熒光原位雜交技術(shù)在唐篩高危人群產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用

李 翠，趙明剛，趙 樂，王曉巖，王 翔

(1.西安交通大學第一附屬醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學中心;2.檢驗科，陜西 西安 710061)

近年來，出生缺陷已成為全球性的人口健康問題[1-2]。在我國，出生缺陷總發(fā)生率約為5.6%，且每年新增出生缺陷數(shù)高達90萬例[3]。出生缺陷已嚴重影響人口素質(zhì)和群體健康水平[4]。據(jù)報道，目前70%的出生缺陷由于遺傳因素所致，其中染色體異常較為常見。在產(chǎn)前診斷染色體異常中，最常見的是21染色體、18染色體、13染色體及性染色體的非整倍體，占染色體數(shù)目異常的80%以上[5]。由于染色體疾病目前并無有效的治療方法，針對上述常見染色體異常進行產(chǎn)前篩查和診斷，能夠有效防止此類患兒的出生，提高人口素質(zhì)。

產(chǎn)前篩查主要通過對孕婦血液中的特異指標進行檢測，從而篩選出高風險人群。然后針對高風險人群進行相關(guān)產(chǎn)前診斷進行確診。產(chǎn)前診斷通過絨毛活檢、羊水穿刺及胎兒臍靜脈穿刺等手段獲取胎兒細胞，從而對胎兒染色體核型進行分析。中孕期羊水穿刺在臨床上應(yīng)用最為廣泛。但是，羊水細胞培養(yǎng)過程均為手工操作，耗時較長，且存在失敗的可能，效率較低[6]。

熒光原位雜交(fluorescence in situ hybri￣dization，F(xiàn)ISH)技術(shù)利用堿基互補配對原則將熒光標記的探針與目的DNA雜交[7]，通過熒光顯微鏡觀察雜交后熒光信號的數(shù)量及類型進行判斷。FISH檢測所需細胞較少，且無需細胞培養(yǎng)，能快速直觀地對常見的染色體非整倍體進行診斷[8]。本研究通過對218例唐篩高危孕婦的羊水細胞進行FISH及染色體核型分析檢測，進一步探討FISH在唐篩高危人群快速產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用價值。

1研究對象與方法

1.1臨床資料

選擇2012年1月至2016年1月由于唐篩高風險在西安交通大學第一附屬醫(yī)院行羊水穿刺的孕婦218名，平均年齡29.99歲(20～42歲)，平均孕周20+2周(16～33周)。

1.2羊水穿刺取材

在超聲引導(dǎo)下經(jīng)腹壁、子宮壁進入羊膜腔抽取羊水25mL，此過程嚴格進行無菌操作。其中20mL羊水用于細胞培養(yǎng)及染色體核型分析，5mL羊水用于FISH檢測。

1.3 FISH檢測

1.3.1 FISH探針

FISH探針購于美國VYSIS公司。21號和13號探針分別用橘紅色和綠色熒光標記，18號、X和Y染色體探針分別用藍色、綠色和紅色熒光標記。

1.3.2羊水細胞處理

將5mL羊水置于15mL無菌離心管中，1 000r/min離心10min，棄去上清，常規(guī)低滲固定處理，滴片，70℃烤片1h。將玻片置于2×SSC溶液中，37℃孵育1h，再置于胃蛋白酶工作液中消化15min，2×SSC漂洗兩次后，將玻片分別放置于70%乙醇、80%乙醇、100%乙醇中脫水處理1min，自然干燥后，將10μL FISH探針混合物加到玻片雜交區(qū)，加蓋蓋玻片，封片后放入雜交儀中雜交過夜。漂洗玻片后，4’,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽染料(4',6-Diamidino-2-Phenylindole,DAPI)復(fù)染，熒光顯微鏡下計數(shù)細胞。

1.4羊水細胞G顯帶核型分析

將15mL羊水離心后，棄上清，將羊水細胞接種至無菌培養(yǎng)瓶中，靜置培養(yǎng)1周后，換液后24～48h內(nèi)收獲細胞，常規(guī)制片，進行G顯帶核型分析。按《人類細胞遺傳學國際命名體制(ISCN 2013年)》標準進行染色體核型分析。每例計數(shù)30個細胞分裂相，分析5個核型。若為異常核型，則適當增加計數(shù)及分析的核型。

1.5隨訪

于孕婦產(chǎn)后1～6個月，對其進行電話隨訪。218例患者均隨訪成功，隨訪率為100%。

2結(jié)果

2.1 FISH檢測結(jié)果

在218例孕婦中，共檢出染色體異常9例，染色體異常率為4.13%，其中21-三體5例，18-三體2例，13-三體1例，45X[25]/46,XY[75]1例，見表1。

2.2羊水細胞培養(yǎng)及染色體核型分析結(jié)果

218例羊水均培養(yǎng)成功，共檢出染色體異常11例，染色體異常率為5.04%，其中21-三體5例，18-三體2例，13-三體1例，45X[32]/46,XY[68] 1例，平衡易位1例，染色體多態(tài)性1例，見表1。

2.3隨訪

染色體異常病例相關(guān)料見表2。其中9例已引產(chǎn)，其余2例異常染色體核型的胎兒已出生，目前發(fā)育良好，未見明顯異常，另207例結(jié)果正常胎兒目前均已出生，生長發(fā)育良好，未見異常。所有出生胎兒將對其進行持續(xù)隨訪。

表1異常核型結(jié)果對比分析(n)

Table 1 Comparative analysis of abnormal chromosome karyotype (n)

表2胎兒染色體異常病例的臨床信息

Table 2 Clinical information of cases of chromosomal abnormality

3結(jié)論

3.1染色體病與唐氏綜合征

染色體病在新生兒中發(fā)病率為0.5%～0.7%[9]，其中21-三體綜合征發(fā)病率最高。21-三體綜合征也稱唐氏綜合征，其在新生兒中發(fā)病率為1/800～1/600[10]。據(jù)文獻報道，約2/3的唐氏綜合征胎兒在妊娠早、中期會發(fā)生自發(fā)流產(chǎn)或胎死宮內(nèi)，因此，其實際發(fā)病率較新生兒發(fā)病率高[11]。唐氏綜合征主要臨床表現(xiàn)為中重度智力低下，體格發(fā)育遲緩，伴隨多器官功能障礙等。由于唐氏綜合征目前尚無法治愈，給患者家庭和社會帶來很大的經(jīng)濟和精神負擔[12-13]。而孕中期唐氏篩查可以很好地檢出高危人群，并通過產(chǎn)前診斷進行確診。

對于唐氏綜合征的產(chǎn)前診斷，最常用的是對孕中期羊水細胞進行染色體核型分析，這也是目前臨床上的金標準。但是，由于核型分析不僅需要細胞培養(yǎng)，耗時較長，而且對相關(guān)技術(shù)人員要求較高，分析結(jié)果易受到細胞生長狀態(tài)、顯帶技術(shù)及操作人員技術(shù)的影響導(dǎo)致失敗[14]。因此，臨床上需要一種快速、簡便、準確的方法對唐篩高危人群進行檢測。

3.2 FISH技術(shù)的優(yōu)勢探討

FISH技術(shù)應(yīng)用于羊水細胞數(shù)目異常檢測，實驗過程并不需要細胞培養(yǎng)，且操作簡單、快速，結(jié)果直觀易于觀察。對于未培養(yǎng)的羊水，只需要少量羊水，即可在24h內(nèi)閱片分析結(jié)果，大大縮短了孕婦等待的時間，緩解其緊張情緒[8]。因此，對于唐篩高危人群來說，F(xiàn)ISH技術(shù)可以提供快速診斷。

本研究對218例唐篩高?；颊叩难蛩毎M行FISH檢測，共檢出21-三體5例，18-三體2例，13-三體1例，檢出率分別為：2.29%、0.92%、0.46%。此外，還檢測出1例45X[25]/46,XY[75]，檢出率為0.46%。但是，對于平衡易位和染色體多態(tài)性的病例，F(xiàn)ISH技術(shù)未能檢出。

已有研究發(fā)現(xiàn)，羊水細胞培養(yǎng)過程中，可能存在來自于某單個細胞形成的細胞株而出現(xiàn)異常核型，從而造成嵌合核型的現(xiàn)象。而FISH技術(shù)不需要細胞培養(yǎng)，是此類假嵌合現(xiàn)象的較好的驗證方法。此外，研究者還指出FISH技術(shù)應(yīng)用于染色體非整倍體的檢測結(jié)果基本與染色體核型分析結(jié)果一致[15]。但是由于FISH技術(shù)受探針種類的限制，只能用特異探針檢出已知的染色體異常，很難在一次實驗中檢出所有的染色體數(shù)量異常及染色體重排等結(jié)構(gòu)異常，這與本研究結(jié)論一致。

3.3結(jié)論

綜上所述，F(xiàn)ISH技術(shù)能夠避免由于細胞培養(yǎng)失敗帶來的檢測失敗，且大大縮短了報告時間；而核型分析能夠彌補FISH檢測局限性等問題。臨床上FISH聯(lián)合羊水細胞培養(yǎng)核型分析，能夠更全面快速地對唐篩高危人群提供產(chǎn)前診斷信息。