城市紅樹林系統(tǒng)中微塑料表面細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征分析

付茜茜 李大圳 章宇晴 鄧惠 馮丹 趙媛媛 俞花美 吳曉晨 葛成軍

摘 ?要：以城市紅樹林生態(tài)系統(tǒng)為研究對(duì)象，研究該系統(tǒng)水體中微塑料表面細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性與組分特征。采用野外原位暴露實(shí)驗(yàn)的方法，利用掃描電鏡顯微鏡（SEM）和16S rDNA高通量測序技術(shù)，檢測聚乙烯（PE）、聚苯乙烯（PS）、聚氯乙烯（PVC）和具有可降解性的聚乳酸（PLA）4種不同類型微塑料表面形貌特征和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明：4種微塑料暴露45 d后（標(biāo)記為LPE、LPS、LPVC、LPLA）在其表面均能觀察到明顯微生物聚集體，主要以桿狀細(xì)菌、球狀細(xì)菌為主;不同類型微塑料表面生物膜總量存在顯著差異，表現(xiàn)為LPE>LPLA>LPS>LPVC;4種微塑料表面的細(xì)菌群落主要包括變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes），而水環(huán)境中以藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria_Chloroplast）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）為優(yōu)勢菌群?；诩?xì)菌群落多樣性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)微塑料表面生物膜中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和周圍水體存在顯著差異，各個(gè)類型的微塑料表面細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組分相似。紅樹林系統(tǒng)是微塑料的重要收納場所，研究微塑料表面生物膜微生物群落特征，為進(jìn)一步開展城市紅樹林系統(tǒng)中微塑料的環(huán)境行為與生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供重要參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：紅樹林生態(tài)系統(tǒng);微塑料;細(xì)菌群落結(jié)構(gòu);城市

中圖分類號(hào)：S718.55 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： Recently， microplastic pollution has become a new global environmental problem. Due to the strong hydro-phobicity and large specific surface area， microplastics exposed to the environment can provide a new ecological site for microorganisms. Mangrove system is the “source” and “sink” of pollutants. Urban mangrove system was selected to study the diversity and composition characteristics of the bacterial community structure of the microplastics surface in the system. The method of in-situ exposure experiment， scanning electron microscope and 16S rDNA high-throughput sequencing technology were used to investigate the surface morphology characteristics and bacterial community structure of four types of microplastics （PE， PS， PVC， PLA）. The results showed that obvious microbial aggregates were observed on the surfaces of the four microplastics after exposure （labeled as LPE， LPS， LPVC， LPLA）， mainly bacilli and cocci （shape）. There were significant differences in the total amount of biofilm on the surfaces of the four microplastics， which was represented by LPE>LPLA>LPS>LPVC. The results of high-throughput sequencing presented that the bacterial communities on the surfaces of the four microplastics mainly included Proteobacteria and Bacteroidetes. However， in the water environment， Cyanobacteria_Chloroplast， Proteobacteria， Actinobacteria and Bacteroidetes were the dominant flora. Based on the analysis of the diversity of the bacterial community， it was found that there were significant differences between the bacterial community structure in the microplastic surface biofilm and the surrounding water body， and the bacterial community structure composition on the surfaces of the four microplastics were similar. Since microplastics were accumulated in the mangrove area， it is necessary to study the microbial community characteristics of microplastic surface biofilm in order to provide an important reference for in-depth understanding the environmental behavior and ecological risk assessment of microplastics in urban mangrove systems.

Keywords： mangrove system; microplastics; bacterial community structure; urban

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.12.041

微塑料（MPs）是指粒徑或長度小于5 mm的塑料，來源于大塊塑料垃圾的碎裂或其直接環(huán)境排放，包含碎片、纖維、顆粒、發(fā)泡、薄膜等不同形貌類型[1]。近幾年來，微塑料在全球各地海水、河流湖泊[2]、飲用水[1]、污水處理廠進(jìn)水和出水[3]、沉積物[4]、土壤[5]和生物體[6]中被頻繁檢出，且豐度呈現(xiàn)出不斷增加的趨勢。2020年意大利學(xué)者甚至在人類胎盤中發(fā)現(xiàn)了直徑為5～10 μm的微塑料[7]。微塑料污染已成為當(dāng)前新的全球性環(huán)境污染問題。

因具有疏水性強(qiáng)、比表面積大等特性，暴露于環(huán)境中的微塑料容易被微生物快速定殖，并在其表面形成微生物膜[8]。Li等[9]發(fā)現(xiàn)北大西洋微塑料碎片表面上存在著豐富的微生物群落結(jié)構(gòu)（包括自養(yǎng)生物、異養(yǎng)生物、捕食者和共生體），并將此命名為“plastisphere”（塑料圈）。紅樹林生態(tài)系統(tǒng)是以紅樹植物為主要群落的濕地生態(tài)系統(tǒng)。擁有發(fā)達(dá)根系的紅樹林可通過消浪、緩流、纏繞等作用來捕獲或截留來自海陸環(huán)境中的塑料碎片。鑒于此，紅樹林濕地也被稱為近岸海域（微）塑料的“捕集器”[10]。Xie等[11]在紅樹林系統(tǒng)中的微塑料和根系土壤中均檢測出致病菌（副溶血性弧菌和埃希菌-志賀氏菌），并且發(fā)現(xiàn)二者之間的相互作用可能會(huì)影響紅樹林植物的生長代謝。目前，對(duì)于城市紅樹林系統(tǒng)中微塑料與微生物互作效應(yīng)的研究非常缺乏，其中很多的科學(xué)問題仍不清楚?；诖?，本研究以聚乙烯（PE）、聚苯乙烯（PS）、聚氯乙烯（PVC）和具有可降解性的聚乳酸（PLA）為基質(zhì)，選擇海南大學(xué)東坡湖紅樹林系統(tǒng)作為目標(biāo)城市紅樹林系統(tǒng)，通過45 d的野外原位暴露實(shí)驗(yàn)，探討城市紅樹林生態(tài)系統(tǒng)中微塑料表面細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征。以期為城市紅樹林生態(tài)系統(tǒng)健康評(píng)估、城市（微）塑料污染治理和政策制定提供參考依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

PE、PS、PVC和PLA等4種微塑料購買于安特塑膠原料有限公司，粒徑約為1 mm。E.Z.N. TM Mag-Bind Soil DNA Kit提取試劑盒、Qubit 3.0 DNA檢測試劑盒及細(xì)菌引物341F（CCTACGGGN GCWGCAG）和805R（GACTACHVGGGTATCTA TCC）均由生工生物工程（上海）股份有限公司提供和合成。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 ?方法

1.2.1 ?野外原位暴露試驗(yàn) ?本研究選取海南省海南大學(xué)東坡湖（20.06′ N，110.33′ E）作為微塑料暴露實(shí)驗(yàn)現(xiàn)場試驗(yàn)區(qū)。東坡湖的含鹽度約為23%，適合海桑、紅海欖、木欖、海蓮等紅樹植物生長，該區(qū)域中紅樹林帶寬約100 m，紅樹群落平均高度為2.5～3.5 m。試驗(yàn)開始之前，采用無菌水清洗微塑料表面，除去其表面附著的有機(jī)物和微生物，自然干燥后，將20～30 g不同類型的微塑料分別放入尼龍網(wǎng)紗袋于2020年7月投放于水體中。調(diào)節(jié)樣品使其沉降到0.5 m水深處。暴露45 d后采集樣品，分別標(biāo)記為LPE、LPS、LPVC和LPLA，周邊水域水樣（記為L）為對(duì)照樣品。用無菌水沖洗干凈，分裝后開展相關(guān)研究。

1.2.2 ?微塑料表面形貌觀察 ?使用掃描電子顯微鏡（SEM，TESCAN MIRA3 LMH， Czech）觀察微塑料表面生物膜的表面形貌。觀察前，參照陳濤[8]的方法對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，觀察時(shí)SEM的加速電壓為1.5 kV。以原生微塑料樣品作為空白對(duì)照組（CK）。

1.2.3 ?微塑料表面生物膜總量分析 ?使用結(jié)晶紫染色法分析測定微塑料表面生物膜的總量[8]。在分光光度計(jì)于595 nm下測定脫色液的吸光值，同時(shí)以95%乙醇作為空白。595 nm處的光密度（OD595nm）代表微塑料表面形成的生物膜總量。

1.2.4 ?微塑料表面生物膜DNA提取和測序 ?使用高通量測序技術(shù)分析微塑料表面生物膜細(xì)菌（擴(kuò)增區(qū)域：16SV3-V4）的群落特征。PCR擴(kuò)增體系：10～20 ng模板DNA，9～12 μL無菌水，1 μL Bar-PCR引物F、1 μL引物R、15 μL的2× ieff? Robust PCR Master Mix。PCR初始擴(kuò)增條件：94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s，45 ℃ 20 s，65 ℃ 30 s，5次循環(huán);94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，20次循環(huán);最后在72 ℃下進(jìn)行5 min的最終延伸。PCR二次擴(kuò)增條件：95 ℃ 3 min;94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，5次循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂凝膠電泳初步篩選純化，后續(xù)測序過程基于Illumins MiSeq平臺(tái)由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2.5 ?微塑料表面細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性分析 ?對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、過濾等優(yōu)化處理后，得到的有效序列數(shù)，以97%以上的相似性將序列聚類為操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs）。檢測不同類型的微塑料表面生物膜的Alpha多樣性指數(shù)。Alpha多樣性中的Ace和Chao指數(shù)，描述群落豐富度，指數(shù)越大表示群落的豐富度越高;Shannon和Simpson指數(shù)，描述細(xì)菌群落多樣性;Shannon指數(shù)越大，Simpson指數(shù)越

小，表示細(xì)菌群落的多樣性及均勻度越高。繪制不同類型微塑料表面細(xì)菌和周圍水體的Venn圖。根據(jù)湖水和微塑料樣品的物種注釋結(jié)果和OTUs序列信息，獲得Bray-Curtis距離矩陣，對(duì)各樣品間細(xì)菌菌落的Beta多樣性進(jìn)行進(jìn)一步分析。繪制基于Bray-Curtis距離的熱圖、主協(xié)調(diào)分析（principal coordinated analysis，PCoA）和非度量多維校準(zhǔn)分析（non-metric multidimensional calibration analysis，NMDS）圖，進(jìn)一步對(duì)暴露后的微塑料及周圍水體中的微生物細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性或差異性進(jìn)行探究。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2019軟件對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理;采用SPSS19軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，利用單因素分析（one-way ANOVA）來評(píng)估不同類型微塑料表面生物量之間的差異顯著性;使用Origin 8.0軟件和R語言軟件制圖。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?暴露處理對(duì)微塑料表面形貌的影響

經(jīng)過45 d原位暴露處理后，東坡湖城市紅樹林系統(tǒng)中的4種微塑料表面形貌發(fā)生了明顯的變化。暴露處理前，4種微塑料的表面相對(duì)光滑（圖1A～圖1D）。暴露后，4種微塑料表面幾乎都被不同形態(tài)微生物和顆粒物所覆蓋（圖1E～圖1H）。LPE樣品表面附著團(tuán)聚體狀的球狀細(xì)菌、桿狀細(xì)菌和沉積物顆粒（圖1E），LPS樣品表面清晰觀察到其褶皺附近聚集著大量球菌、桿菌等（圖1F），LPVC表面附著很多粒徑相對(duì)較大的球狀細(xì)菌（圖1H）。LPLA表面匯集了密集成團(tuán)的球菌以及少量的桿菌（圖1G），同時(shí)還形成了大量的微孔結(jié)構(gòu)，分析可能與附生細(xì)菌的降解作用有關(guān)。

2.2 ?暴露處理對(duì)微塑料表面生物膜的影響

由圖2可知，經(jīng)過一定時(shí)間暴露后，LPE、LPS、LPVC和LPLA微塑料表面生物膜的總量均顯著高于原始微塑料（P<0.05），4種類型微塑料表面生物膜的總量差異顯著（P<0.05），其OD595nm值大小依次為：LPE>LPLA>LPS>LPVC。

2.3 ?不同類型微塑料表面細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性分析

對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、過濾等優(yōu)化處理后，L、LPE、LPS、LPVC和LPLA得到的有效序列數(shù)分別為58 053、58 161、43 671、53 835和42 928條。所有處理的測序覆蓋率均高于99%，且稀釋曲線已趨于平緩，表明測序數(shù)據(jù)量大，樣品測序完整。

L、LPE、LPS、LPVC和LPLA的OTUs數(shù)量分別為（579±29）、（2136±107）、（1949±97）、（2065± 103）和（1906±95）（圖3）。各樣品間OTUs數(shù)量表現(xiàn)為L<LPVC<LPS<LPLA<LPE，說明微塑料可從水環(huán)境中富集微生物，且微塑料的類型可能是影響微塑料表面微生物生長的重要因素之一。

4種不同類型微塑料表面生物膜總量和OTUs存在顯著性差異，均表現(xiàn)為：LPE>LPLA>LPS> LPVC，說明塑料表面微生物群落結(jié)構(gòu)特征與塑料材質(zhì)類型有關(guān)。

2.3.1 ?Alpha多樣性 ?經(jīng)過單因素（ANOVA）檢驗(yàn)（圖4），不同類型的微塑料（LPE、LPS、LPVC和LPLA）表面生物膜的Alpha多樣性指數(shù)與周圍水體無顯著性差異（P>0.05），且與塑料材質(zhì)的差異不顯著（P>0.05）。此外，暴露后微塑料樣品的Chao、Ace和Shannon指數(shù)明顯高于水體，Simpson指數(shù)低于水體，表明塑料圈上微生物群落較周邊水環(huán)境豐富，且分布更均勻。

從圖5可見，暴露于東坡湖后，微塑料表面細(xì)菌與其周圍水體共享OTUs數(shù)目為310個(gè)，約占微塑料樣品的15%～17%，表明微塑料表面有利于微生物的附著和生長，對(duì)水環(huán)境中微生物種群有選擇性吸附和富集作用。此外，各樣品也存在獨(dú)有的細(xì)菌OTUs：東坡湖水（L）中83個(gè)（14.34%），LPE表面98個(gè)（4.59%），LPS表面56個(gè)（2.87%），LPVC表面87個(gè)（4.56%），LPLA表面65個(gè)（3.15%）。

2.3.2 ?Beta多樣性 ?基于距離熱圖可發(fā)現(xiàn)（圖6A），在OTUs水平上，暴露后的所有微塑料（LPE、LPS、LPVC和LPLA）與東坡湖水的距離均在0.92以上，說明微塑料表面細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與東坡湖水中的差異顯著。從PCoA和NMDS圖可看出（圖6B、圖6C），PCoA1的解釋度為52.08%，PCoA2的解釋度為27.08%，PCoA1和PCoA2共解釋了79.16%;湖水（L）中細(xì)菌群落與微塑料樣品（LPE、LPS、LPVC和LPLA）間表現(xiàn)出較高的差異性，與距離熱圖結(jié)果一致。

2.4 ?不同類型微塑料表面細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成

基于OTUs聚類結(jié)果，得到各樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及其物種豐度的信息。本研究中共檢測到14個(gè)門、23個(gè)綱、29個(gè)目、34個(gè)科及38個(gè)屬。

在門水平上（圖7A），14個(gè)細(xì)菌物種群門均存在于水體和微塑料樣品上，但樣品間各物種的豐度明顯不同。暴露于水環(huán)境中后，4種微塑料樣品表面上優(yōu)勢菌門為變形菌門（Proteobacteria，28.07%～37.08%）和擬桿菌門（Bacteroidetes，15.85%～24.53%）。相比于其他3種微塑料，LPVC表面含有較為豐富的儉桿菌門（Parcubacteria，12.31%）和綠細(xì)菌門（Chlorobi，7.27%）。在東坡湖水中，豐度前4位的菌為藍(lán)細(xì)菌門（Cyanoba?cteria_Chloroplast，49.50%）、變形菌門（Prote?obacteria，19.77%）、放線菌門（Actinobacteria，14.64%）和擬桿菌門（Bacteroidetes，10.33%），總計(jì)占比高達(dá)94.25%。此外，原位投放的微塑料表面的藍(lán)細(xì)菌門和放線菌門在總量中的比例分別為0.91%～1.11%和2.59%～3.80%，這表明水環(huán)境中微生物在微塑料表面的定殖具有選擇性。

從綱水平來看（圖7B），LPE、LPS、LPVC和LPLA微塑料生物膜中的優(yōu)勢菌群為-變形桿菌綱（Alphaproteobacteria，10.04%～19.42%）、-變形菌綱（Deltaproteobacteria， 5.07%～11.63%）、γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria，6.69%～10.15%）和黃桿菌綱（Flavobacteriia，3.01%～6.96%）。東坡湖水中藍(lán)藻細(xì)菌綱（Cyanobacteria，49.35%）的豐度最高，其次是放線菌綱（Actin?obacteria，14.64%）和-變形桿菌綱（Alphaprote?obacteria，9.95%）。

3 ?討論

本研究探討了城市紅樹林生態(tài)系統(tǒng)中PE、PS、PVC、PLA等4種微塑料表面微生物群落結(jié)構(gòu)特征。結(jié)果表明，暴露于城市紅樹林生態(tài)系統(tǒng)中的微塑料表面附著有大量的微生物，主要以球菌和桿菌為主，與前人的報(bào)道一致[9， 12-13]。具有較大比表面積的發(fā)泡類微塑料可從水環(huán)境中吸附蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)而吸引更多的微生物在其表面定殖[9， 12]。4種不同類型微塑料表面生物膜總量和OTUs均表現(xiàn)為LPE>LPLA>LPS>LPVC。PLA的合成原料中包含淀粉、糖類等物質(zhì)，可為環(huán)境中微生物的生長活動(dòng)提供營養(yǎng)物質(zhì)。在本研究中，PE微塑料為發(fā)泡類材質(zhì)，PLA為可生物降解塑料，PS和PVC塑料是普通樹脂顆粒，因此，發(fā)泡類PE和可生物降解的PLA更易于細(xì)菌微生物的快速定殖?；贐ray-Curtis距離的熱圖、PCoA和NMDS圖分析顯示，湖水（L）中細(xì)菌群落與微塑料樣品（LPE、LPS、LPVC和LPLA）間表現(xiàn)出較高的差異性，暴露于城市紅樹林生態(tài)系統(tǒng)中后，LPS和LPLA距離最為靠近，說明LPS和LPLA微塑料表面生物膜的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似。LPVC與其他微塑料樣品相隔較遠(yuǎn)，表明LPVC微塑料表面生物膜具有不同的微生物細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。從細(xì)菌群落的多樣性分析結(jié)果可看出，微塑料的類型或結(jié)構(gòu)是影響其表面定殖微生物群落多樣性的關(guān)鍵因素之一。

本研究的微塑料表面除了微生物外，在SEM上還觀察到大量的沉積物顆粒附著在微塑料表面，與Tu等[13]報(bào)道結(jié)果相似，這可能表明微塑料表面的部分微生物是來源于沉積物。在本研究中，未在微塑料的SEM圖上觀察到硅藻、絲狀菌等微生物，這可能與暴露水環(huán)境的類型以及其中的微生物優(yōu)勢菌群有關(guān)聯(lián)。此外，暴露后微塑料表面細(xì)菌群落的多樣性顯著高于水環(huán)境，表明微塑料可從城市紅樹林生態(tài)系統(tǒng)中選擇性富集微生物，并為生長在該系統(tǒng)中的微生物提供新的棲息場所。本研究結(jié)果與Keswani等[14]報(bào)道一致，微塑料可以作為病原體、糞便指示生物和有害藻類在水生環(huán)境中持續(xù)存在和傳輸?shù)闹匾d體。

在本研究中，變形菌門和擬桿菌門是微塑料表面細(xì)菌的優(yōu)勢菌群，其相對(duì)豐度分別占細(xì)菌群落的19.77%～37.08%和10.33%～24.53%。Jiang等[15]通過對(duì)長江口潮間帶上微塑料表面生物膜的群落結(jié)構(gòu)特征調(diào)查發(fā)現(xiàn)，變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）是主要的優(yōu)勢菌群。陳濤[8]發(fā)現(xiàn)暴露于煙臺(tái)養(yǎng)馬島扇貝養(yǎng)殖區(qū)的微塑料表面微生物物種群門為33～43，其中變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）是絕對(duì)優(yōu)勢菌群。De Tender等[16]通過將塑料垃圾原位投放于比利時(shí)港口，變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）是PE微塑料表面的主要菌群。

隨著微塑料表面生物膜的形成及懸浮性顆粒物的附著，表面顏色加深，其密度增加，粒徑減小[8]，進(jìn)而使得其沉降速度加快[17]。此外，微生物作用可加速破壞微塑料物理化學(xué)結(jié)構(gòu)的完整性，使得微塑料表面粗糙度增加，甚至出現(xiàn)裂痕[8]。相關(guān)變化進(jìn)一步影響微塑料的表面風(fēng)化、沉降、降解、與污染物的互作效應(yīng)等一系列環(huán)境行為過程。

此外，暴露于水環(huán)境中的微塑料也是病原菌（如弧菌屬、假單胞菌屬等）的棲息場所[9， 13， 18]。棲息在城市紅樹林生態(tài)系統(tǒng)中的生物攝食或攜帶致病微生物后，將會(huì)對(duì)生物甚至人類構(gòu)成重大威脅。因此，城市紅樹林生態(tài)系統(tǒng)中微塑料表面附著的致病菌的特征及微生物群落的定殖對(duì)微塑料環(huán)境行為的影響將是后續(xù)研究的重點(diǎn)。

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責(zé)任編輯：黃東杰