番木瓜干旱脅迫相關(guān)CpDHN1基因的克隆與分析

郭靜遠(yuǎn) 鄒智 孔華 賀萍萍 郭安平

摘 ?要：番木瓜（Carica papaya L.）隸屬于番木瓜科番木瓜屬，是一種營養(yǎng)價值高的熱帶果樹，廣泛種植于熱帶和亞熱帶地區(qū)。作為全年結(jié)果的典型熱帶作物，番木瓜易受寒害、旱害等非生物脅迫的影響。然而，目前有關(guān)番木瓜的抗逆研究主要集中于導(dǎo)致絕產(chǎn)的病毒病，鮮見針對非生物脅迫的報道。脫水素又名第二類胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白，屬于親水性高、富含甘氨酸、復(fù)雜度低的非結(jié)構(gòu)蛋白，因其與生物的抗逆性密切相關(guān)而受到廣泛關(guān)注。為解決番木瓜生產(chǎn)在地域上的局限性，并進(jìn)一步提高其品質(zhì)和產(chǎn)量，積極篩選和鑒定參與非生物脅迫響應(yīng)的關(guān)鍵基因具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。本研究基于轉(zhuǎn)錄組獲得的CpDHN1轉(zhuǎn)錄本序列，以‘臺農(nóng)二號’番木瓜組培苗葉片為材料，提取總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，結(jié)合RT-PCR技術(shù)克隆了該基因636 bp的全長編碼區(qū)序列，在此基礎(chǔ)上對其進(jìn)行序列、表達(dá)特性以及原核表達(dá)分析。結(jié)果顯示，CpDHN1編碼211個氨基酸，其理論分子量為24.09 kDa，等電點(diǎn)為5.05，總平均疏水指數(shù)為–1.584，不穩(wěn)定系數(shù)為66.51，屬于不穩(wěn)定、高度親水的細(xì)胞核定位蛋白。CpDHN1蛋白富含谷氨酸、賴氨酸和絲氨酸，含有3個保守區(qū)域，即2個K片段和1個S片段，符合脫水素蛋白的基本結(jié)構(gòu)特征，屬于SKn型脫水素。生物信息學(xué)分析表明CpDHN1無跨膜螺旋，其二級結(jié)構(gòu)中以α-螺旋結(jié)構(gòu)占主導(dǎo)。表達(dá)分析顯示，該基因在根、葉片和韌皮部樹液中均有表達(dá)，且其表達(dá)水平受干旱脅迫調(diào)控。同源分析表明，CpDHN1與擬南芥AtLEA4序列相似性最高，為46.8%，而與番木瓜中已報導(dǎo)的另一個脫水素CpDHN的相似性僅為19.4%。研究還構(gòu)建了CpDHN1的原核表達(dá)載體，根據(jù)SDS-PAGE結(jié)果，CpDHN1在40 kDa處有條中強(qiáng)度的誘導(dǎo)條帶，而在55 kDa處有條高亮的誘導(dǎo)條帶，可能與其無規(guī)結(jié)構(gòu)有關(guān)。這些結(jié)果為進(jìn)一步的功能分析與應(yīng)用奠定了堅實(shí)的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：番木瓜;胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白;脫水素;干旱脅迫;原核表達(dá)

中圖分類號：S667.9 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Abstract： Papaya （Carica papaya L.）， which belongs to the Carica genus within the Caricaceae family， is a popular tropical fruit with high nutritional value that are widely cultivated in tropical and subtropical areas. As a typical tropical crop that fruits through the whole year， papaya is vulnerable to abiotic stresses such as cold and drought. Presently， there are few reports on stress resistance of papaya， and main studies focus on the virus disease which leads to the extinction of papaya production. Dehydrin， also known as type two late embryogenesis abundant protein， is a class of natural non-structural proteins with high hydrophilicity， rich in glycine， and low complexity. It has attracted extensive attention because it is highly related to the ability of plants to resist abiotic stresses. In order to solve the regional limitation of papaya cultivatation and further improve the fruit quality and yield， it is of importance to screen and characterize key genes involved in abiotic stress response. Based on a de novo assembled transcript， a 636 bp open reading frame of a gene that was denoted as CpDHN1 was isolated from the leaf tissue of cultivar ‘Tainong No. 2’ using RT-PCR. Bioinformatic analysis showed that CpDHN1 putatively encodes 211 amino acids， which was predicted to target the nuclear and have a theoretical molecular weight （Mw） of 24.09 kDa， an isolectric point （pI） of 5.05， a GRAVY value of –1.584， and an instability index of 66.51， implying its unstable， hydrophilic， and nuclear-targeted characteristics. CpDHN1 is rich in glutamate， lysine and serine， and it can be categorized as the SKn-type dehydrin with two conserved K-segments and one S-segment. CpDHN1 doesn’t contain any transmembrane helix and its secondary structure is mainly composed of α-helixes. Homology analysis showed that CpDHN1 shares the highest sequence similarity with AtLEA4 （i.e. 46.8%）， while the sequence similarity with another reported dehydrin （i.e. CpDHN） is just 19.4%. Expression analysis revealed that CpDHN1 was expressed in all tested tissues， i.e. root， leaf， and sap， and the transcript level was significantly regulated by drought stress. Moreover， its prokaryotic expression vector was also successfully constructed， and SDS-PAGE showed that CpDHN1 could efficiently accumulate in Escherichia coli. It accumulated a small amount at the theoretical molecular weight of 40 kDa， but a large amount at 55 kDa， supporting that CpDHN1 is an intrinsically unstructured protein. These results lay a solid foundation for further functional analysis and utilization of this special gene in papaya and other species.

Keywords： papaya; late embryogenesis abundant; dehydratin; drought stress; prokaryotic expression

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.12.015

番木瓜（Carica papaya L.）隸屬于雙子葉植物綱番木瓜科番木瓜屬，是一種廣泛種植于熱帶和亞熱帶地區(qū)的特色果樹。番木瓜果實(shí)營養(yǎng)豐富、肉質(zhì)甜美，受到越來越多人的青睞。然而，作為典型的熱帶作物，番木瓜極易遭受寒害、旱害等非生物脅迫的影響[1]。寒害是番木瓜生長和生產(chǎn)上的一個嚴(yán)重問題，番木瓜是的最適生長溫度為21 ℃～33 ℃，生長主要集中在溫度較高的初夏到初秋時期，在這一時期番木瓜植株的株高、莖圍、葉、根、花和果實(shí)等的生長迅速增加，每周平均長出2.5片新葉，而到了寒冷的冬天，番木瓜的生長速率減慢，株高、莖圍和根系的生長幾乎不再增加，葉的平均壽命在這個時期最短[2]。番木瓜植物被認(rèn)為是相對抗旱的物種，它能通過干燥延遲機(jī)制來響應(yīng)干旱脅迫[3]。在干旱脅迫下體內(nèi)大量累積的K+、Na+、Cl?以及脯氨酸也有助于番木瓜的滲透調(diào)節(jié)[4]。但是，由于番木瓜葉面積大、根系分布淺且又是全年結(jié)果，在生產(chǎn)中特別是在坡地栽培條件下易發(fā)生干旱而影響植株生長和果實(shí)品質(zhì)與產(chǎn)量。在我國，番木瓜主要分布于華南地區(qū)如海南、廣東、廣西和福建，此外，在云南和四川也有少量種植。這些地方，在不同程度上受到低溫和干旱脅迫的影響，影響番木瓜的品質(zhì)及產(chǎn)量。如2008年冬季番木瓜種植地廣西南寧受陰冷型災(zāi)害天氣影響，連續(xù)33 d平均溫度為7.2 ℃，導(dǎo)致番木瓜幼苗嚴(yán)重受害[5]。因此，開展番木瓜逆境生物學(xué)研究及相關(guān)分子育種具有重要理論意義和應(yīng)用價值。

脫水素（dehydrin， DHN），又名第二類胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白（late embryogenesis abundant， LEA），最早發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)80年代[6]。因其與植物抵御非生物脅迫的能力高度相關(guān)而受到廣泛關(guān)注，是目前研究較多的一類LEA蛋白[7]。DHN是一種小分子蛋白，一般由82～575個氨基酸構(gòu)成，分子量為9～200 kDa，富含甘氨酸和賴氨酸，缺乏半胱氨酸和色氨酸，具有高度的親水性[8]。DHN包含3類高度保守的基序，即K、S和Y片段。根據(jù)這3類基序的存在與分布順序，脫水素可以分為YnSK2、Kn、SKn、KnS和Y2Kn等5種類型[9]。研究表明，DHN基因與生物的抗逆性密切相關(guān)，當(dāng)植物遭受低溫、干旱和鹽害等逆境條件脅迫時，DHN在細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)[10]。過量表達(dá)DHN類基因可以提高擬南芥、水稻、煙草、草莓、酵母和大腸桿菌等的抗寒、抗旱或耐鹽能力[11-14]。

研究組前期報道了一個番木瓜脫水素基因CpDHN，該基因編碼93個氨基酸，屬于KS型脫水素;該基因的表達(dá)在根和葉片中均受干旱脅迫顯著誘導(dǎo)[15]。本實(shí)驗(yàn)研究另一個不同類型的番木瓜脫水素基因CpDHN1的序列特征、表達(dá)特性及原核表達(dá)情況。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

本研究的植物材料為‘臺農(nóng)二號’番木瓜組培苗。番木瓜的基因組數(shù)據(jù)下載于Phytozome v12（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html），轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)下載于NCBI SRA數(shù)據(jù)庫（https：//www. ncbi. nlm.nih.gov/sra/）。

植物總RNA取試劑盒TransZolTM Plant購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒Takara PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser 購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司，質(zhì)粒提取試劑盒Plasmid DNAMini KitⅠ購自O(shè)mega Bio-Tek公司。膠回收試劑盒Gel Extraction Kit購自O(shè)mega Bio-Tek公司，高保真酶Takara PrimerSTAR MaxDNA Polymerase購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司，限制性內(nèi)切酶均購自美國New England Biolabs（NEB）公司，重組克隆試劑盒ClonExpress II One Step Cloning Kit（C112-02）購自諾唯贊公司，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。各對引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 ?方法

1.2.1 ?CpDHN1基因克隆 ?以提取番木瓜總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，以研究組從頭組裝的轉(zhuǎn)錄組獲得CpDHN1的轉(zhuǎn)錄本序列設(shè)計該基因5'和3' UTR引物對（CpDHN1F：5'-ATTGAT CTTCGTTCGGAGTTT-3'和CpDHN1R：5'-ATC CCACAAGGAAGGAAACAG-3'），以及在開放讀碼框（ORF）的兩側(cè)設(shè)計包含可以跟pET-32a（+）載體進(jìn)行同源重組同源臂的引物對（CpDHN1HF：5'-ACCGACGACGACGACAAGATGGCTGAACACCACGAGAGC-3'和CpDHN1HR：5'-GCAGCCG GATCTCAGTGGTTAATCTGACGTCTCTTTCTT-3'），參照文獻(xiàn)[15]進(jìn)行基因的克隆、測序并構(gòu)建pET-32a（+）-CpDHN1原核表達(dá)載體。

1.2.2 ?CpDHN1基因序列分析 ?對CpDHN1基因的ORF進(jìn)行分析并翻譯成蛋白質(zhì)，對CpDHN1編碼蛋白的理化性質(zhì)、親水性/疏水性、進(jìn)行分析預(yù)測、跨膜結(jié)構(gòu)以及二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析預(yù)測，將CpDHN1蛋白與已知的部分脫水素進(jìn)行多序列比對并繪制進(jìn)化樹。

1.2.3 ?CpDHN1基因的表達(dá)特性分析 ?參照文獻(xiàn)[16]，利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（SAMN09096786）分析基因在根、葉片和韌皮部樹液中的表達(dá)模式及其對干旱脅迫的響應(yīng)模式，植株為3月齡的種子苗，以正常澆水的作為對照，斷水10 d和20 d分別定義為輕度和重度干旱脅迫，每個處理設(shè)置2個生物學(xué)重復(fù)。

1.2.4 ?CpDHN1基因在大腸桿菌BL21中的表達(dá) ?將重組質(zhì)粒pET-32a（+）-CpDHN1和對照質(zhì)粒pET-32a（+）分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株BL21，分別命名為BL-CpDHN1和BL-pET32a。挑取菌落PCR正確的單克隆于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，分別吸取100 μL過夜培養(yǎng)的菌液于10 mL含有相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、250 r/min搖床培養(yǎng)1～2 h，至OD600為0.6，加入IPTG至終濃度為0.8 mmol/L，于37 ℃、250 r/min搖床誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h，細(xì)胞裂解后離心，取上清進(jìn)行SDS- PAGE分析。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?CpDHN1基因克隆

以CpDHN1F/R為引物、番木瓜葉片反轉(zhuǎn)錄的cDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，成功擴(kuò)增到1條約700 bp的特異條帶（圖1）。然后，以第一輪PCR產(chǎn)物作為模板、以CpDHN1HF/R作為引物進(jìn)行第二輪PCR，成功擴(kuò)增到1條約600 bp的清亮條帶（圖1），與預(yù)期片段大小相符。目標(biāo)片段切膠回收后采用同源重組的方法克隆到pET-32a（+），篩選單克隆進(jìn)行測序分析。

2.2 ?序列分析

2.2.1 ?CpDHN1基因的序列分析 ?測序結(jié)果表明，研究分離到的cDNA與基因和轉(zhuǎn)錄本的對應(yīng)區(qū)域完全一致，ORF為636 bp，預(yù)測編碼211個氨基酸（圖2），蛋白含有2個K片段和一個S片段，屬于SKn型脫水素。

2.2.2 ?CpDHN1基因及其編碼蛋白的一級結(jié)構(gòu) ?Protparam分析表明，CpDHN1的理論分子量為24.09 kDa，等電點(diǎn)為5.05;不穩(wěn)定系數(shù)為66.51;總平均疏水指數(shù)（GRAVY）為–1.584，為高度親水的不穩(wěn)定蛋白（表1）。在氨基酸組成上，與CpDHN類似，CpDHN1富含谷氨酸、賴氨酸和絲氨酸（表2）。

2.2.3 ?蛋白的亞細(xì)胞定位和跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測 ?Wolf PSORT分析表明，CpDHN1蛋白主要定位在細(xì)胞核;TMHMM分析表明該蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)。

2.2.4 ?蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 ?通過在線軟件http：//npsa-pbil.ibcp.fr/進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果表明，CpDHN1的二級結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋為主（表3）。

2.2.5 ?多序列比對與進(jìn)化分析 ?將CpDHN1編碼的氨基酸序列與CpDHN和已報導(dǎo)的10個擬南芥脫水素[13]進(jìn)行多序列比對，結(jié)果顯示，所有脫水素蛋白至少含有1個K片段，Y片段僅存在于少數(shù)脫水素蛋白中，不同脫水素蛋白的序列差異較大。同源分析表明，CpDHN1與AtLEA4（AT1G20440.1）序列相似性最高，為46.8%，與AtLEA45（AT4G39130.1）最低，為17.2%，而與CpDHN的序列相似性為19.4%（圖3）。進(jìn)一步的進(jìn)化分析表明CpDHN1與擬南芥中同屬于SKn型脫水素的AtLEA4、AtLEA5、AtLE10和AtLEA44聚為一類，CpDHN與擬南芥中同屬于KnS型脫水素的AtLEA8聚為一類，這表明CpDHN1與CpDHN的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖4）。

2.3 ?CpDHN1基因的表達(dá)特性分析

表達(dá)分析顯示，CpDHN1在根、葉片和韌皮部樹液中均有表達(dá)，韌皮部樹液中的表達(dá)豐度最高。隨著干旱脅迫處理時間從10 d延長至20 d，該基因在根和韌皮部樹液的表達(dá)水平均隨處理時間的延長而逐步降低，而在葉片中的表達(dá)水平均隨處理時間的延長而逐步上升（圖5）。

2.4 ?CpDHN在原核細(xì)胞中的表達(dá)

為探討CpDHN能否在原核細(xì)胞中進(jìn)行高效表達(dá)，研究將重組質(zhì)粒pET-32a（+）-CpDHN1和對照質(zhì)粒pET-32a（+）分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，取1%過夜培養(yǎng)的菌液37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD值為0.6后，用0.8 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h，取裂解上清進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果顯示，在對照BL-pET32a細(xì)胞的上清中檢測到1條約20 kDa的特異性條帶，此結(jié)果與pET-32a（+）載體中TrxA- intein融合蛋白的理論分子量為20.4 kDa相符，而CpDHN1在理論分子量40 kDa處觀察到有少量蛋白被誘導(dǎo)，但在55 kDa處大量蛋白誘導(dǎo)表達(dá)（圖6），暗示CpDHN1為固有無結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)（intrinsically unstructural protein， IUP），在SDS- PAGE實(shí)驗(yàn)中，IUPs與SDS結(jié)合較少，它們的表觀分子量通常是真實(shí)分子量的1.2～1.8倍[17]。在擬南芥、玉米、大豆的LEA蛋白中，存在相似的報道[18]。

3 ?討論

番木瓜作為熱帶及亞熱帶地區(qū)廣泛栽培的重要經(jīng)濟(jì)果樹，其研究主要集中于導(dǎo)致番木瓜絕產(chǎn)的病毒病，而鮮見非生物脅迫研究報道。脫水素屬于典型的逆境誘導(dǎo)型基因，在干旱、低溫、高鹽等非生物逆境脅迫下其產(chǎn)物能維持植物細(xì)胞正常代謝以及細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，具有重要的保護(hù)功能[19]。

本研究報道了一個新的番木瓜脫水素基因CpDHN1，該基因的編碼區(qū)內(nèi)無內(nèi)含子，預(yù)測編碼211個氨基酸。雖然其與先前報道的CpDHN的序列相似性僅為19.4%，但2個蛋白在序列特征和理化性質(zhì)上任具有一定的相似性：分子量小，具有高度的親水性，富含甘氨酸和賴氨酸，缺乏半胱氨酸和色氨酸，均含有2類高度保守的基序，即位于C末端的通常由15個高度保守的氨基酸殘基（EKKGIMDKIKEKLPG）組成的K片段和主要由絲氨酸殘基組成S片段。這兩類基序與脫水素蛋白的功能密切相關(guān)，K片段存在于所有脫水蛋白中，含有豐富的賴氨酸，能形成脫水素的重要功能結(jié)構(gòu)—雙親性的α-螺旋[20]，通過疏水性作用與蛋白的變性位點(diǎn)相結(jié)合，防止蛋白變性，同時通過親水性作用排斥變性蛋白，從而使變性蛋白自行恢復(fù);S片段后常跟隨有能與蛋白磷酸激酶結(jié)合的EDD或DDE位點(diǎn)，有研究表明S片段的磷酸化有助于脫水素在信號肽的引導(dǎo)下進(jìn)入細(xì)胞核，并且還能增加蛋白的鈣結(jié)合能力[21-23]。根據(jù)K片段和S片段基序的分布順序，CpDHN屬于KnS型脫水素，而CpDHN1屬于SKn型脫水素[24]。脫水素的結(jié)構(gòu)與其性質(zhì)之間存在緊密的聯(lián)系。KnS是一類酸性蛋白質(zhì)，多含有1～3個K片段和1個S片段，主要由低溫和干旱誘導(dǎo);SKn是一類酸性蛋白質(zhì)，多包含1個S片段和2～3個K片段，它們主要由低溫誘導(dǎo)[25]。

脫水素提高植物抗逆能主要表現(xiàn)為對生物膜和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定作用，從而降低逆境對植物細(xì)胞的傷害。其作用的分子機(jī)理目前尚不清楚，可能存在如下幾種機(jī)制：與細(xì)胞膜結(jié)合，維持膜的穩(wěn)定性和完整性;通過螯合作用起到保護(hù)細(xì)胞膜的作用，通過與水分子、糖類等結(jié)合，作為脫水保護(hù)劑，捕獲更多的水分到細(xì)胞內(nèi)，螯合各種金屬離子、活性氧等，清除活性氧自由基，保護(hù)細(xì)胞免受脅迫傷害;具有維持或提高生物酶活性的功能;清除植物細(xì)胞中的活性氧自由基，從而降低低溫、干旱等逆境導(dǎo)致的活性氧自由基增加而造成細(xì)胞膜系統(tǒng)的損傷[24]。

為進(jìn)一步揭示CpDHN1的生物學(xué)功能，研究還構(gòu)建了CpDHN1的原核表達(dá)載體。SDS-PAGE分析證實(shí)其蛋白可在大腸桿菌中高水平積累，但在40 kDa和55 kDa處存在2條特異性的譜帶，這表明CpDHN1可能為固有無結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。這類蛋白在生理?xiàng)l件下缺乏剛性折疊結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)松散，肽鏈呈無規(guī)卷曲構(gòu)象，但卻具有明確功能的蛋白質(zhì)。在SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)中，IUP與SDS結(jié)合較少，它們的表觀分子量通常是真實(shí)分子量的1.2～1.8倍[16]，與本研究結(jié)果相符。研究報道，擬南芥LEA基因ERD10、LEA1-Em6、LEA3-76和LEA4-D113的蛋白分子量（48、16、23、19 kDa）均大于其理論分子量（29.5、9.9、18.1、16 kDa），且將ERD10和LEA4-D113基因在大腸桿菌中過表達(dá)后，導(dǎo)致大腸桿菌的生長受到抑制，這種抑制作用依賴于蛋白質(zhì)的離散區(qū)域[17]。至于CpDHN1在非生物脅迫中的分子機(jī)理及可能的功能還有待深入研究。

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責(zé)任編輯：沈德發(fā)