腫瘤細胞遷移[56]，與本研究所觀察到的遷移結(jié)果一致。

2.5 林丹誘導(dǎo)的差異基因通路分析

為進一步探究林丹暴露對通路的影響，利用KEGG數(shù)據(jù)庫對差異基因進行分析。部分具有顯著性差異的通路(P<0.05)包含：代謝(糖代謝、丙酮酸代謝)通路、氧化磷酸化、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白反應(yīng)等，如圖5(Fig.5)所示。代謝通路包含80個差異基因，是所有通路中效應(yīng)最為顯著的通路之一。

癌癥不僅是一種基因表達缺陷型疾病，也是一種代謝疾病[57]。腫瘤細胞的惡性轉(zhuǎn)化常常伴隨代謝紊亂，表現(xiàn)出代謝性依賴性[58]。代謝通路中包含24個參與碳水化合物代謝相關(guān)基因(數(shù)據(jù)未展示在圖中)，直接改變了細胞能量代謝。而丙酮酸作為糖酵解和三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，同樣在細胞供能上發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。此外，能量代謝增加了細胞中的酸性物質(zhì)，導(dǎo)致細胞外基質(zhì)的降解，從而增強了腫瘤細胞的侵襲性[59]?？偟膩碚f，林丹暴露顯著影響了細胞代謝相關(guān)通路，尤其在能量代謝中發(fā)揮了主要作用。代謝通路對腫瘤細胞遷移的分子機制仍有待后續(xù)研究。

綜上，林丹的毒性效應(yīng)涉及MAPK和UPR通路的參與，并顯著增加了果蠅腫瘤細胞遷移率。通過RNA測序發(fā)現(xiàn)，線粒體功能障礙、胞外區(qū)域成分變化和蛋白水解過程的活化為腫瘤細胞的遷移提供了能量基礎(chǔ)，削弱了粘連束縛，大大提高腫瘤細胞運動遷移能力。故而，林丹環(huán)境殘留的健康風(fēng)險需要持續(xù)關(guān)注。進一步研究亟需闡述MAPK和UPR通路下調(diào)原因、線粒體參與機制，以及細胞代謝、細胞通訊與果蠅生長發(fā)育等癌癥相關(guān)環(huán)節(jié)，從而進一步揭示林丹等污染物促進癌癥致死性的原因。

致謝：感謝國家水體污染控制與治理科技重大專項(2017ZX07201004)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金(22120180549)；國家重點研發(fā)計劃政府間國際科技創(chuàng)新合作重點專項(2016YFE0123700)；上海市科學(xué)技術(shù)委員會青年項目(STCSM No. 17ZR1432500)等項目對本研究的支持。