楊樹銹病病原菌的分子鑒定及防治措施

莫丁山

【摘要】青楊鑄病是互助縣楊樹人工林和天然林的重大病害之一，在純林或落葉松混交林中均普遍發(fā)生并造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，該研究對互助縣南門峽林場楊樹銹病病原菌進(jìn)行了分子鑒定，為明確其正真的病原菌種類并總結(jié)了防治措施。

【關(guān)鍵詞】楊樹 銹病 分子鑒定 防治技術(shù)

1 病害調(diào)查

2015-2017年，在互助縣南門峽林場選取10塊標(biāo)準(zhǔn)地，7～10月每隔1月調(diào)查一次青楊銹病發(fā)病率與病情指數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)地的設(shè)置為每塊標(biāo)準(zhǔn)地面積約為30×30m₂，每塊標(biāo)準(zhǔn)地內(nèi)隨機(jī)選4～5行青楊，各行再每隔3株選取1株，隨機(jī)摘取上、中、下三個(gè)部位青楊葉片，總調(diào)查30～50株，葉片總數(shù)不少于800片；對于散生的青楊，依據(jù)實(shí)際分布情況隨機(jī)選取調(diào)查株。青楊銹病病害嚴(yán)重度分級參照曹支敏等的分級標(biāo)準(zhǔn)，見表1。

經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，青楊銹病主要危害青楊苗木和新生葉片，導(dǎo)致未成熟芽早落，該病害于5-6月在葉背出現(xiàn)退綠斑點(diǎn)并產(chǎn)生夏孢子堆，并產(chǎn)生桔黃色小泡，破皮后散出黃粉堆，嚴(yán)重時(shí)黃粉布滿整個(gè)葉背，9月，葉正面出現(xiàn)銹紅色斑點(diǎn)，并逐漸變成棕色至褐色的冬孢子堆，葉子提前脫落，樹木長勢變?nèi)跻资芷渌≡锴秩尽?/p>

2 病原菌分子鑒定

2.1 夏孢子DNA提取

取夏孢子DNA，用滅菌載玻片刮取新鮮夏孢子堆于滅菌研缽中研磨，置于1.5mL離心管內(nèi)，具體加樣步驟如下：①加20μl的Lysozyme溶液，混合，室溫靜置6min；②加30μl的EDTA Buffer，混合，室溫靜置5min；③加200μl的Solution A，振蕩，65℃保溫10min；④加400μl的Solution B，劇烈振蕩15S；⑤加650μl的So-lution C，混合；12，000rpm離心1min，棄上層，將無色下層移人預(yù)先置于1.5ml離心管上的Filter Cup中，12，000rpm離心1min。⑥棄Filter Cup，在濾液中加入450μl的DB Buffer，混合均勻。將試劑盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。⑦將上述操作的混合液轉(zhuǎn)移至Spin Column中，12，000rpm離心1min，棄濾液。⑧將500μl的Rinse A加入至Spin Column中，12，000rpm離心1min，棄濾液。將700μl的Rinse B加入至Spin Column中，12，000rpm離心1min，棄濾液。⑨將Spin Column安置于CollectionTube上，12，000rpm離心1min。⑩將Spin Column安置于新的1.5ml的離心管上，在Spin Column膜的中央處加入60μl的滅菌蒸餾水或Elution Buffer，室溫靜置1min。12，000rpm離心1min洗脫DNA。

2.2 PCR擴(kuò)增及擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測

擴(kuò)增引物為：ITS1-F和ITS4-B GardesM、B runs T D。

反應(yīng)體系為：2μL摸板DNA、36.5μL ddH2O、2μL MgCl2（25mm ol L-1）、5μL10×PCR Buffer，0.5μLdNTPS（10mm olL-1）、1μL⑩ITSI-F（10μm of L-1）、1μL ITS4-B（10μm of L-1）、4U Taq酶（生工）。

反應(yīng)條件：61℃1′15″，93℃1min，55.3℃1′15″，72℃1′30″，30cycles，72℃ 10min，4℃保存。反應(yīng)前將底物在95℃溫育5min，然后迅速置-20℃保存。采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，并成像。

2.3 rDNA-ITS序列測序及同源性比對

以夏孢子的ITS1和ITS4區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行全序列測定（金唯智生物科技（北京）有限公司），并將獲得的DNA序列在NCBI上進(jìn)行比對。將rDNA-ITS序列PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，所得結(jié)果比對，結(jié)果顯示與Melampsora larici-populina序列同源性為99%。rDNA-ITS序列長度為663bp?；贜ei's（1978）構(gòu)建無偏遺傳距離的系統(tǒng)樹狀圖，系統(tǒng)樹狀圖顯示實(shí)驗(yàn)種與Melampsora larici-populina（DQ234698） ITS序列聚為一類，同源性為99.8%。明確該菌為落葉松楊柵銹菌（Melampsora larici-populina）。

3 防治技術(shù)

青楊林是一個(gè)生態(tài)經(jīng)濟(jì)系統(tǒng)，對楊樹病害的防治不能孤立地、片面地進(jìn)行，而應(yīng)從楊樹林生態(tài)系統(tǒng)的總體出發(fā)，以預(yù)防為主，有機(jī)地運(yùn)用林業(yè)、生物、化學(xué)等綜合防治措施，達(dá)到有效地控制病害的目的。

3.1 有效的預(yù)防措施

在有條件的地方增施一些磷（P）、鉀（K）肥，控制氮（N）肥，提高林木抗病力，在田間管理上，應(yīng)注意及時(shí)清除帶病落葉，減少病菌的侵染來源。另外，由于夏孢子大多降落在離其發(fā)生處300米的范圍內(nèi)，青楊育苗區(qū)應(yīng)選擇遠(yuǎn)離發(fā)病區(qū)300米以外的安全地帶，防止大面積青楊林的病菌孢子擴(kuò)散傳播到苗圃，減少苗木發(fā)病。

3.2 化學(xué)防治措施

防治楊樹銹病應(yīng)在早春用藥，避免傳播。早春時(shí)及時(shí)發(fā)現(xiàn)顏色鮮艷并存在畸形生長的芽，摘除病芽，并及時(shí)銷毀，對防止夏孢子擴(kuò)散侵染效果十分顯著，可大大降低銹病發(fā)病率。也可以在早春階段，采取摘除病芽和藥劑防治相結(jié)合的防治手段，控制病害發(fā)生。對已發(fā)病的苗圃，可噴灑50%多菌靈800倍液，對已發(fā)生銹病的幼樹和大樹，在發(fā)病初期，可噴灑50%代森銨水劑100倍液、退菌特500～1000倍液、25%三唑酮可濕性粉劑1000倍液，或噴灑0.3～0.4度石硫合劑，有一定的效果。發(fā)生嚴(yán)重時(shí)，應(yīng)在第一次用藥后15～20天噴第二次，連噴2～3次。

3.3 選育抗性品種

目前也發(fā)現(xiàn)了一些與楊樹抗病性相關(guān)的基因或分子標(biāo)記，而采用分子標(biāo)記定位抗性基因和構(gòu)建抗病基因連鎖遺傳圖譜技術(shù)，結(jié)合傳統(tǒng)抗病選種育種方法，正成為楊樹抗病育種先進(jìn)模式。

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