不同處理方式的大曲真菌群落差異分析

夏 玙，羅惠波,2,*，周 平，黃 丹，鄧 波，沈才萍，鄔捷峰

（1.四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院，四川 自貢 643000；

2.釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 自貢 643000；3.勁牌有限公司，湖北 大冶 435100；4.瀘州老窖股份有限公司 國(guó)家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川 瀘州 646000）

作為白酒釀造的糖化發(fā)酵劑，大曲與白酒風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生、風(fēng)格的形成及質(zhì)量的變化密切相關(guān)[1]。由于其開(kāi)放式的制作方式，大曲中的微生物類(lèi)群十分豐富，包括霉菌、細(xì)菌及酵母菌等，這些微生物能夠產(chǎn)生各種酶和風(fēng)味物質(zhì)，因此，微生物群落是決定大曲品質(zhì)的核心因素之一[2-3]。大曲中數(shù)量巨大的微生物類(lèi)群的準(zhǔn)確描述和定義、功能菌的精準(zhǔn)定位、微生物與白酒釀造調(diào)控技術(shù)等研究一直是白酒釀造領(lǐng)域的重大理論和技術(shù)問(wèn)題[4-5]。在此前研究中，業(yè)內(nèi)學(xué)者將分子生物學(xué)的研究融合到中國(guó)大曲微生物群落構(gòu)成的探索性研究中，并取得了一定的成果。徐占成等[6]采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性凝膠梯度電泳技術(shù)研究中溫大曲真菌群落結(jié)構(gòu)及其多樣性。羅惠波等[7]利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）-單鏈構(gòu)象多態(tài)技術(shù)研究濃香型大曲，發(fā)現(xiàn)在大曲發(fā)酵過(guò)程中可能是受溫度變化的影響，真核微生物群落多樣性呈先升高后降低，然后又升高并且基本保持穩(wěn)定的特征?？梢?jiàn)大曲真菌類(lèi)群的變化因不同的發(fā)酵階段、工藝呈不同的特點(diǎn)。

大曲在培菌的過(guò)程中，特別是在降溫排潮期和貯存期，常會(huì)遭受曲蟲(chóng)的侵害[8-9]。本課題組建立外源加熱的大曲熱風(fēng)干燥工藝，在有助排濕的同時(shí)又能有效地殺滅曲蟲(chóng)。而大曲在生產(chǎn)應(yīng)用中往往要經(jīng)過(guò)3～6個(gè)月貯存成為陳曲，一般地，在曲庫(kù)內(nèi)進(jìn)行貯存也未免于曲蟲(chóng)的侵害。因此，另尋大曲貯存環(huán)境也是大曲制作的關(guān)注點(diǎn)，若在沒(méi)有曲蟲(chóng)存在的自然條件下貯存可行，則可設(shè)置特定環(huán)境進(jìn)行貯存。

為探究外源熱風(fēng)干燥對(duì)大曲在貯存期帶來(lái)的相關(guān)影響，本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)排潮降溫期大曲進(jìn)行熱風(fēng)、自然干燥處理后，對(duì)比實(shí)驗(yàn)室貯存、曲庫(kù)貯存以及自然干燥后曲庫(kù)貯存不同處理方式下大曲的真菌微生物群落差異，以期為進(jìn)一步優(yōu)化大曲干燥工藝提供技術(shù)依據(jù)，為指導(dǎo)大曲熱風(fēng)干燥工業(yè)化應(yīng)用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大曲采集于四川瀘州市懷玉制曲生態(tài)園，于秋季10月采樣，環(huán)境溫度21 ℃。

蛋白酶K、溶菌酶、十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS） 美國(guó)Sigma公司；P7589熒光定量染料 美國(guó)Invitrogen公司；AceQ?qPCR SYBR?Green Master Mix Q112-02 南京諾唯贊生物科技有限公司；RNA、DNA檢測(cè)試劑 美國(guó)Agilent公司；MiSeq測(cè)序試劑盒 美國(guó)Illumina公司。

1.2 儀器及設(shè)備

84Y-3型風(fēng)速可控干燥箱 和成儀器儀表（昆山）有限公司；PICO 17臺(tái)式高速離心機(jī)、ABI2700 PCR儀、ABI Step-One Plus實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng) 上海派森諾生物科技有限公司；Tanon 2500凝膠成像系統(tǒng) 上海天能科技有限公司；TGL-16臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；DYY-6C型電泳儀 北京六一儀器廠(chǎng)；2720型PCR擴(kuò)增儀 美國(guó)ABI公司；Illumina MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái) 美國(guó)Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集及處理

取培菌第8天排潮降溫期的大曲進(jìn)行最佳熱風(fēng)干燥處理，同時(shí)與同一曲庫(kù)、同一存放地點(diǎn)的自然干燥大曲進(jìn)行對(duì)比。熱風(fēng)干燥分兩階段進(jìn)行，第1階段溫度為48 ℃，轉(zhuǎn)換點(diǎn)含水率為15.5%，第2階段溫度為45 ℃。自然干燥環(huán)境與曲房溫度一致，自熱排潮降溫。

曲庫(kù)中曲蟲(chóng)滋生較多，與實(shí)驗(yàn)室貯存（幾乎無(wú)曲蟲(chóng)）作對(duì)比。在實(shí)驗(yàn)室貯存和曲庫(kù)中貯存均在自然溫度下進(jìn)行的，溫度與環(huán)境溫度一致。將進(jìn)行熱風(fēng)干燥處理后的大曲分成2 批：一批大曲在熱風(fēng)干燥處理后直接在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行貯存，另一批大曲熱風(fēng)干燥后放回曲庫(kù)中繼續(xù)貯存。研究這3 種處理方式和3 種貯存方式的大曲在干燥前后、貯存1 個(gè)月、貯存2 個(gè)月時(shí)的差異。將干燥前的大曲批次（原曲）標(biāo)記為RG1，將進(jìn)行熱風(fēng)干燥處理后的大曲批次標(biāo)記為FK1，將在曲庫(kù)進(jìn)行自然干燥的大曲批次（與熱風(fēng)干燥同時(shí)間的大曲）標(biāo)記為ZR1；將熱風(fēng)干燥處理的大曲FK1直接在實(shí)驗(yàn)室條件下貯存1、2 個(gè)月后的大曲批次分別標(biāo)記為RG2、RG3，將熱風(fēng)干燥處理的大曲FK1在曲庫(kù)貯存1、2 個(gè)月后的大曲批次分別標(biāo)記為FK2、FK3；將大曲ZR1直接在曲庫(kù)貯存1、2 個(gè)月后的大曲批次分別標(biāo)記為ZR2、ZR3。曲樣均于-20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系及程序

引物：18s_F（5’-ACTCAACACGGGAAAACTC-3’）和18s_R（5’-CGGAATGAACCAGACAAATC-3’），由上海派森諾生物科技股份有限公司提供。每個(gè)樣品設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，采用20 孔，體系：0.4 μL PCR特異引物F（10 μmol/L）、0.4 μL PCR特異引物R（10 μmol/L），10 μL 2×SYBR real-time PCR premixture，1 μL DNA模板，加水至總體積20 μL。反應(yīng)程序：95 ℃、5 min，95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，共40 個(gè)循環(huán)。10 倍梯度稀釋為模板制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.3.3 目標(biāo)片段PCR擴(kuò)增及高通量測(cè)序

大曲總D N A提取采用改良的C T A B法，借助酶、反復(fù)凍融、酚-氯仿-異戊醇（體積比25∶24∶1）抽提等操作，形成復(fù)合優(yōu)化的手提方法提取大曲中微生物的總DNA[10]。用引物ITS1F（5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’）和2043R（5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’）[11]擴(kuò)增真菌的ITS1序列。PCR體系（25 μL）包括以下試劑：5 μL 5×reaction buffer，5 μL 5×GC buffer，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，1 μL Forward Primer（10 μmol/L），1 μL Reverse Primer（10 μmol/L），2 μL Template DNA，0.25 μL Q5 DNA Polymerase和8.75 μL ddH2O。PCR條件：1）98 ℃預(yù)變性2 min；2）98 ℃變性15 s，55 s退火30 s，72 s延伸30 s，29 個(gè)循環(huán)；3）72 ℃延伸5 min，10 ℃到取出為止。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行切膠回收。

基因文庫(kù)測(cè)序由上海派森諾生物科技股份有限公司提供服務(wù)，用Illumina MiSeq平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3.4 微生物信息分析

對(duì)有效序列的質(zhì)量作進(jìn)一步的評(píng)估，用于后續(xù)分析的序列[12]。將相似性大于97%的序列聚類(lèi)成一個(gè)操作分類(lèi)單元（operational taxonomic unit，OTU）[13]，并進(jìn)行物種注釋。與NCBI的GenBank進(jìn)行BLAST比對(duì)，確定真菌序列的分類(lèi)信息，獲得門(mén)和屬水平下的種類(lèi)及相對(duì)豐度[14]。

稀疏曲線(xiàn)可評(píng)判當(dāng)前測(cè)序深度是否足以反映該群落樣本所包含的微生物多樣性[15]。Alpha多樣性用Chao1、ACE、Shannon和Simpson指數(shù)計(jì)算，以評(píng)價(jià)大曲曲樣中真菌群落的生物多樣性。Beta多樣性分析，采用主成分分析（principal component analysis，PCA）方法，通過(guò)線(xiàn)性變換，將原始的高維數(shù)據(jù)降維、簡(jiǎn)化結(jié)構(gòu)，從而量化樣本間的差異和相似度，從中發(fā)現(xiàn)不同樣品或樣品組間的差異[16]。

1.4 數(shù)據(jù)處理及圖像處理

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用Origin、Excel作圖，SPSS 20進(jìn)行方差分析，多重比較采用Duncans新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性的分析，以P＜0.05為差異顯著。GraPhlAn軟件構(gòu)建大曲樣本總體分類(lèi)等級(jí)樹(shù)，R軟件作生物組成熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果分析

以4.287×108copies/μL為起始濃度，設(shè)置5 組10 倍稀釋濃度的標(biāo)品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為：Y＝-3.144 3X+45.654，R2＝0.997 3，擴(kuò)增效率為107.992%，表明不同稀釋梯度定量模板的對(duì)數(shù)值和Ct值之間呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)能夠準(zhǔn)確地反映目的產(chǎn)物的擴(kuò)增，且由樣品的Ct值就可算出樣品中的真菌數(shù)量。

依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算每克大曲樣品中真菌18S rRNA基因拷貝數(shù)。如圖1所示，不同處理方式大曲中的真菌18S rRNA基因拷貝數(shù)在1×1011～4.5×1011copies/g之間；ZR3拷貝數(shù)最大為4.5×1011copies/g。

圖1 不同處理方式大曲中真菌18S rRNA基因拷貝數(shù)Fig. 1 Number 18S rRNA gene copies of fungal communities in different samples

2.2 不同處理的大曲真菌Alpha多樣性

為獲取更多大曲真菌群落多樣性信息，利用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)真菌ITS1進(jìn)行擴(kuò)增和序列比對(duì)后進(jìn)行種群多樣性分析和結(jié)構(gòu)組成。經(jīng)質(zhì)量篩選后，9 個(gè)大曲樣本真菌有效序列數(shù)總計(jì)有1 077 323 條，滿(mǎn)足基本分析要求，可用于進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析。

圖2 大曲樣品真菌稀釋曲線(xiàn)Fig. 2 Rarefaction curves of fungal communities in Daqu samples

根據(jù)序列數(shù)及其代表的OTU數(shù)繪制樣品多樣性稀釋曲線(xiàn)，由圖2可以看出，隨著樣品序列數(shù)的增加，可觀測(cè)物種數(shù)逐漸趨于平緩，Shannon指數(shù)值也逐漸趨于飽和，這表明測(cè)序深度合理，測(cè)序結(jié)果已足夠反映當(dāng)前大曲樣本絕大多數(shù)真菌微生物的物種信息。

不同處理方式大曲樣本的真菌群類(lèi)多樣性結(jié)果見(jiàn)表1。97%水平下共得到OTU數(shù)為844，每個(gè)大曲樣品的OTU數(shù)都在80以上。分析被注釋到不同分類(lèi)水平的真菌類(lèi)群發(fā)現(xiàn)，大曲RG3的Chao1豐富度指數(shù)較高，Shannon和Simpson多樣性指數(shù)分析表明大曲RG2、RG3、ZR3的微生物多樣性較高。從工藝處理角度通過(guò)動(dòng)態(tài)比較分析大曲的多樣性指數(shù)發(fā)現(xiàn)，相比RG1，不論是通過(guò)熱風(fēng)干燥工藝還是自然干燥工藝對(duì)大曲進(jìn)行處理后，大曲FK1與ZR1中真菌的豐富度指數(shù)均有所下降。通過(guò)比較ZR1、ZR2、ZR3的OTU、Chao1豐富度指數(shù)，發(fā)現(xiàn)呈先下降后上升的趨勢(shì)；而進(jìn)行熱風(fēng)干燥后的大曲，相比FK1，進(jìn)行曲庫(kù)貯存后的大曲FK2、FK3的多樣性指數(shù)均有呈先下降后上升的趨勢(shì)；進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室貯存后的大曲RG2、RG3的多樣性指數(shù)均有上升的趨勢(shì)，且比其他處理大曲的多樣性高。因此，熱風(fēng)干燥工藝對(duì)實(shí)驗(yàn)室貯存期大曲的真菌群落多樣性有一定促進(jìn)影響。

表1 不同處理方式大曲真菌多樣性指數(shù)Table 1 Diversity index of fungal communities from Daqu samples

2.3 不同處理大曲的群落組成結(jié)構(gòu)

圖3 大曲樣品中真菌在門(mén)分級(jí)水平上的種類(lèi)和相對(duì)豐度Fig. 3 Relative abundance of fungal communities at phylum level

根據(jù)物種注釋結(jié)果，選取大曲在門(mén)分類(lèi)水平上最大豐度排名靠前的物種，生成物種相對(duì)豐度柱形累加圖，便于直觀查看不同處理方式的大曲相對(duì)豐度較高的物種及其比例。由圖3可見(jiàn)，在門(mén)的分級(jí)水平上，所有大曲中共檢測(cè)出了子囊菌門(mén)（Ascomycota）和接合菌門(mén)（Zygomycota）2大門(mén)類(lèi)，其相對(duì)豐度較高，占到相應(yīng)樣品總類(lèi)群的99.9%以上，且在各處理后大曲中的含量不盡相同。子囊菌門(mén)在FK1和ZR1的豐度分別比RG1多11.2%、7.2%，說(shuō)明在大曲干燥的過(guò)程子囊菌門(mén)的比例逐漸增加；大曲在貯存1、2個(gè)月后，子囊菌門(mén)類(lèi)比例大小為ZR2＞FK2＞RG2和ZR3＞RG3＞FK3，可見(jiàn)在貯存期，自然干燥大曲有利于子囊菌門(mén)類(lèi)生長(zhǎng)，而熱風(fēng)干燥對(duì)其成長(zhǎng)和繁殖存在阻礙作用。從大曲中接合菌門(mén)類(lèi)相對(duì)豐度來(lái)看，接合菌門(mén)比例大小是RG1＞ZR1＞FK1，說(shuō)明大曲干燥的過(guò)程接合菌門(mén)所占比例在逐漸較少，而熱風(fēng)干燥對(duì)其比例減少的可能性更大；大曲在貯存1、2個(gè)月后，接合菌門(mén)類(lèi)在RG2和FK2中的相對(duì)豐度比ZR2大，在RG3和FK3中的豐度比ZR3的豐度大，說(shuō)明熱風(fēng)干燥的大曲在貯存時(shí)期有利于接合菌門(mén)微生物的生長(zhǎng)和繁殖。

構(gòu)建基于GraPhlAn的大曲樣本總體分類(lèi)等級(jí)樹(shù)，從復(fù)雜的群落數(shù)據(jù)中，快速發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)微生物類(lèi)群[17]。如圖4所示為從門(mén)到屬（從外圈到內(nèi)圈依次排列）所有分類(lèi)單元（以節(jié)點(diǎn)表示）的等級(jí)關(guān)系，節(jié)點(diǎn)大小對(duì)應(yīng)于該分類(lèi)單元的平均相對(duì)豐度。

圖4 基于GraPhlAn的大曲樣本總體分類(lèi)等級(jí)樹(shù)圖Fig. 4 Overall classification based on GraPhlAn of Daqu samples

結(jié)果顯示：所有大曲樣品里，真菌微生物屬水平上有4 種相對(duì)高豐度的微生物，平均相對(duì)豐度最高的是嗜熱子囊菌屬（Thermoascus），其次是根毛霉屬（Rhizomucor）、曲霉菌屬（Aspergillus），相對(duì)較低的是假絲酵母屬（Candida）。

圖5 大曲樣品中真菌在屬分級(jí)水平上的種類(lèi)和相對(duì)豐度Fig. 5 Relative abundance of fungal communities at genus level

如圖5所示，在屬的分級(jí)水平上，共檢測(cè)到19 種真菌類(lèi)群，優(yōu)勢(shì)類(lèi)群包括有：嗜熱子囊菌屬、嗜熱霉菌屬（Thermomyces）、根毛霉屬、曲霉菌屬、假絲酵母屬，其相對(duì)豐度占全部真菌群落的92.3%以上，其中最優(yōu)勢(shì)菌屬是嗜熱子囊菌屬，約占40.2%。

至今，嗜熱子囊菌相關(guān)研究已較成熟。它能產(chǎn)生具有高熱穩(wěn)定性和活力的纖維素酶、蛋白酶等，特別是其所產(chǎn)的過(guò)氧化氫酶是迄今為止已報(bào)道過(guò)的熱、堿穩(wěn)定性最好的[18]。張婕等[19]從嗜熱子囊菌原變種中克隆了一個(gè)幾丁質(zhì)酶同源基因，并在畢赤酵母中得到高效表達(dá)。嗜熱子囊菌能降解糖類(lèi)和蛋白質(zhì)等并具有良好的熱穩(wěn)定性，有利于大曲產(chǎn)酒生香作用[20]。結(jié)果分析顯示嗜熱子囊菌屬在大曲RG2、RG3中的相對(duì)豐度為31.2%、23.9%，相比于FK2和FK3，同比低了13.6%、20.5%，相對(duì)豐度下降明顯，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)室貯存條件相比曲庫(kù)貯存會(huì)一定程度地抑制嗜熱子囊菌的生長(zhǎng)；但在其他不同處理大曲中的生長(zhǎng)穩(wěn)定，基本恒定，且相對(duì)豐度比例較其他真菌微生物大，說(shuō)明嗜熱子囊菌在大曲真菌群落中具有較明顯的優(yōu)勢(shì)，而要保持其的優(yōu)勢(shì)，需提供曲庫(kù)的貯存條件。該結(jié)果為今后研究嗜熱子囊菌在熱風(fēng)干燥大曲中的應(yīng)用提供支持。

霉菌主要產(chǎn)糖化酶，被視為大曲糖化降解動(dòng)力的主要來(lái)源[3,21]。近年有報(bào)道[22]分析了各釀造環(huán)境中曲霉的生態(tài)結(jié)構(gòu)分布。與降溫期大曲相比，曲霉菌在貯存期間表現(xiàn)出良好的生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)，與已報(bào)道霉菌在貯存階段活躍相一致[23]。曲霉菌在RG2、RG3中的相對(duì)豐度分別為25.5%、37.6%，相比于FK2、FK3，同比增加了11.2%、13%，隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng)，曲霉菌生長(zhǎng)越旺盛。分析可能是實(shí)驗(yàn)室貯存環(huán)境里幾乎沒(méi)有曲蟲(chóng)的存在（除大曲自身所帶曲蟲(chóng)外），而曲庫(kù)中曲蟲(chóng)滋生，隨貯存時(shí)間延長(zhǎng)曲蟲(chóng)數(shù)量上升，曲蟲(chóng)能吃掉大曲，影響了曲霉菌類(lèi)的生長(zhǎng)，并使得曲塊糖化力、液化力下降[24]。說(shuō)明實(shí)驗(yàn)室的貯存環(huán)境相比于曲庫(kù)更有利于曲霉菌的生長(zhǎng)。

假絲酵母屬是大曲發(fā)酵過(guò)程重要的真菌之一，主要產(chǎn)酒精和脂類(lèi)物質(zhì)[25]。在進(jìn)行干燥排潮后的大曲，假絲酵母屬在FK1、ZR1的相對(duì)豐度分別為22.3%、17.7%，均遠(yuǎn)大于在RG1中的豐度，表明當(dāng)溫度降到45℃左右時(shí)，酵母菌類(lèi)活動(dòng)明顯，數(shù)量增加，說(shuō)明干燥工藝后的環(huán)境更利于假絲酵母生長(zhǎng)，與已報(bào)道降溫期酵母的數(shù)量有所上升一致[26]；在貯存1、2個(gè)月后，其豐度大小為FK2＞FK3、ZR2＞ZR3，隨貯存時(shí)間的延長(zhǎng)而減少，可能是受到其他微生物競(jìng)爭(zhēng)抑制的影響。

2.4 大曲真菌在屬水平上的微生物組成熱圖

根據(jù)屬水平上的物種注釋及豐度信息，選取豐度排名靠前的真菌屬及其在每個(gè)樣品中的豐度信息，從物種和曲樣兩個(gè)層面進(jìn)行聚類(lèi)，繪制成熱圖。根據(jù)顏色梯度反映不同大曲的真菌群落相似差異性及物種聚類(lèi)關(guān)系。不同處理的大曲真菌在屬水平上的微生物組成熱圖如圖6所示，反映了不同處理大曲樣品的相同性和差異性。

圖6 不同處理大曲真菌在屬水平上的微生物組成熱圖Fig. 6 Heat map showing fungal composition from Daqu samples with different treatments

由圖6上端的樣本間聚類(lèi)看出，所有樣品大致分為4 組。大曲RG3根據(jù)豐度信息單獨(dú)聚類(lèi)為一大組；其他8 種大曲聚類(lèi)為一大組，表明了8種大曲之間類(lèi)似的群落結(jié)構(gòu)，其中，ZR2的真菌群落獨(dú)立為一組，大曲RG2和ZR3近似，F(xiàn)K1、FK3、RG1、ZR1、FK2聚類(lèi)成一組。

另外，從圖6左端物種聚類(lèi)可以看出，根霉菌屬（Rhizopus）、嗜熱子囊菌屬、根毛霉屬在大曲RG1、ZR1中的比例很高。但相對(duì)于RG1，經(jīng)過(guò)自然干燥后的大曲ZR1，柯達(dá)酵母屬（Kodamaea）、生絲畢赤酵母屬（Hyphopichia）、假絲酵母屬的比例均有所增加，說(shuō)明自然排潮降溫，曲房中的濕度和溫度的調(diào)節(jié)后，酵母群類(lèi)微生物生長(zhǎng)旺盛；但人為的熱風(fēng)干燥處理不利于大多數(shù)真菌微生物的生長(zhǎng)，只有假絲酵母屬的數(shù)量有所增加。從貯存方式來(lái)看，相比于大曲ZR1，大曲ZR2中的擬青霉屬（Paecilomyces）、支頂孢屬（Acremonium）增加明顯；大曲ZR3中嗜熱子囊菌屬、Rasamsonia、生絲畢赤酵母屬（Hyphopichia）成為優(yōu)勢(shì)菌群。值得注意的是，耐鹽真菌（Wallemia）、絲衣霉菌屬（Byssochlamys）、青霉菌屬（Penicillium）、曲霉屬是大曲RG3中的主要真菌群類(lèi)，其比例也遠(yuǎn)大于其他大曲。

2.5 PCA結(jié)果

按干燥和貯存處理的不同，將9 個(gè)大曲樣品分成3 個(gè)組，分別是RG1、FK1和ZR1為組A，RG2、FK2和ZR2為組B，RG3、FK3和ZR3為組C。

圖7 不同處理方式大曲中真菌微生物群落組成PCAFig. 7 Principal component analysis of fungal communities from Daqu samples with different treatments

由圖7可以看出，運(yùn)用PCA方法比較不同處理方式的大曲，可獲得兩個(gè)主成分，主成分1的貢獻(xiàn)率為77.16%，主成分2的貢獻(xiàn)率為12.04%，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到89.2%，因此主成分1和主成分2基本可以全面反映研究區(qū)域真菌微生物群落情況并將不同處理方式的大曲真菌群落區(qū)分開(kāi)來(lái)。大曲樣品RG1和ZR1聚集，F(xiàn)K1雖落點(diǎn)較遠(yuǎn)，但根據(jù)主成分1（貢獻(xiàn)率達(dá)到77.16%）可以將FK1與RG1、FK1聚成一類(lèi)，說(shuō)明熱風(fēng)干燥工藝對(duì)大曲的真菌微生物群落有一定影響但影響較??；FK3、ZR3聚集，說(shuō)明基于熱風(fēng)干燥工藝并返回曲庫(kù)貯存這一處理方式的大曲與自然干燥自然貯存的大曲差異不明顯；而RG3落點(diǎn)相對(duì)較遠(yuǎn)，說(shuō)明熱風(fēng)干燥后經(jīng)實(shí)驗(yàn)室貯存2 個(gè)月的大曲真菌群落有較大的變化。

3 結(jié) 論

通過(guò)燈光誘捕、使用藥劑等處理大曲制作環(huán)境，治理效果顯著[27-29]，其中外源熱風(fēng)干燥工藝可以完全殺滅曲蟲(chóng)，考慮到此工藝以及曲塊在不同貯存環(huán)境（是否避開(kāi)存在曲蟲(chóng)的曲房貯存）可能會(huì)對(duì)大曲中真菌群落產(chǎn)生影響，因此本研究對(duì)不同處理方式的大曲的真菌群落進(jìn)行了探索。采用熒光定量PCR和Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)，研究排潮降溫期大曲通過(guò)熱風(fēng)、自然干燥處理，對(duì)比實(shí)驗(yàn)室貯存、曲庫(kù)貯存9種不同處理方式的大曲在真菌群落之間的差異。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同處理方式大曲中的真菌18S rRNA基因拷貝數(shù)在1×1011～4.5×1011copies/g之間；ZR3拷貝數(shù)最大為4.5×1011copies/g?；诖笄恼婢鄻有灾笖?shù)分析，大曲RG2、RG3、ZR3的多樣性較高。屬水平上相對(duì)豐度的解析中，不同處理大曲的優(yōu)勢(shì)真菌類(lèi)群均為嗜熱子囊菌屬、根毛霉屬、曲霉菌屬、假絲酵母屬。其中嗜熱子囊菌屬在大曲真菌群落中具有明顯的優(yōu)勢(shì)，若要保持其優(yōu)勢(shì)，需提供曲庫(kù)的貯存條件；而實(shí)驗(yàn)室貯存環(huán)境相比于曲庫(kù)更有利于曲霉菌屬類(lèi)的生長(zhǎng)；干燥工藝后的環(huán)境更利于假絲酵母屬類(lèi)生長(zhǎng)。

PCA可看出基于熱風(fēng)干燥工藝并返回曲庫(kù)貯存這一處理方式的大曲與自然干燥自然貯存的大曲差異不明顯；而大曲RG3落點(diǎn)相對(duì)較遠(yuǎn)，再結(jié)合微生物組成熱圖可分析大曲RG3中耐鹽真菌、絲衣霉菌屬、青霉菌屬、曲霉屬在大曲RG3中的比例遠(yuǎn)大于其他大曲，是大曲RG3區(qū)別于其他大曲的主要真菌群類(lèi)，說(shuō)明熱風(fēng)干燥工藝以及熱風(fēng)干燥后經(jīng)過(guò)2 個(gè)月實(shí)驗(yàn)室貯存的大曲中真菌群落有較大的變化，差異性明顯，故此類(lèi)大曲有進(jìn)一步研究的價(jià)值，為后續(xù)研究提供參考。