褪黑素提高HO-1表達對氯胺酮相關性腎損傷的影響

曾錦江，盧 勇，牛得草，譚偉明，米 華

(廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院泌尿外科，南寧 530021)

氯胺酮是N-甲基-D-門冬氨酸受體的拮抗藥[1]，因其致幻及中樞興奮等特性被濫用于各類娛樂場所，現(xiàn)為當今流行毒品K粉的主要成分。在2007年SHAHANI等[2]首次報道9例濫用氯胺酮造成泌尿系統(tǒng)損害后，氯胺酮相關性泌尿系統(tǒng)損害(ketamine associate urinary dysfunction，KAUD)才引起人們的重視，KAUD起初主要表現(xiàn)為尿頻、尿急、急迫性尿失禁、尿痛、血尿等，隨著病情進展可導致膀胱攣縮和上尿路損害，嚴重影響生活質量。目前氯胺酮濫用致泌尿系統(tǒng)損害的相關研究大多停留在臨床病例報道，臨床上更是缺乏統(tǒng)一有效的治療手段。近期有研究表明，氯胺酮通過氧化應激損傷的激活導致膀胱炎及細胞凋亡的發(fā)生、發(fā)展[1,3]。褪黑素作為安全、不良反應小的抗氧化劑，可在機體氧自由基刺激下，活化和增加血紅素氧化酶-1(HO-1)表達出明顯的抗氧化、抗炎和抗凋亡的保護效應[4]。鑒于KAUD在臨床上下尿路癥狀突出表現(xiàn)，與之相關腎損害往往被忽視，而GIMONA等[5]報道一些氯胺酮濫用導致腎功能不全者的腎穿刺檢查結果顯示腎小管破壞、血管及間質再生，提示氯胺酮導致上尿路損害可能是直接損傷為主。本研究旨在建立氯胺酮導致大鼠腎損害模型，探討褪黑素對氯胺酮相關性腎損害的保護機制為揭示其中相關的發(fā)病機制和治療方案提供思路。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑 鹽酸氯胺酮注射液(規(guī)格100 mg/2 mL)購于福建古田制藥有限公司；褪黑素1 g購自美國Sigma公司；谷胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(TUNEL)細胞凋亡檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；HO-1一抗購自英國Abcam公司，內參β-actin和二抗(羊抗兔)均購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.1.2主要儀器 電動勻漿機購自德國IKA公司；低溫離心機購自德國Eppendorf公司； MK3酶標儀購自上海雷博生物技術有限公司；組織切片機購自德國Leica公司；熒光顯微鏡及顯微鏡照相系統(tǒng)購自日本Olympus公司；微量加樣器購自德國Eppendorf公司；雙垂直電泳槽、半干轉膜儀購自上海天能科技有限公司；Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)購自美國LI-COR公司。

1.1.3實驗動物 清潔級SD雄性大鼠32只，體質量190～210 g，購于廣西醫(yī)科大學實驗動物中心，飼養(yǎng)于溫度、濕度適宜的動物房，本研究已通過動物倫理委員會審核。

1.2方法

1.2.1建立氯胺酮致SD大鼠腎損害模型 參考YEUNG等[6]成功造模及結合本課題組預實驗經驗，將32只大鼠按隨機數(shù)字表法隨機分為A組(等量生理鹽水)、B組(氯胺酮30 mg/kg)、C組(褪黑素5 mg/kg)及D組(氯胺酮30 mg/kg+褪黑素5 mg/kg)，各組大鼠每天09:00予以腹腔注射給藥，持續(xù)12周。褪黑素用量參照文獻[4,7]實驗的最佳用量。建模過程中，每3天稱1次各組大鼠體質量以調整用藥量。大鼠于12周后采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，固定、常規(guī)備皮，充分暴露大鼠腹主動脈及腎臟，用采血針取腹主動脈血5 mL并置于4 ℃冰箱中靜置30 min后取上清液送至廣西醫(yī)科大學藥學院實驗室平臺行血清肌酐及尿素氮檢測。同時迅速分離右側新鮮腎臟，置于-20 ℃保存，用于氧化指標及Western blot檢測，隨后應用4%多聚甲醛緩沖液灌注固定后，取左側腎臟浸泡于多聚甲醛緩沖液內用于組織學相關檢測。

1.2.2氧化指標測定 準確稱取預先保存的各組大鼠新鮮右側腎臟制備成10%的組織勻漿(冰浴下)，4 ℃ 25 000 r/min，離心5 min。取上清液后用冰生理鹽水稀釋成1%的勻漿。各組MDA水平用硫代巴比妥酸(TBA)法測定，各組腎組織中SOD及GSH-Px水平采用直接比色法檢測，組織蛋白水平用微量酶標法(BCA)測定。

1.2.3腎組織切片蘇木精-伊紅(HE)及馬松(Masson)染色 各組大鼠腎組織用4%多聚甲醛固定48 h后，常規(guī)行脫水、透明、浸蠟、包埋后，切成5 μm厚度石蠟切片，隨后行貼片、脫蠟、水化、HE染色及Masson染色和封片等步驟，在顯微鏡下觀察各組大鼠腎實質、間質等形態(tài)變化。

1.2.4TUNEL法檢測腎組織細胞凋亡 各組腎臟石蠟切片常規(guī)脫蠟后，用3%過氧化氫甲醇溶液清除內源性過氧化物酶的活性。隨后，滴加蛋白酶K工作液20 μg/mL,室溫下孵育30 min,用PBS沖洗3次后，滴加TUNEL反應液，置于孵育盒中室溫下孵育60 min。滴加轉化劑-酶標記抗熒光素抗體(POD)之后，再次置于孵育盒中孵育25 min，隨后用加入配好的二氨基聯(lián)苯胺(DBA)顯色液，顯色5 min并在顯微鏡下觀察顏色深淺控制染色強度，將切片置于HE染液復染，常規(guī)脫水、透明及封閉后顯微鏡下觀察凋亡細胞并計數(shù)。

1.2.5Western blot測定組織蛋白表達 稱取新鮮保存腎組織置于1.5 mL離心管，剪碎后加入蛋白質裂解液(RIPA)和蛋白酶抑制劑(PMSF)，冰浴下勻漿之后靜置30 min，4 ℃ 15 000 r/min、離心5 min，取上清液采用BCA法測蛋白水平以調整上樣量。隨后加入上樣緩沖液，高溫至蛋白質變性，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，之后進行轉膜、封閉及漂洗。將膜置于一抗HO-1(兔抗鼠，1∶15 000)及內參β-actin(1∶500)孵育盒，4 ℃搖床過夜，TBST洗膜后，二抗按照1∶10 000稀釋，4 ℃搖床孵育3 h，Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)下掃膜、拍照并測量灰度值，分析結果。計算目的蛋白的灰度值和內參β-actin蛋白灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達率。

2 結 果

2.1各組大鼠行為及腎功能指標比較 與A組比較，B、D組大鼠立即出現(xiàn)活動增加、共濟失調，隨后平靜不動；而D組大鼠活躍持續(xù)及平靜到恢復正常的時間均比B組短。以體質量為協(xié)變量調整后，各組大鼠血肌酐及尿素氮采用協(xié)方差分析結果顯示，B組血肌酐、尿素氮水平較其余各組明顯升高(P<0.05)，而C、D兩組大鼠血肌酐、尿素氮與A組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖1。

2.2各組大鼠腎組織中SOD、GSH-Px及MDA水平比較 與B組比較，A、C、D組MDA水平明顯降低，SOD、GSH-Px水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而C組中MDA水平與A組無明顯差異，SOD及GSH-Px水平與D組無明顯差異(P>0.05)，見表1。

a：P<0.05,與A組比較；b：P<0.05,與B組比較

表1 各組大鼠腎組織中SOD及MDA等水平比較

a:P<0.05，與B組比較；b:P<0.05，與A組比較

圖2 大鼠腎組織HE染色及Masson染色結果(×200)

2.3腎臟組織HE及Masson染色結果 光鏡下HE染色可見A、C組大鼠腎組織無明顯單核炎癥細胞浸潤，腎小球及腎小管形態(tài)正常；B組大鼠腎間質和腎小球周圍可見大量炎癥細胞浸潤，多處局灶性壞死，甚至出現(xiàn)腎小球萎縮、封閉；與B組比較，D組大鼠炎癥細胞浸潤減少，腎小球及腎小管尚完整，間質破壞不明顯。Masson染色切片顯示，B組可見腎組織膠原染色加深,有條索狀纖維形成，D組膠原染色與A、C組無明顯差別，見圖2。

2.4各組TUNEL細胞凋亡結果 A、C組大鼠中腎組織偶見呈棕黃色的陽性細胞(凋亡細胞)，可能是正常細胞凋亡的假陽性結果；B組大鼠無論在腎實質還在間質陽性染色細胞明顯增多(P<0.05)；與B組比較，D組大鼠腎組織的陽性細胞減少明顯(P<0.05)，只出現(xiàn)少許凋亡細胞。凋亡細胞數(shù)半定量結果顯示，與A組比較，B組大鼠腎組織凋亡細胞明顯增加(P<0.05)，而D組凋亡細胞數(shù)量比B組明顯減少(P<0.05)，C、A組大鼠腎凋亡細胞比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖3、4。

2.5各組大鼠腎組織HO-1蛋白表達水平 與A組比較，B、C、D組大鼠HO-1蛋白水平均明顯升高(P<0.05)；而D組中HO-1蛋白水平升高更明顯(P<0.05)，見圖5。

a:P<0.05，與A組比較；b:P<0.05，與B組比較；c:P<0.05，與C組比較

3 討 論

氯胺酮作為毒品“K粉”的主要成分，非法濫用情況逐年遞增，不容樂觀。氯胺酮的濫用對神經、心血管系統(tǒng)及肝臟的毒副作用已有充分認識，但關于KAUD研究目前僅限于臨床治療，相關的基礎研究也大多呈現(xiàn)單一性，未能系統(tǒng)深入的探究，導致臨床上尚無統(tǒng)一規(guī)范的治療，其發(fā)病機制有待進一步研究[8-9]。

氯胺酮濫用導致的泌尿系統(tǒng)損害由于突出的膀胱刺激癥狀，其相關性腎損害往往被忽視。GIMONA等[5]發(fā)現(xiàn)一些氯胺酮濫用導致腎功能不全者的腎穿刺檢查結果顯示，腎小管破壞、血管及間質再生，提示氯胺酮導致上尿路損害可能是直接損傷為主，間接損害為輔的病理過程。本研究發(fā)現(xiàn)，長期予以氯胺酮注射后，大鼠的血清肌酐及尿素氮水平明顯高于其余各組，同時在大鼠腎病理組織切片可見大量炎癥細胞浸潤，出現(xiàn)腎小球萎縮，間質纖維化嚴重等，甚至在TUNEL凋亡結果中發(fā)現(xiàn)，腎間質和實質細胞凋亡數(shù)量明顯增加，提示氯胺酮長期作用可導致腎臟的多種直接損害。盡管已發(fā)現(xiàn)長期濫用氯胺酮可導致嚴重泌尿系統(tǒng)損傷，可其治療方案卻無相關研究證據可循，對于一些嚴重腎積水并感染者，可行患側腎切除術，由于濫用氯胺酮患者主要為青少年群體，不主張輕易行外科手術治療，對于此類患者臨床上迫切需要有效而明確的藥物和治療手段的出現(xiàn)。

本研究發(fā)現(xiàn)長期予以氯胺酮后大鼠腎組織勻漿的MDA水平明顯增加，而抗氧化蛋白SOD、GSH-Px水平明顯降低，而在予以抗氧化劑褪黑素作用后能有效地降低MDA水平，并提高SOD、GSH-Px水平，另外僅予以褪黑素后SOD、GSH-Px水平也有不同程度提高，說明褪黑素能有效抵抗氯胺酮導致的腎組織氧化損傷和提高抗氧化相關蛋白表達。近年來，氧化應激損傷成為學者們研究腎臟疾病的熱點，氧化損傷與反應氮原子和活性氧(ROS)的過量產生相關，ROS使體內自由基增加，自由基中超氧化物和脂質過氧化產物(如MDA)可誘導細胞和組織相應靶分子累積氧化變性或損傷，是造成細胞代謝和功能紊亂的基本環(huán)節(jié)和重要病理生理基礎[10-11]，褪黑素是哺乳動物中松果體產生的一種激素，研究表明其具有促進睡眠和強大的抗氧化作用，其作為一種高效的抗氧化劑，能夠直接清除氧自由基從而減輕氧自由基對抗氧化酶的破壞，不僅其清除羥自由基的能力及清除烷過氧化物能力是維生素E的2倍[12]，而且其幾乎無任何有害不良反應[13-14]，可在臨床上安全推廣。

相比于抗氧化酶SOD和GSH-Px，HO-1擁有更為強大的抗氧化特性，例如HO-1能促進抗氧化代謝產物膽紅素和膽綠素的形成，可分解血紅素(具有強烈氧化毒性的底物)且減少細胞內氧化劑鐵和鐵蛋白的合成[15]。由于HO-1具有上述突出的抗氧化特性，使得其成為近年來預防氧化損傷備受矚目的靶基因[16-17]。為了更進一步闡明褪黑素治療氯胺酮對腎臟的氧化損傷是否與激活HO-1高表達相關，本研究通過Western blot技術觀察各組大鼠腎組織HO-1蛋白表達水平，發(fā)現(xiàn)僅長期予以氯胺酮注射后大鼠腎組織HO-1的蛋白水平增加并不明顯，但在增加褪黑素干預后HO-1蛋白水平明顯增加(P<0.05)，并且單獨予以褪黑素的大鼠腎組織HO-1水平也明顯增加(P<0.05)，說明氯胺酮可導致腎組織產生氧化應激，使得HO-1表達略微升高，只是機體的自身加強氧化系統(tǒng)防御的機制，但是遠不足以抵抗氯胺酮所致的ROS和MDA水平的增加。相比之下，褪黑素可以有效增加HO-1蛋白水平，從而明顯抑制MDA水平，表明在氯胺酮導致腎氧化應激性損傷后應用褪黑素可有效增加HO-1蛋白水平，進而拮抗SOD、GSH-Px耗竭，其機制可能與上調HO-1相關靶基因轉錄的激活有關。

綜上所述，本研究結果表明，褪黑素能很大程度上改善氯胺酮導致腎臟氧化損傷，降低脂質過氧化產物(如MDA)水平，提高組織抗氧化蛋白SOD、GSH-Px及HO-1的水平，從而減少炎癥細胞浸潤，細胞凋亡，腎小球萎縮、封閉及間質纖維形成等，其保護機制可能與增加HO-1蛋白表達有關，而抵抗氧化損傷有望成為研究KAUD的藥物靶點。本研究對于揭示氯胺酮相關性腎損害的發(fā)病機制、設計合理的藥物治療靶點，為發(fā)掘更精確和個性化的診斷和治療方法可提供研究基礎。