功能性復(fù)合膜與人牙周膜干細(xì)胞的生物相容性研究

楊 昊 雷 敏 伊遠(yuǎn)平 支方靜

牙周病是造成成年人牙齒缺失的主要原因，目前牙周治療的目的除了控制局部炎癥外，還要實(shí)現(xiàn)牙周組織的修復(fù)與再生。隨著引導(dǎo)組織再生技術(shù)（guide tissue regeneration，GTR）在臨床的廣泛應(yīng)用，對(duì)生物膜材料的研究也更加豐富多樣，膜材料不僅能起到機(jī)械屏障作用，作為細(xì)胞載體復(fù)合了生長因子的膜材料還能為牙周組織提供更加理想的再生環(huán)境，在牙周組織再生工程中有著重要的地位和作用[1，2]。為了解決生長因子與生物膜復(fù)合后短期內(nèi)降解失活的問題，將緩釋給藥系統(tǒng)（sustained release delivery system，SRDS）引入生物膜的研究，通過提高蛋白類藥物在缺損局部的治療濃度，延長藥物在局部的作用時(shí)間[3，4]。在這類生長因子載體中，天然多糖類化合物基水凝膠被證實(shí)具有較好的生物膜性能[5～13]，其中右旋糖酐是理想的智能凝膠載體材料。有實(shí)驗(yàn)組將緩釋載體系統(tǒng)甲基丙烯酸縮水甘油酯右旋糖酐（dextran-glycidylmethacrylate，dex-GMA）與生長因子重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（recombined human bone morphogenetic protein-2，rhBMP2）相結(jié)合的凝膠微球，復(fù)合到單純殼聚糖引導(dǎo)組織再生膜中，將其制備成具有較好生物活性的功能性復(fù)合膜（functional complex film，F(xiàn)CF）[13，14]，為生物膜研究提供了新的方向。隨著牙周膜干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)及轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的發(fā)展，將牙周膜干細(xì)胞移植于牙周組織缺損處進(jìn)行牙周組織的修復(fù)有望用于臨床治療，因此對(duì)GTR技術(shù)中生物膜的研究也至關(guān)重要。本文將之前實(shí)驗(yàn)組所制備的FCF與人PDLSCs的生物相容性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

資料和方法

一、材料

單純殼聚糖引導(dǎo)組織再生膜（購置于第四軍醫(yī)大學(xué)組織工程中心，圖1）；功能性的復(fù)合膜（FCF[13]）（購置于第四軍醫(yī)大學(xué)組織工程中心，圖2）；Ⅰ型膠原酶（Sigma，美國）；2.5g/L 胰蛋白酶（Amresco，美國）；二甲基亞砜DMSO（Sigma公司，美國）；茜素紅（Sigma，美國）；油紅 O（Sigma，美國）。

圖1 單純殼聚糖膜電鏡圖（SEM ×700）

圖2 復(fù)合載藥微球的殼聚糖引導(dǎo)組織再生膜電鏡圖（SEM ×400）

二、人PDLSCs的分離培養(yǎng)和鑒定

1.人PDLSCs的分離和培養(yǎng)

無菌條件下用刀片刮取離體牙根中1/3的牙周膜組織，剪碎為1mm3組織塊，Ⅰ型膠原酶消化15min后置于6孔板中，在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下孵育，每2～3d換液1次，當(dāng)細(xì)胞爬出達(dá)到80%匯合時(shí)，用有限稀釋法分離培養(yǎng)人PDLSCs[15]。

2.人PDLSCs生長曲線的測定

取第3代PDLSCs，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104/ml，接種于96孔板中，每孔200μl，置于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境中24小時(shí)后，每孔加20μl的MTT液，4小時(shí)后棄上清液，加160μl DMSO，測吸光值（OD 值），以時(shí)間為橫軸繪制細(xì)胞生長曲線。

3.人PDLSCs體外分化能力的鑒定

取第3代細(xì)胞以5×104/ml接種于6孔板中，細(xì)胞匯合至50%～60%時(shí)，換成骨誘導(dǎo)液，每3天換液，至28天時(shí)細(xì)胞呈復(fù)層生長并出現(xiàn)圓形結(jié)節(jié)，茜素紅染色，鏡下觀察并照相。

取第3代細(xì)胞以5×104/ml接種于6孔板中，培養(yǎng)細(xì)胞至80%～90%時(shí)換成脂誘導(dǎo)液，每3天換液，21天時(shí)脂滴形成，油紅O染色并照相。

3.細(xì)胞相容性實(shí)驗(yàn)

（1）浸提液制備：在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下，將FCF（實(shí)驗(yàn)組）及單純殼聚糖膜（對(duì)照組）分別以0.5cm2/ml浸泡在Eagle’s MEM中，在24h、48h和72h時(shí)收集兩組浸提液。

（2）降解液制備：在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下，將FCF（實(shí)驗(yàn)組）及單純殼聚糖膜（對(duì)照組）分別以0.5cm2/ml浸泡在Eagle’s MEM中，在2、4、8周時(shí)收集兩組降解液。

（3）MTT（即 thiazolylblue，噻唑藍(lán)） 法：將PDLSCs以 4×103/ml接種于 96孔板中，每孔100μl，分成兩大組，即浸提液組和降解液組，每組分別設(shè)空白組、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組。培養(yǎng)24小時(shí)后，空白組為單純Eagle’s MEM培養(yǎng)液，對(duì)照組棄培養(yǎng)液加單純殼聚糖浸提液、降解液，實(shí)驗(yàn)組棄培養(yǎng)液加FCF浸提液、降解液，在 2d、4d、7d時(shí)測吸光值（OD值），觀察細(xì)胞在浸提液、降解液中增殖的情況。

（4）ALP檢測：分別將浸提液和降解液的空白組、對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組在相同時(shí)間點(diǎn)2d、4d、7d棄去相應(yīng)培養(yǎng)液，使用堿性磷酸酶試劑盒（南京建成）進(jìn)行ALP定量，比較浸提液和降解液對(duì)細(xì)胞分化的影響。

結(jié) 果

一、人PDLSCs的分離培養(yǎng)和鑒定

1.形態(tài)學(xué)觀察：人PDLSCs為多角形細(xì)胞，胞突細(xì)長，核呈圓形或卵圓形（圖3）。

2.生長曲線：人PDLSCs生長曲線呈倒S形，1～2天內(nèi)細(xì)胞數(shù)量無顯著變化，第3天細(xì)胞生長迅速，第8天時(shí)達(dá)高峰，之后細(xì)胞生長速度下降（圖4）。

3.成骨成脂分化：成骨誘導(dǎo)28天時(shí)細(xì)胞復(fù)層生長，可見圓形小結(jié)節(jié)，茜素紅染色見紅色成骨結(jié)節(jié)（圖5a）。成脂誘導(dǎo)21天時(shí)，細(xì)胞復(fù)層生長并有圓形小空泡形成，油紅O染色，鏡下觀察脂滴（圖5b）。

圖3 體外培養(yǎng)的人牙周膜干細(xì)胞

圖4 人PDLSCs細(xì)胞生長曲線圖

圖5 人PDLSCs體外誘導(dǎo)分化

表1 FCF浸提液對(duì)人PDLSCs增殖的作用（OD值，±s）

表1 FCF浸提液對(duì)人PDLSCs增殖的作用（OD值，±s）

*P＜0.05

觀察點(diǎn) 空白組 單純殼聚糖膜24h 48h 72h功能性復(fù)合膜（FCF）24h 48h 72h 2d 4d 7d 0.11±0.03 0.17±0.03 0.22±0.02 0.11±0.04 0.16±0.04 0.24±0.01 0.12±0.02 0.18±0.01 0.23±0.02 0.11±0.03 0.17±0.05 0.22±0.04 0.16±0.01 0.37±0.03*0.47±0.02*0.15±0.03 0.35±0.01*0.44±0.03*0.15±0.02 0.33±0.02*0.43±0.02*

二、細(xì)胞相容性實(shí)驗(yàn)

1.MTT法：細(xì)胞在浸提液、降解液中培養(yǎng)后不同時(shí)間點(diǎn)OD值檢測結(jié)果見表1、2。由表1可以看出，人PDLSCs在普通培養(yǎng)液（空白組）、單純殼聚糖膜的浸提液（對(duì)照組）及FCF浸提液（實(shí)驗(yàn)組）中均有增殖，但在FCF浸提液中增殖明顯高于另外兩組（P＜0.05），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由表2得出， 在三組的降解液中人PDLSCs均有增殖，只有2周的FCF降解液中細(xì)胞增殖明顯高于其他組（P＜0.05），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.ALP檢測：不同時(shí)間點(diǎn)反映ALP活性的OD值檢測結(jié)果見表3、4。由表3可以看出，實(shí)驗(yàn)組浸提液的ALP活性明顯高于空白組及對(duì)照組（P＜0.05），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由表4得出，實(shí)驗(yàn)組2周時(shí)降解液的ALP活性明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4周、8周時(shí)空白組、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組降解液的ALP活性無顯著性差異。

表2 FCF降解液對(duì)人PDLSCs增殖的作用（OD值，±s）

表2 FCF降解液對(duì)人PDLSCs增殖的作用（OD值，±s）

*P＜0.05

觀察點(diǎn) 空白組 單純殼聚糖膜2W 4W 8W功能性復(fù)合膜（FCF）2W 4W 8W 2d 4d 7d 0.11±0.03 0.17±0.03 0.22±0.02 0.11±0.04 0.16±0.04 0.24±0.01 0.12±0.02 0.18±0.01 0.23±0.02 0.11±0.03 0.17±0.05 0.22±0.04 0.13±0.02 0.30±0.03*0.42±0.02*0.12±0.01 0.19±0.01 0.23±0.01 0.11±0.02 0.18±0.01 0.22±0.02

表3 FCF浸提液對(duì)人PDLSCs的ALP活性的影響（OD值，±s）

表3 FCF浸提液對(duì)人PDLSCs的ALP活性的影響（OD值，±s）

*P＜0.05

觀察點(diǎn) 空白組 單純殼聚糖膜24h 48h 72h功能性復(fù)合膜（FCF）24h 48h 72h 2d 4d 7d 0.21±0.02 0.27±0.01 0.32±0.02 0.23±0.01 0.27±0.05 0.32±0.01 0.21±0.04 0.28±0.03 0.31±0.03 0.22±0.03 0.28±0.02 0.32±0.03 0.30±0.03 0.37±0.01*0.45±0.02*0.31±0.04 0.35±0.02*0.47±0.01*0.29±0.01 0.38±0.02*0.46±0.01*

表4 FCF降解液對(duì)人PDLSCs的ALP活性的影響（OD值，±s）

表4 FCF降解液對(duì)人PDLSCs的ALP活性的影響（OD值，±s）

*P＜0.05

觀察點(diǎn) 空白組 單純殼聚糖膜2W 4W 8W功能性復(fù)合膜（FCF）2W 4W 8W 2d 4d 7d 0.21±0.02 0.27±0.01 0.32±0.02 0.23±0.01 0.27±0.05 0.32±0.01 0.21±0.04 0.28±0.03 0.31±0.03 0.22±0.03 0.28±0.02 0.32±0.03 0.26±0.02 0.36±0.03*0.44±0.01*0.25±0.01 0.29±0.02 0.31±0.01 0.23±0.03 0.28±0.02 0.32±0.02

討 論

引導(dǎo)組織再生術(shù)在臨床上已被證實(shí)具有確切的療效，但在恢復(fù)牙周組織的生理功能和修復(fù)較大牙周缺損等方面還未達(dá)到所期望的目標(biāo)[16，17]。近年來，生長因子的運(yùn)用能明顯促進(jìn)牙周組織的修復(fù)和再生，但多數(shù)生長因子在體內(nèi)易于稀釋擴(kuò)散或被蛋白酶降解，難以在組織修復(fù)的全過程中起到持續(xù)、穩(wěn)定的促進(jìn)作用，因此將藥物控釋技術(shù)應(yīng)用于細(xì)胞載體，使生長因子穩(wěn)定釋放，可持續(xù)促進(jìn)細(xì)胞的生長及分化，為牙周組織再生技術(shù)提供了新的研究空間和實(shí)驗(yàn)依據(jù)[18]，因此復(fù)合了生長因子及藥物緩釋系統(tǒng)的功能性復(fù)合膜的研制成為熱點(diǎn)[19，20]。

rhBMP2已被廣泛認(rèn)可是一種性能較好的生長因子，能夠促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的分化，在誘導(dǎo)牙周成骨細(xì)胞的形成及促進(jìn)牙周軟硬組織的修復(fù)方面具有理想的效果。右旋糖酐是一種天然生物材料，生物相容性好且價(jià)格便宜，賦予不同的功能基可以制備不同性能、不同包載和釋藥效能的微凝膠載體[21]。隨著藥物控釋技術(shù)研究的進(jìn)一步深入，右旋糖酐基生物材料通過改性可以制備出智能生物材料（smart materials or intelligence materials），因此是智能給藥領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。將rhBMP2與dex-GMA凝膠微球相結(jié)合的功能性復(fù)合膜，為生物膜的研制打開新的大門。筆者對(duì)膜材料的要求也不僅僅是機(jī)械屏障作用，設(shè)想復(fù)合了生長因子及緩釋系統(tǒng)的生物膜在提供屏障作用的同時(shí)能夠持續(xù)穩(wěn)定地釋放生長因子，來促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞分化，修復(fù)牙周組織缺損。既往實(shí)驗(yàn)所研制的FCF尚缺乏生物活性測試[13]，本實(shí)驗(yàn)主要目的在于檢測FCF的生物活性，為進(jìn)一步開發(fā)及應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本文通過對(duì)FCF及單純殼聚糖膜對(duì)人PDLSCs增殖的比較，發(fā)現(xiàn)FCF浸提液及2周時(shí)的降解液能明顯促進(jìn)人PDLSCs生長，說明該膜對(duì)生長因子有確定的緩釋作用，緩釋作用時(shí)間在2周以上。其浸提液及2周降解液的細(xì)胞ALP活性明顯高于其他組，說明其對(duì)細(xì)胞分化能力的促進(jìn)同樣具有優(yōu)勢作用。通過本文的研究，證實(shí)FCF符合引導(dǎo)組織再生生物膜的要求，其浸提液和降解液無明顯細(xì)胞毒性，支持人PDLSCs的黏附及增殖，具有對(duì)組織細(xì)胞主動(dòng)的誘導(dǎo)分化及加速生長的作用，符合細(xì)胞載體的基本要求，其緩釋作用明確，對(duì)生長因子具有持續(xù)穩(wěn)定的釋放作用。