益氣補腎方對自然流產模型小鼠母-胎界面Foxp3、RORγt、TGF-β及TNF-α蛋白表達研究

胡藍雅文 葉 平，2 葉 騫 王歡歡 王百苗 董盼攀

復發(fā)性流產（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指與同一性伴侶連續(xù)發(fā)生≥2次于孕齡為20孕周之前的妊娠物或胎兒丟失（體質量＜500g）[1]。該病病因復雜，涉及生殖道感染、生殖道解剖結構異常、染色體異常、內分泌異常、血栓前狀態(tài)、免疫紊亂等多種因素。文獻[2]報道，約50%～60%的復發(fā)性流產問題與免疫紊亂有關。調節(jié)性T細胞（Treg）與輔助性T細胞 17（Th17）是“抑制/促炎”免疫細胞對，兩者失衡可引起免疫耐受異常[3]。Foxp3是Treg細胞的特異性轉錄調節(jié)因子，在Treg細胞的胸腺內發(fā)育、外周分布及免疫抑制功能維持等方面具有重要作用。RORγt是Th17的特異性轉錄調節(jié)因子，在抵抗胞外菌感染、介導、炎癥及自身免疫病、腫瘤等過程中發(fā)揮重要作用[4]。研究[5]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxp3 表達受抑制或者RORγt過度表達時，會導致Treg/Th17表達失衡，導致病理妊娠的發(fā)生。此外，Th17/Treg在細胞分化上關系密切，轉化生長因子-β（TGF-β）為低濃度水平時，幼稚T細胞分化為Th17細胞，TGF-β高濃度水平，誘導幼稚T細胞分化為Treg細胞[6-7]。Treg還可釋放TGF-β發(fā)揮免疫抑制作用，維持體內免疫耐受，有利于正常妊娠的維持。Th17細胞選擇性產生炎性細胞因子并誘導腫瘤壞死因子-α（TNF-α）產生；TNF-α 能激活中性粒細胞進入母胎界面組織，最終導致流產[8]。本研究采用自然流產模型小鼠，觀察益氣補腎方對自然流產模型小鼠母-胎界面 Foxp3、RORγt、TGF-β 及TNF-α蛋白表達的影響，為益氣補腎方通過調節(jié)Th17/Treg平衡，防治復發(fā)性流產提供理論依據(jù)。

1 實驗動物與試劑

1.1 動 物 SPF級雌性CBA/J小鼠36只、雄性DBA/2小鼠15只、雄性BALB/c小鼠3只，體質量（20±2）g。雄性DBA/2小鼠購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司 [合格證號：SCXK（滬）2013-0016]，雌性CBA/J、雄性BALB/c小鼠購于北京華阜康生物股份有限公司 [合格證號：SCXK（京）2009-0004]。

1.2 藥 物 益氣補腎方組成：黃芪36g，菟絲子30g，白術 18g，當歸 6g，黨參、陳皮、升麻、柴胡各12g，中藥飲片購于華東醫(yī)藥股份有限公司。制備：用8倍水浸泡，過夜，先煮沸30min，倒出藥液，再加入8倍水，煮沸20min，最后再加5倍水，煮沸20min，合并藥液并減壓濃縮，最后配制成益氣補腎方煎劑（含生藥 1.6g/mL），置-20℃冰箱備用。環(huán)孢素（CsA）溶液制備：灌胃前2h，將1粒CsA膠囊（諾華制藥，批號S0340A；規(guī)格：25mg/粒）放入裝有25mL 0.1%濃度甲醇溶液 [將0.1mL的無水甲醇溶于99.9mL的蒸餾水（避光保存）]的小燒杯中，待膠囊軟化后，用針頭將其刺破，使內容物充分溶解于甲醇溶液，待用。

1.3 試 劑 兔抗鼠多克隆抗體Foxp3（Cell Signaling，批號 2565）；抗 β-Actin兔多克隆抗體（Sigma公司，批號87420416）；抗人/鼠純化抗體RORγt（affymetrix，批號 14-6988）；RIPA 裂解液（北京康為試劑生物科技有限公司，批號00041411）；Marker（美國 Thermo Scientific，批號 00222891）；TEMED（北京康為試劑生物科技有限公司，批號0614H）；30%Acr-Bis（北京康為試劑生物科技有限公司，批號0061410）；SDS-PAGE上樣緩沖液（北京康為試劑生物科技有限公司，批號CW0028A）；兔抗人多克隆抗體 TNF-α（美國 NOVUS，批號 H6-NB600-587）；兔抗人多克隆抗體TGF-β（美國NOVUS，批號H6-NBP1-67698）；HRP Polymer Conjugate（美國 Invitrogen，批號 1639685A）；DAB 顯色液（中杉金橋，批號101095D）。

1.4 儀 器 5417R臺式高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；BCD-208A/D冷藏冷凍箱（中國海爾集團）；IEF雙向電泳系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；化學發(fā)光凝膠成像儀（美國Aplegen公司）；MF-501數(shù)字顯微攝像系統(tǒng)（日本尼康公司）。

2 方法

2.1 造模、分組及給藥 本實驗采用Clark DA等[9]建立的經典自然流產模型小鼠，將CBA/J雌鼠與BALB/c雄鼠2∶1合籠，建立正常妊娠模型，CBA/J雌鼠與DBA/2雄鼠2∶1合籠，建立自然流產模型。每天17∶30～18∶00 合籠，早上 8∶00～8∶30 檢查陰栓，見陰栓日為妊娠第0天；未見陰栓，則繼續(xù)合籠。每日測量孕鼠體質量，觀察腹部是否有明顯隆起并及時排除假孕現(xiàn)象。最終得到正常妊娠模型孕鼠6只，作為正常妊娠模型組；自然流產模型孕鼠30只隨機分為自然流產模型組、環(huán)孢素組、益氣補腎高、中、低劑量組，每組6只。正常妊娠模型組和自然流產模型組小鼠給予0.9%生理鹽水10mL/kg；環(huán)孢素組小鼠給予CsA溶液10mL/kg；益氣補腎高、中、低劑量組分別給予12、24、48g/kg益氣補腎方，連續(xù)14天，每天1次。

2.2 胚胎吸收率 末次給藥取血完畢后，迅速處死小鼠進行解剖，取出胎盤及蛻膜組織，-80℃保存。用鑷子撕開子宮，記錄被吸收胚胎數(shù)和存活胚胎數(shù)。按下列公式計算胚胎吸收率：R=Re/（Re+F）×100%（R表示胚胎吸收率，Re表示吸收胚胎數(shù)，F(xiàn)表示存活胚胎數(shù)）。

2.3 Western-blot法檢測母-胎界面組織Foxp3、RORγt蛋白表達 取-80℃保存的胎盤及蛻膜組織，經冰冷的0.01mol/L PBS充分洗滌后置入玻璃勻漿器中，然后加入預冷的蛋白裂解液研磨成勻漿，4℃ 12 000r/min離心30min，取上清液。采用BCA蛋白濃度檢測試劑盒，每個泳道上樣100μg。70V電泳1h，分離膠120V電泳2h；然后120V恒壓電轉2h至PVDF膜。5%脫脂奶粉37℃封閉2h。一抗4℃過夜，二抗（1∶5000稀釋）37℃ 2h。TBST洗膜3次，每次10min，凝膠成像系統(tǒng)對膜上蛋白條帶進行采集和分析。

2.4 免疫組化法檢測母-胎界面組織中TGF-β、TNF-α蛋白表達 取胎盤及蛻膜組織，浸泡于10%福爾馬林溶液固定，再先后行脫水、透明、浸蠟、包埋等步驟制備組織蠟塊；然后經切片—脫蠟及水化—高壓熱修復—3%H2O2溶液阻斷—加抗體（TGF-β、TNF-α抗體濃度均為1∶100）—加生物素化山羊抗小鼠IgG（兔）—DAB顯色—蘇木素復染—鹽酸酒精分化、返藍—梯度乙醇脫水—二甲苯透明—中性樹膠封片。顯微鏡觀察TGF-β、TNF-α表達陽性表達，用ImageProPlus軟件計算平均光密度值。

2.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s） 表示，多個樣本均數(shù)比較采用方差分析，組間方差分析用F檢驗，有差異的組間兩兩比較用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 各組小鼠胚胎吸收率比較 與正常妊娠模型組比較，自然流產模型組胚胎吸收率顯著升高（P＜0.05）；連續(xù)給藥14天，與自然流產模型組比較，環(huán)孢素組及益氣補腎各劑量組胚胎吸收率均明顯降低（P＜0.05）；益氣補腎各劑量組與環(huán)孢素組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；益氣補腎各劑量組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表 1。

表1 各組小鼠胚胎吸收率比較（只，±s）

表1 各組小鼠胚胎吸收率比較（只，±s）

注：與正常妊娠模型組比較，△P＜0.05；與自然流產模型組比較，*P＜0.05

組別正常妊娠模型組自然流產模型組環(huán)孢素組益氣補腎低劑量組益氣補腎中劑量組益氣補腎高劑量組鼠數(shù)6 6 6 6 6 6總胚胎數(shù)39 40 42 42 36 38吸收胚胎數(shù)4 10 5 6 4 5每只存活胚胎數(shù)6.5±2.2 6.7±0.8 7.0±1.3 7.0±0.6 6.0±1.7 6.3±1.0胚胎吸收率（%）10.3*25.0△11.9*14.3*11.1*13.2*

3.2 各組小鼠母-胎界面組織Foxp3、RORγt蛋白表達比較 與正常妊娠模型組比較，自然流產模型組Foxp3蛋白表達顯著降低、RORγt蛋白表達顯著升高（P＜0.05）。連續(xù)給藥14天，與自然流產模型組比較，益氣補腎中、高劑量組小鼠Foxp3蛋白表達顯著升高，RORγt蛋白表達顯著降低（P＜0.05），益氣補腎中、高劑量組與環(huán)孢素組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表 2、封二圖 1。

表2 各組小鼠母胎界面組織Foxp3、RORγt蛋白表達量比較（±s）

表2 各組小鼠母胎界面組織Foxp3、RORγt蛋白表達量比較（±s）

注：與正常妊娠模型組比較，△P＜0.05；與自然流產模型組比較，*P＜0.05；Foxp3：叉頭翼狀螺旋轉錄因子3；RORγt：維甲酸相關核孤兒受體γt

組別正常妊娠模型組自然流產模型組環(huán)孢素組益氣補腎低劑量組益氣補腎中劑量組益氣補腎高劑量組鼠數(shù) 劑量（g/kg）6 6 6 6 6 6--0.0025 12 24 48 Foxp3 1.407±0.101 0.700±0.147△1.223±0.240*0.873±0.097 1.220±0.241*1.383±0.216*RORγt 0.643±0.112 1.456±0.165△0.950±0.246*1.180±0.182 0.897±0.321*0.670±0.082*

3.3 各組小鼠母-胎界面組織TGF-β、TNF-α蛋白表達比較 與正常妊娠模型組比較，自然流產模型組小鼠胎盤組織TGF-β表達顯著降低（P＜0.05）；TNF-α 表達顯著降升高（P＜0.05）。連續(xù)給藥 14天，與自然流產模型組比較，益氣補腎方各劑量組TNF-α 表達均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；TGF-β 表達均顯著升高（P＜0.05），見表 3、封二圖 2、封三圖 3。

4 討論

復發(fā)性流產屬中醫(yī)“滑胎”范疇。凡是墮胎或者小產連續(xù)發(fā)生3次或3次以上者，稱為“滑胎”，也稱為“數(shù)墮胎”、“屢孕屢墮”,在已婚婦女中發(fā)病率為1%～3%[10]，是常見的妊娠病之一。中醫(yī)認為，滑胎的病機主要有腎虛、脾虛、氣虛、血虛、血熱、氣血兩虛、血瘀等，腎虛和脾虛是滑胎的主要病機，以腎虛最為關鍵。腎主先天，腎虛則沖任不固；脾主后天，脾虛則胎失所養(yǎng)，遂致“胎漏”、“胎動不安”、“墮胎”、“小產”、“滑胎”等。益氣補腎方以李東垣《脾胃論》中的補中益氣湯為主方進行加減，該方重用黃芪、菟絲子為君藥，黃芪性味甘溫，歸肺脾經，具有補中益氣、升陽固表之效；菟絲子性味甘平，入肝腎脾經，補益肝腎，填精益髓而安胎。

表3 各組小鼠母胎界面組織TNF-β、TGF-α表達量比較（±s）

表3 各組小鼠母胎界面組織TNF-β、TGF-α表達量比較（±s）

注：與正常妊娠模型組比較，△P＜0.05；與自然流產模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；TNF-β：腫瘤壞死因子-β；TGF-α：轉化生長因子-α

組別正常妊娠模型組自然流產模型組環(huán)孢素組益氣補腎低劑量組益氣補腎中劑量組益氣補腎高劑量組鼠數(shù)6 6 6 6 6 6 TGF-β 0.084±0.033 0.033±0.015△0.102±0.046*0.112±0.030*0.090±0.010*0.093±0.014*TNF-α 0.051±0.018 0.074±0.013△0.030±0.003**0.033±0.011**0.049±0.025*0.049±0.021*

研究[11]發(fā)現(xiàn)，復發(fā)性流產產生因素很多，免疫失調為重要因素，一般認為正常妊娠中胚胎作為同種異體移植物，有賴于母體對胚胎的免疫耐受，一旦免疫耐受被打破，母體對胚胎產生免疫排斥，則會導致流產的發(fā)生。本研究前期臨床[12]和藥理實驗[13-14]表明，益氣補腎方確有防治復發(fā)性流產的功效，初步研究發(fā)現(xiàn)其機制可能與調節(jié)免疫失衡有關[15]。

Treg與Th17是一對免疫“抑制/促炎”細胞對，其中CD4+CD25+Treg細胞具有免疫調節(jié)功能，在維持機體內環(huán)境穩(wěn)定，誘導移植耐受以及自身免疫性疾病的發(fā)生中發(fā)揮重要作用[16]。臨床和實驗研究[17]證實，調節(jié)性T細胞和Th17細胞在母-胎界面免疫耐受中起著重要作用。CD4+CD25+Treg細胞可使蛻膜環(huán)境呈免疫耐受狀態(tài)而維持妊娠。轉錄因子Foxp3是X染色體上基因編碼的叉頭樣轉錄因子家庭成員，作為CD4+CD25+的轉錄調控因子，起著調節(jié)性T細胞（Treg）發(fā)育和功能維持的重要作用，它通過直接調控多種基因來調節(jié)Treg的活性[18]。Foxp3表達的下降會導致調節(jié)性T細胞的下降，而Foxp3蛋白的過表達也會引起復雜的免疫抑制[19]；Foxp3缺陷的小鼠不能形成CD4+CD25+Treg，并同時患有炎性疾病和自身免疫性疾病，傳輸正常的CD4+CD25+T細胞后可以阻止炎性疾病的發(fā)生[20]。維甲酸相關孤核受體家族中RORγt和RORα是控制Th17細胞分化的關鍵轉錄因子[21]，二者共同介導Th17細胞的分化。劉長明等[22]研究發(fā)現(xiàn)，Th17的轉錄因子RORγt在復發(fā)性流產患者外周血及蛻膜中高度表達，當同時敲除RORγt和RORα后可以完全阻斷Th17的分化，而缺失任何一個都只能部分抑制Th17細胞因子的表達。

TGF-β是Treg/Th17分化發(fā)育的促動因子，具有調節(jié)細胞生長、分化和免疫的功能，還能促進子宮內膜的蛻膜化過程。研究[23]發(fā)現(xiàn)，TGF-β廣泛參與了蛻膜浸潤，在子宮內膜大量表達，在妊娠維持中起重要作用。黨慧敏等[24]研究發(fā)現(xiàn)，復發(fā)性自然流產患者TGF-β明顯低于正常妊娠組。Th17可選擇性地產生炎癥性細胞因子IL-17，進而誘導IL-6、IL-23、腫瘤壞死因子等多種因子的表達[25-26]。而TNF-α是重要的免疫調節(jié)因子和炎癥因子，具有重要的生物學功能，它廣泛存在于女性生殖道、閉鎖卵泡、胚胎、胎盤和黃體細胞等。生理情況下，適量TNF-α可促進滋養(yǎng)層細胞的增殖、分化和凋亡，促進絨毛促性腺激素和孕激素的合成，有利于妊娠的維持[21]。病理情況下，過量的TNF-α反而會抑制黃體功能，引起孕激素的降低導致流產[27]。高濃度的TNF-α具有促進溶解壞死和凋亡的作用，提高子宮平滑肌的興奮性，排除胎盤組織，激活凝血系統(tǒng)，引起血栓從而導致流產[28]。

本研究顯示，益氣補腎方可明顯促進模型小鼠TGF-β 陽性表達（P＜0.05），抑制母胎界面組織TNF-α 表達（P＜0.05，P＜0.01），提示該方可能通過調節(jié)TGF-β，促進祖細胞向Treg方向分化、減少Th17方向分化；Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)益氣補腎方可以促進轉錄因子 Foxp3表達（P＜0.05）、抑制RORγt表達（P＜0.05），提示其可通過調節(jié)Treg/Th17相關轉錄因子表達，從而調節(jié)免疫平衡。綜上說明，益氣補腎方通過調節(jié)Treg/Th17分化、生成，使免疫平衡向Treg細胞方向移動，從而維持免疫耐受，防治復發(fā)性流產。