丹參酮對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎牙周組織中OPG、RANKL的影響

李春年 楊冬茹

隨著我國(guó)進(jìn)入人口老齡化社會(huì)，牙周病作為口腔的兩大主要疾病，具有隨著年齡增高發(fā)病率增高的趨勢(shì)，越來(lái)越受到口腔醫(yī)生和患者的重視。牙周病的主要臨床表現(xiàn)是牙槽骨的吸收，如果能夠抑制牙槽骨的吸收，牙周病的進(jìn)展就會(huì)被明顯抑制。在骨的發(fā)育和抑制過(guò)程中，骨保護(hù)因子（osteoprotegerin，OPG）、破骨細(xì)胞核因子κB受體活化因子配體（ligand of receptor activator of NF-κB，RANKL）起著決定性的作用，能否通過(guò)調(diào)節(jié)牙周組織中的OPG、RANKL對(duì)牙槽骨的吸收情況進(jìn)行改善是本實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)初衷。丹參酮是我國(guó)傳統(tǒng)中藥丹參的提取物，具有抗炎、抗病毒等功效，相比較西藥類抗生素，副作用和不良反應(yīng)小[1，2]。

本研究擬建立大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型，通過(guò)觀察丹參酮對(duì)實(shí)驗(yàn)性牙周炎大鼠牙周組織中OPG、RANKL的影響，了解丹參酮對(duì)牙周炎的治療作用，為丹參酮治療牙周炎提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)參考。

資料和方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

SD雄性大鼠（河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（冀）2013-1-003，編號(hào)：1401042），丹參酮膠囊（河北興隆希力藥業(yè)有限公司，批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z13020110），大鼠骨保護(hù)因子抗體（OPG，武漢博士德公司）；大鼠破骨細(xì)胞核因子κв受體活化因子配體（RANKL，武漢博士德公司），超敏二步法免疫組化檢測(cè)試劑PV9000、濃縮型DAB試劑盒ZLI-9017/9018/9019（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

2.實(shí)驗(yàn)分組

選取3月齡雄性SD大鼠50只，隨機(jī)分為5組，每組10只，正常組（A組）、實(shí)驗(yàn)性牙周炎組（B組）、實(shí)驗(yàn)性牙周炎局部治療組（C組）、實(shí)驗(yàn)性牙周炎丹參酮治療組（D組）、實(shí)驗(yàn)性牙周炎局部+丹參酮治療組（E組）。

3.動(dòng)物模型建立

B、C、D、E、組大鼠 10%水合氯醛腹腔麻醉，以0.2mm的正畸鋼絲穿過(guò)第一二磨牙間隙，結(jié)扎雙側(cè)上頜第一磨牙，建立實(shí)驗(yàn)性大鼠牙周炎模型。

4.動(dòng)物模型鑒定

牙周結(jié)扎后一周，隨機(jī)抽取大鼠，麻醉下檢查鋼絲是否牢固，可見(jiàn)結(jié)扎絲周圍軟垢堆積，牙齦紅腫。牙周結(jié)扎后四周，隨機(jī)抽取大鼠，麻醉下檢查可見(jiàn)牙齦紅腫、探診易出血、可探及牙周袋；處死大鼠，取上頜骨制作HE染色切片，可以觀察到牙周袋形成，結(jié)合上皮向根方增殖。

5.分組處理情況

正常組（A組）：正常飼養(yǎng)12周，不處理。

實(shí)驗(yàn)性牙周炎組（B組）：牙周結(jié)扎4周建立牙周炎模型，牙周炎模型成功后，繼續(xù)原條件飼養(yǎng)8周。

實(shí)驗(yàn)性牙周炎局部治療組（C組）：牙周結(jié)扎4周建立牙周炎模型，牙周炎模型成功后，麻醉下去除結(jié)扎絲，建立牙周炎治療模型，清潔牙周局部，沖洗、上碘甘油，每周牙周局部治療，觀察8周。

實(shí)驗(yàn)性牙周炎丹參酮治療組（D組）：牙周結(jié)扎4周建立牙周炎模型，牙周炎模型成功后，按150mg丹參酮/kg體重大鼠灌胃8周，每日一次。

實(shí)驗(yàn)性牙周炎局部+丹參酮治療組（E組）：在C組的基礎(chǔ)上，同時(shí)按150mg丹參酮/kg體重大鼠灌胃8周，每日一次。

6.牙周組織切片的制作及觀察

大鼠10%水合氯醛腹腔麻醉下，股動(dòng)脈放血處死，迅速取上頜骨，置于10%福爾馬林固定標(biāo)本48小時(shí)，流動(dòng)水沖洗24小時(shí)，于10%EDTA脫鈣液中8周，修整組織塊，常規(guī)包埋，沿第一磨牙近遠(yuǎn)中方向，厚度5μm連續(xù)切片。常規(guī)制作蘇木精-伊紅染色切片，置于光鏡下觀察牙周組織變化。

7.牙周組織免疫組化檢測(cè)及OPG、RANKL的測(cè)定

將牙周組織切片進(jìn)行脫蠟，0.05%胰蛋白酶進(jìn)行抗原修復(fù)，按照試劑步驟要求，分別加入過(guò)氧化物酶阻斷劑、兔抗大鼠抗體、DAB顯色，封片進(jìn)行觀察。

OPG、RANKL免疫組化染色為陽(yáng)性的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞漿染色黃色或棕黃色，根據(jù)染色程度分為：無(wú)染色為陰性（－），染色為淺棕黃色的為弱陽(yáng)性（＋），染色為中等棕黃色的為陽(yáng)性（＋＋），染色為深棕黃色的為強(qiáng)陽(yáng)性（＋＋＋）。采用專業(yè)圖像分析軟件麥克奧迪數(shù)碼圖像分析軟件進(jìn)行牙周組織的陽(yáng)性染色的半定量分析。在400倍鏡下選擇第一磨牙遠(yuǎn)中的牙周膜及牙槽骨進(jìn)行觀測(cè)，每個(gè)部位分層隨機(jī)抽樣選取5個(gè)區(qū)陽(yáng)性區(qū)，測(cè)定平均光密度值（average optical density，AOD），根據(jù)結(jié)果計(jì)算該切片的平均光密度值。

8.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS21.00軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分處理，各組數(shù)據(jù)先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)性分布進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，樣本t檢驗(yàn)分析處理，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)α＝0.05、P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.臨床檢查

A組牙齦無(wú)明顯變化，牙齦色澤正常，牙周探診正常；B組牙齦紅腫，鋼絲周圍牙石、軟垢堆積，探診出血，可探及深牙周袋；C組牙齦稍紅腫，探診不出血，牙周袋探診淺；D組牙齦略紅腫，探診不出血，牙周袋可探及；E組牙齦已不紅腫，探診不出血，牙周袋探診已達(dá)正常深度。

表1 牙周袋深度（±s）

表1 牙周袋深度（±s）

E組與 B、C、D各組比較明顯降低（P＜0.05），C、D 組差別不大（P＞0.05），B組較其他各組明顯升高（P＜0.05）。

組別A組B組C組D組E組只數(shù)10 10 10 10 10探診深度（mm）0.27±0.07 0.73±0.21 0.51±0.17 0.48±0.18 0.26±0.08

2.免疫組化檢測(cè)

（1）牙周組織中OPG的表達(dá)：OPG在牙周組織中，主要表達(dá)于牙周膜成纖維細(xì)胞、骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等，陽(yáng)性染色為黃色或棕黃色顆粒，E組與其他各組比較明顯升高（P＜0.05），C、D組差別不大（P＞0.05），C、D組較A、B組明顯升高（P＜0.05），見(jiàn)圖 1～4。

圖1 牙周組織中OPG表達(dá)情況（B組 OPG免疫組化 ×400）

圖2 牙周組織中OPG表達(dá)情況（C組 OPG免疫組化 ×400）

圖3 牙周組織中OPG表達(dá)情況（D組 OPG免疫組化 ×400）

圖4 牙周組織中OPG表達(dá)情況（E組 OPG免疫組化 ×400）

表2 各組牙周組織中的OPG平均光密度值（AOD值）±s

表2 各組牙周組織中的OPG平均光密度值（AOD值）±s

組別A組B組C組D組E組只數(shù)10 10 10 10 10 AOD值0.125±0.032 0.144±0.042 0.216±0.039 0.229±0.021 0.371±0.089

（2）牙周組織中RANKL的表達(dá)：RANKL在牙周組織中，主要表達(dá)于牙周膜成纖維細(xì)胞、骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等，陽(yáng)性染色為黃色或棕黃色顆粒，E組與 B、C、D 各組比較明顯降低（P＜0.05），C、D組差別不大（P＞0.05），B組較其他各組明顯升高（P＜0.05），見(jiàn)圖 5～8。

表3 各組牙周組織中的RANKL平均光密度值（AOD值）±s

表3 各組牙周組織中的RANKL平均光密度值（AOD值）±s

組別A組B組C組D組E組只數(shù)10 10 10 10 10 AOD值0.115±0.025 0.421±0.057 0.209±0.033 0.229±0.039 0.122±0.033

圖5 牙周組織中RANKL的表達(dá)情況（B組 RANKL 免疫組化 ×400）

圖6 牙周組織中RANKL的表達(dá)情況（C組 RANKL 免疫組化 ×400）

圖7 牙周組織中RANKL的表達(dá)情況（D組 RANKL 免疫組化 ×400）

圖8 牙周組織中RANKL的表達(dá)情況（E組 RANKL 免疫組化 ×400）

討 論

丹參是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，具有祛瘀止痛、活血化瘀的功效，其有效的提取成分丹參酮具有抗菌、消炎、止痛、改善微循環(huán)的作用[3]。在牙周病的治療中，首要的是去除局部刺激因素，配合應(yīng)用抗菌藥物，減少菌斑的再次堆積，西藥類的抗生素易產(chǎn)生耐藥性，且長(zhǎng)期應(yīng)用易導(dǎo)致菌群的失調(diào)。丹參酮作為中藥的提取物，植物類的抗菌藥物，可以很好地發(fā)揮自身優(yōu)勢(shì)[4]。本研究擬通過(guò)觀察丹參酮對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎的炎癥抑制及對(duì)牙槽骨的保護(hù)作用，提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，以期將丹參酮以口服、局部應(yīng)用及牙周緩釋等方式更好的應(yīng)用于牙周病的治療中。

人體內(nèi)的骨組織終生處于不斷改建的過(guò)程中，正常生理狀態(tài)下，成骨細(xì)胞（osteoblast，OB）的骨沉積與破骨細(xì)胞（osteoclast，OC）的骨吸收處于一種平衡的狀態(tài)，但是在病理狀態(tài)下，骨吸收的速度大于骨沉積的速度，骨破壞就發(fā)生了[5]。牙槽骨作為全身骨的一部分，骨代謝的情況也符合此規(guī)律。近些年的研究發(fā)現(xiàn)，骨保護(hù)因子（osteoprotegerin，OPG）、破骨細(xì)胞核因子κB受體活化因子配體（ligand of receptor activator of NF-κB，RANKL）是骨代謝的關(guān)鍵因子，RANKL 通過(guò)與破骨細(xì)胞核因子κB受體活化因子（receptor activator of NF-κB，RANK）的結(jié)合，可以促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化從而加速骨吸收[6]；OPG能夠阻斷RANK與RANKL的結(jié)合，從而抑制破骨細(xì)胞的活性，進(jìn)而減慢或者抑制骨吸收[7]。OPG、RANKL作為骨代謝時(shí)的最直接影響因子，濃度的高低直接影響了牙周炎時(shí)牙槽骨的代謝情況，吸收還是生成[8]。OPG升高，成骨細(xì)胞增多，骨生成速度大于骨吸收的速度[9]；RANKL升高，破骨細(xì)胞增多，骨吸收的速度大于骨生成的速度[10]。這些情況在實(shí)驗(yàn)中也得到了證實(shí)。

在本實(shí)驗(yàn)中，可以觀察到牙周局部治療可以改善牙周炎癥狀況，降低牙周組織中的RANKL，升高OPG，丹參酮對(duì)實(shí)驗(yàn)性牙周炎的治療可以得到局部治療類似的效果。但是局部治療配合丹參酮用藥組，牙周炎的治療效果最為明顯。

總之，牙周病的治療，在去除局部刺激因素的基礎(chǔ)上，應(yīng)該注意發(fā)揮我國(guó)傳統(tǒng)中藥的優(yōu)勢(shì)，興利除弊，使其更好的為口腔臨床服好務(wù)。