上皮性卵巢癌原發(fā)灶和轉移灶中miRNA-124表達水平的研究

何 喻，任 瑩，叢玲華

(寧波市鄞州人民醫(yī)院病理科，浙江 寧波 315000)

上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)是卵巢癌最主要的病理分型，占80%以上。EOC發(fā)病隱匿、惡性程度較高、生存率較低，是女性生殖系統(tǒng)腫瘤致死率最高的疾病[1]。臨床上，大約有75%的ECO患者到醫(yī)院就診時已經(jīng)處于Ⅲ期或Ⅳ期，并且5年生存率也僅30%左右[2]。MicroRNA (miRNA)由18～22個核苷酸組成，是非編碼RNA分子，轉錄后調節(jié)基因的表達[3]。既往有研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌組織中有多種miRNA異常表達，例如漿液性卵巢癌組織中miRNA-200、miRNA-429、miRNA-7、miRNA-124等。miRNA-124是近年來研究較多的miRNA之一，其在肝癌、胃癌、大腸癌、口腔癌和宮頸癌中表達水平下降，發(fā)揮著類似抑癌基因的作用[4-6]。miRNA-124可以調控表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor，EGFR)，從而對腫瘤的增值、侵襲起到抑制作用[7]。目前，關于miRNA-124與EGFR在卵巢癌中表達的報道比較少。本研究采用顯色原位雜交(chromogenic in situ hybridization，CISH)技術檢測了卵巢癌原發(fā)灶及轉移灶中miRNA-124的表達水平，另外采用免疫組化技術檢測了EGFR的表達水平，旨在探討miRNA-124與EGFR在上皮性卵巢癌中表達的相關性，以及其與癌癥轉移的關系。

1資料與方法

1.1一般資料

2016年5月至2018年3月于寧波市鄞州人民醫(yī)院進行手術治療的EOC患者60例，均經(jīng)過術后病理檢查證實EOC的診斷。根據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(The International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO)分期：Ⅲ期28例，Ⅳ期32例。ECO患者轉移灶均為大網(wǎng)膜或者腹膜轉移結節(jié)。患者術前均未接受過放、化療和(或)激素治療。

1.2方法

1.2.1 miRNA-124水平的檢測

采用CISH法檢測miRNA-124的表達。組織標本采用10%福爾馬林固定、石蠟包埋，切片厚度為4μm。檢測時進行脫蠟和水化處理，并進行檸檬酸鹽抗原修復，100℃烤箱中孵育10min，隨后使用蛋白酶K(上海翊圣生物科技有限公司，貨號10401ES60)消化和脫水，雜交過夜，使用DAB(試劑盒購于武漢博士德有限公司，貨號AR1025)進行顯色，再使用蘇木素復染，最后采用中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。miRNA-124陽性時鏡下顯示黃色或棕黃色顆粒樣物質。

1.2.2 EGFR蛋白的檢測

鏈霉素-過氧化物酶免疫組化法檢測EGFR蛋白的表達，試劑盒購于上海經(jīng)科化學科技有限公司，貨號為WB1210-1。檢測時進行脫蠟和水化處理，隨后進行抗原修復，每張切片加50μL過氧化物酶阻斷液(試劑A)，溫室孵育10min，再加50μL非免疫性動物血清(試劑B)，溫室孵育15min。之后每張切片加50μL生物素標記的二抗(試劑C)，溫室孵育1h，加50μL試劑D，溫室孵育10min，使用DAB進行顯色，用蘇木素進行復染，最后使用中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.3統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料采用例(百分比)表示，組間比較采用卡方(χ2)檢驗；相關性檢驗采用Spearman分析，P<0.05為組間差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1 EOC原發(fā)灶和轉移灶中miRNA-124的表達

如圖1和表1所示，46(76.67%)例原發(fā)灶中miRNA-124表達陽性，18(30.00%)例轉移灶中miRNA-124表達陽性，miRNA-124在原發(fā)灶中的表達率明顯較轉移灶高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。原發(fā)灶和轉移灶中EGFR的的陽性表達率均為100.00%，原發(fā)灶中強陽性(+++)表達率較轉移灶低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1和表1。

2.2 miRNA-124表達與EGFR表達的相關性分析

miRNA-124和EGFR在原發(fā)灶和轉移灶中的表達量呈負相關(P= 0.021)，見表2。

注：A為miRNA-124在EOC原發(fā)灶中的表達(×200)；B為miRNA-124在EOC轉移灶中的表達(×200)；C為EGFR在EOC原發(fā)灶中的表達(×200)；D為EGFR在EOC轉移灶中的表達(×200)

圖1 EOC原發(fā)灶和轉移灶中miRNA-124的表達

Fig.1 Expression of miRNA-124 in EOC primary foci and metastatic foci

表2 miRNA-124和EGFR在原發(fā)灶和轉移灶中表達的相關性[n(%)]

3討論

3.1 miRNA-124的生物學功能

miRNA在機體內發(fā)揮著重要的生物學功能[8]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用，并且對腫瘤的診斷和預后的判斷也有意義[9]。作為新型的分子標志物，miRNA可用于腫瘤的早期診斷，其具有廣闊的應用前景[10-11]。既往研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-124是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中必不可少的miRNA之一[12]，miRNA-124在多種腫瘤組織或外周血中的表達水平下降，對細胞的增值、分化、遷移和侵襲起著重要作用[4-5,13]。舒錦等[14]發(fā)現(xiàn)卵巢癌組織中的miRNA-124表達水平下降。體外實驗中，miRNA-124 在卵巢癌 SKOV3 細胞中過表達可明顯抑制該細胞的增殖、 遷移和侵襲，并且促進細胞凋亡。

3.2 miRNA-124在卵巢癌組織中的表達水平及意義

目前，檢測miRNA的方法主要有miRNA芯片法、聚合酶鏈反應技術和Northern blot技術等，均有較高的特異度和敏感度，但是它們不能顯示miRNA在組織中的定位。CISH是一種新的組織化學方法，可以評估基因的擴增水平，并且靈敏度較高。本研究采用CISH技術，通過miRNA-124互補的核苷酸探針，顯示出miRNA-124在卵巢癌組織中的位置，對其進行定位觀察，結果發(fā)現(xiàn)，46(76.67%)例原發(fā)灶中miRNA-124表達陽性，18(30.00%)例轉移灶中miRNA-124表達陽性，miRNA-124在原發(fā)灶中的表達率明顯較轉移灶高(P<0.05)。結果提示miRNA-124的表達與EOC的轉移能力呈負相關(P<0.05)，miRNA-124可能對EOC的轉移起到抑制作用。

3.3 miRNA-124對EGFR的影響及意義

既往研究已證實，EGFR與腫瘤的轉移有關，約70%的EOC有EGFR的表達[15]。有學者發(fā)現(xiàn)，抑制EGFR可以抑制卵巢癌的轉移[16]。miRNA被認為可以促進或抑制腫瘤的轉移，其機制可能與EGFR、基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)、骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)和E-cadherin等表達有關。有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-124可以調控EGFR，從而對腫瘤的增值、侵襲起到抑制作用[7]。有報道指出，miRNA-124可以通過與EGFR mRNA的3個非保守的區(qū)域結合，使得AKT和ERK1/2這兩個EGFR信號通路的關鍵分子下調，在多種人類腫瘤細胞中引起周期阻滯和細胞死亡[17]。體外研究中，過表達miRNA-124可以激活EGFR-P13K-ATK信號通路，促進癌癥的侵襲和轉移[18]。本組研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)灶及轉移灶中EGFR的表達率均為100.00%，原發(fā)灶中強陽性(+++)表達率較轉移灶低。并且，miRNA-124和EGFR在原發(fā)灶和轉移灶中的表達量呈負相關。

綜上，miRNA-124在EOC原發(fā)灶和轉移灶中的表達有所差異。miRNA-124可能通過靶向EGFR調節(jié)EOC的轉移，其可能成為治療EOC潛在靶點，但是具體作用機制還需要進一步體內外研究。