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    苦杏仁苷磷脂復(fù)合物的制備及理化性質(zhì)研究

    2018-11-24 02:48:54樊麗雅燕飛宏石松利鄭春麗
    西北藥學(xué)雜志 2018年6期
    關(guān)鍵詞:項下混合物磷脂

    樊麗雅,燕飛宏,張 璐,石松利,胡 麗,鄭春麗*

    (1.包頭醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,包頭 014040;2.中國藥科大學(xué)藥學(xué)院,南京 210009)

    苦杏仁苷又名維生素B17,為傳統(tǒng)中藥苦杏仁、郁李仁和桃仁等的主要有效成分,具有潤腸通便和降氣利水的作用。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,苦杏仁苷具有抗腫瘤[1-3]、降血脂[4-5]、抗肺纖維化[6]和抗炎[7]等作用。但由于苦杏仁苷極性大、親水性強、油水分配系數(shù)小,存在跨膜吸收障礙,限制了苦杏仁苷的臨床應(yīng)用。

    磷脂復(fù)合物是指藥物與磷脂按照一定的配比結(jié)合而成的化合物,由于磷脂的結(jié)構(gòu)中同時存在極性與非極性部分,與細(xì)胞膜有高度的親和性,因而有利于藥物分子的跨膜轉(zhuǎn)運。研究表明,磷脂復(fù)合物具有促進(jìn)水溶性藥物的吸收[8-9]和提高生物利用度的作用[10-12]。本研究旨在篩選具有較高復(fù)合率的苦杏仁苷磷脂復(fù)合物的制備工藝,初步考察復(fù)合物的理化性質(zhì),以期提高苦杏仁苷的脂溶性,為進(jìn)一步開發(fā)新型制劑提供參考。

    1 儀器與試藥

    1.1儀器 LC-20AT高效液相色譜儀(日本SHIMADZU公司);SHY-2A 水浴恒溫振蕩器(江蘇金壇市金城國盛儀器廠);BS 124S精密電子天平(德國Sartorious儀器有限公司);SENCO旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司);H01-1C恒溫磁力攪拌器(上海梅穎浦儀器制造有限公司);DSC 204 差熱分析儀(德國Netzsch公司);D8-Advance 型X -射線衍射儀(美國Bruker AXS公司);傅立葉變換紅外光譜儀(德國Bruker公司)。

    1.2試藥 苦杏仁苷原料藥(南京草本源生物科技有限公司);中鏈脂肪酸甘油酯(MCT,阿拉丁試劑公司);正辛醇(南京化學(xué)試劑有限公司);甲醇為色譜純(江蘇漢邦科技有限公司);大豆磷脂(德國Lipoid公司);其他試劑均為市售分析純。

    2 方法與結(jié)果

    2.1苦杏仁苷分析方法的建立

    2.1.1色譜條件 色譜柱:Unitary C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:甲醇-水(25∶75);柱溫:35 ℃;流速:1 mL·min-1;檢測器:UVD;檢測波長:210 nm。

    2.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取苦杏仁苷對照品20 mg,置于50 mL量瓶中,加入體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇溶解后定容,作為儲備液。精密量取上述儲備液1,2,3,4和5 mL,分別置于10 mL量瓶中,加流動相定容至刻度,分別制得質(zhì)量濃度為40,80,120,160和200 μg·mL-1的系列苦杏仁苷標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取適量上述標(biāo)準(zhǔn)液,置于離心管中,以1 200 r·min-1離心10 min,取上清液,按照2.1.1項下色譜條件進(jìn)行測定,以質(zhì)量濃度(x)對峰面積(y)進(jìn)行線性回歸。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=15 338x-51 256(r=0.999 8),苦杏仁苷質(zhì)量濃度在40~200 μg·mL-1范圍內(nèi)線性良好。

    2.1.3回收率 分別精確移取適量儲備液加流動相制成質(zhì)量濃度為40,120和200 μg·mL-1的苦杏仁苷對照品溶液,按照2.1.1項下色譜條件進(jìn)行測定。計算得到低、中、高質(zhì)量濃度回收率分別為100.29%(RSD=0.91%),99.12%(RSD=0.16%)和100.32%(RSD=0.82%)。結(jié)果表明,該方法測得的回收率符合要求,準(zhǔn)確度良好。

    2.1.4精密度 取加樣回收率的中質(zhì)量濃度樣品,按照2.1.1項下色譜條件于1 d內(nèi)進(jìn)樣6次,連續(xù)3 d進(jìn)樣測定精密度。結(jié)果其日內(nèi)精密度為0.73%,日間精密度為1.12%。結(jié)果表明,該方法測得的精密度符合要求,重復(fù)性良好。

    2.2苦杏仁苷磷脂復(fù)合物制備工藝及評價標(biāo)準(zhǔn)的建立 在查閱文獻(xiàn)[13-15]及預(yù)實驗的基礎(chǔ)上選用磁力攪拌法制備苦杏仁苷磷脂復(fù)合物,設(shè)定苦杏仁苷與磷脂的質(zhì)量比為1∶2,藥物的質(zhì)量濃度為4 mg·mL-1。稱取處方量的苦杏仁苷和磷脂溶于適量的有機溶劑中,在30 ℃下反應(yīng)1 h,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去反應(yīng)溶劑。

    利用苦杏仁苷不溶于三氯甲烷而磷脂及復(fù)合物均易溶于三氯甲烷的特性,在反應(yīng)產(chǎn)物中加入適量三氯甲烷充分溶解后,過濾收集沉淀,干燥并稱定質(zhì)量,即得到?jīng)]有與磷脂發(fā)生反應(yīng)的苦杏仁苷的質(zhì)量M1,根據(jù)投藥量M0,可計算得到苦杏仁苷與磷脂的復(fù)合率:

    復(fù)合率=M0-M1/M0×100%

    2.3苦杏仁苷磷脂復(fù)合物的制備

    2.3.1反應(yīng)溶劑 依據(jù)2.2項下操作方法,考察不同溶劑(乙醇、甲醇、四氫呋喃)對苦杏仁苷磷脂復(fù)合物復(fù)合率的影響。結(jié)果表明,所得苦杏仁苷磷脂復(fù)合物的復(fù)合率分別為86.12%±0.83%,99.54%±0.41%和96.44%±1.06%,綜合考慮復(fù)合率與溶劑的毒性確定反應(yīng)溶劑為甲醇。

    2.3.2反應(yīng)時間 依據(jù)2.2項下操作方法,考察不同反應(yīng)時間(0.5,1.0,1.5和2 h)對苦杏仁苷磷脂復(fù)合物復(fù)合率的影響。結(jié)果表明,所得苦杏仁苷磷脂復(fù)合物的復(fù)合率分別為97.46%±0.63%,98.00%±0.21%,95.31%±0.39%和89.37%±0.93%。復(fù)合率隨反應(yīng)時間的增加呈先升高后降低的趨勢,這可能是由于反應(yīng)時間增加磷脂發(fā)生氧化引起的,因此確定反應(yīng)時間為1 h。

    2.3.3反應(yīng)溫度 依據(jù)2.2項下操作方法,考察不同反應(yīng)溫度(20,25,30和35 ℃)對苦杏仁苷磷脂復(fù)合物復(fù)合率的影響。結(jié)果表明,所得苦杏仁苷磷脂復(fù)合物的復(fù)合率分別為99.49%±0.51%,96.04%±0.42%,93.30%±0.88%和89.60%±0.21%,復(fù)合率隨著反應(yīng)溫度的升高逐漸降低,而在20和25 ℃時復(fù)合率均在96%以上,考慮到溫度控制穩(wěn)定性的問題,確定反應(yīng)溫度為25 ℃。

    2.3.4藥物的質(zhì)量濃度 依據(jù)2.2項下操作方法,考察不同藥物的質(zhì)量濃度(2,4,8和16 mg·mL-1)對苦杏仁苷磷脂復(fù)合物復(fù)合率的影響。結(jié)果表明,所得苦杏仁苷磷脂復(fù)合物的復(fù)合率分別為96.67%±0.35%,99.02%±0.60%,95.52%±0.93%和90.87%±0.74%。復(fù)合率隨藥物質(zhì)量濃度的增加呈先升高后降低的趨勢,當(dāng)藥物質(zhì)量濃度為4 mg·mL-1時,復(fù)合物的復(fù)合率最高,可能是因為質(zhì)量濃度過高時,藥物與磷脂在甲醇中的溶解已接近飽和,導(dǎo)致復(fù)合率降低。因此確定反應(yīng)藥物的質(zhì)量濃度為4 mg·mL-1。

    2.3.5藥物與磷脂的比例 依據(jù)2.2項下方法操作,考察苦杏仁苷與磷脂不同投料比例(2∶1,1∶1,1∶1.5和1∶2)對苦杏仁苷磷脂復(fù)合物復(fù)合率的影響。結(jié)果表明,所得苦杏仁苷磷脂復(fù)合物的復(fù)合率分別為96.50%±0.65%,96.59%±01.2%,97.13%±0.33%和96.26%±0.20%,各投料比之間的復(fù)合率無明顯差異,比例為1∶1.5時,復(fù)合率最高,故確定投料比為1∶1.5。

    2.4制備工藝的驗證 根據(jù)2.3項下篩選得到的制備工藝:選擇甲醇為反應(yīng)溶劑,苦杏仁苷與磷脂的質(zhì)量比為1∶1.5,藥物的質(zhì)量濃度為4 mg·mL-1,在25 ℃下反應(yīng)1 h。重復(fù)3次,制備3批苦杏仁苷磷脂復(fù)合物,其復(fù)合率為99.36%±0.22%。說明該制備工藝穩(wěn)定,重復(fù)性良好。

    2.5苦杏仁苷磷脂復(fù)合物的鑒別

    2.5.1紅外光譜分析(IR) 分別取適量的苦杏仁苷、磷脂、苦杏仁苷磷脂物理混合物(質(zhì)量比為1∶1.5)、苦杏仁苷磷脂復(fù)合物,KBr壓片法壓片,在400~4 000 cm-1進(jìn)行紅外光譜掃描,結(jié)果見圖1。

    圖1紅外光譜圖

    A.苦杏仁苷;b.磷脂;c.苦杏仁苷與磷脂的物理混合物;d.苦杏仁苷磷脂復(fù)合物。

    Fig.1 Infrared spectrogram patterns

    A.amygdalin;b.phospholipid;c.amygdalin and phospholipid physical mixture;d.amygdalin-phospholipid complex.

    由圖1可知,苦杏仁苷與磷脂物理混合物的圖譜基本上是苦杏仁苷與磷脂的疊加,各自的特征吸收峰保持不變,說明混合物中二者之間無相互作用。而與物理混合物的圖譜相比,苦杏仁苷磷脂復(fù)合物的圖譜發(fā)生了一定的變化,即苦杏仁苷在2 260.7和3 403.3 cm-1的特征吸收峰消失,磷脂在3 359.5,1 229.0 和1 059.8 cm-1的吸收峰發(fā)生位移。由以上分析可知,苦杏仁苷磷脂復(fù)合物與二者的物理混合物有明顯區(qū)別。

    2.5.2粉末X射線衍射分析(XRD) 分別取適量的苦杏仁苷、磷脂、苦杏仁苷磷脂物理混合物(質(zhì)量比為1∶1.5)、苦杏仁苷磷脂復(fù)合物,進(jìn)行X-射線衍射分析。檢測條件為:測定管壓為40 kV,測定管流為40 mA,衍射分析的范圍為3°<θ<80°,結(jié)果見圖2。

    分析X射線衍射圖譜可知,苦杏仁苷在3°<θ<80°范圍內(nèi)有許多的結(jié)晶峰呈現(xiàn),這表明苦杏仁苷主要以結(jié)晶型形式存在。而磷脂則表現(xiàn)出了無定形的特征,其衍射圖譜顯示為一條寬帶。在其物理混合物圖譜中,仍出現(xiàn)了苦杏仁苷的晶型衍射峰,但是部分被掩蓋,強度有所減弱,說明簡單的物理混合并沒有改變其存在狀態(tài),仍以結(jié)晶狀態(tài)存在。在苦杏仁苷磷脂復(fù)合物的圖譜中,苦杏仁苷的晶型衍射峰在圖譜上完全消失,而主要呈現(xiàn)出磷脂的無定形峰,表明形成的磷脂復(fù)合物改變了其存在狀態(tài),由結(jié)晶型轉(zhuǎn)變?yōu)闊o定形態(tài),藥物高度分散,分子無晶格束縛,自由能大,故有利于改善其溶解性能。

    圖2X-射線衍射圖譜

    A.苦杏仁苷;b.磷脂;c.苦杏仁苷與磷脂的物理混合物;d.苦杏仁苷磷脂復(fù)合物。

    Fig.2 X-ray diffraction patterns

    A.amygdalin;b.phospholipid;c.amygdalin and phospholipid physical mixture;d.amygdalin-phospholipid complex.

    2.5.3差示掃描量熱分析(DSC) 分別取適量的苦杏仁苷、磷脂、苦杏仁苷磷脂物理混合物(質(zhì)量比為1∶1.5)、苦杏仁苷磷脂復(fù)合物,進(jìn)行差示掃描量熱分析。檢測條件為30~270 ℃,升溫時的速率為10 K·min-1。結(jié)果見圖3。

    圖3DSC衍射圖譜

    A.苦杏仁苷;b.磷脂;c.苦杏仁苷與磷脂的物理混合物;d.苦杏仁苷磷脂復(fù)合物。

    Fig.3 DSC diffraction patterns

    A.amygdalin;b.phospholipid;c.amygdalin and phospholipid physical mixture;d.amygdalin-phospholipid complex.

    由圖3可知,苦杏仁苷在79.7 ℃時有較小的吸熱峰,在225.5 ℃時則表現(xiàn)出了較大而尖銳的熔點峰;磷脂在235.1 ℃時則表現(xiàn)出一個小而尖銳的熔點峰。對比可知,苦杏仁苷與磷脂混合物的圖譜仍可觀察到苦杏仁苷的特征峰,表明簡單的物理混合并未改變其熱力學(xué)性質(zhì);而磷脂復(fù)合物圖譜中,苦杏仁苷的特征吸熱峰均消失,在203.7 ℃附近出現(xiàn)了一個較寬的吸熱峰,提示苦杏仁苷形成磷脂復(fù)合物后,其熱力學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變,是一種與物理混合物不同的新物相。

    2.6苦杏仁苷磷脂復(fù)合物的理化性質(zhì)考察

    2.6.1不同介質(zhì)中平衡溶解度的測定 精確移取油酸、MCT、蓖麻油和純凈水各5 mL,再分別向其中加入過量的苦杏仁苷和苦杏仁苷磷脂復(fù)合物,渦旋3 min,混勻,在37 ℃水浴條件下振蕩24 h,取出,以12 000 r·min-1離心10 min,分別移取其上清液,用甲醇稀釋一定倍數(shù)后,按照2.1項下分析方法測定苦杏仁苷、苦杏仁苷磷脂復(fù)合物的平衡溶解度。結(jié)果見表1。

    由表1可知,苦杏仁苷制成磷脂復(fù)合物后,其水中溶解度沒有改變;而在油酸中的溶解度提高了近3倍,MCT中提高了1.6倍,蓖麻油中提高了3.6倍,即在油中的溶解度顯著提高。提示將苦杏仁苷制成磷脂復(fù)合物后,脂溶性顯著提高。

    表1苦杏仁苷、磷脂復(fù)合物在不同介質(zhì)中的溶解度

    Tab.1 Solubility of amygdalin and phospholipid complex in different media

    (n=3)

    2.6.2油水分配系數(shù)(PO/W)的測定 采用經(jīng)典搖瓶法[16],分別取苦杏仁苷、苦杏仁苷磷脂復(fù)合物的正辛醇飽和水溶液5 mL,與水飽和正辛醇溶液5 mL混合,37 ℃下以100 r·min-1恒溫振蕩48 h,使藥物在油水兩相中的分配達(dá)到平衡,取出后以4 000 r·min-1離心10 min。吸取正辛醇層適量,用甲醇稀釋至適宜倍數(shù)后,按照2.1項下分析方法分別測定苦杏仁苷、苦杏仁苷磷脂復(fù)合物的質(zhì)量濃度,并按照下列公式計算油水分配系數(shù)。

    PO/W=CO/CW,其中CO為平衡后正辛醇層中的藥物質(zhì)量濃度;CW為平衡后水相中的藥物質(zhì)量濃度。結(jié)果表明,苦杏仁苷和苦杏仁苷磷脂復(fù)合物的PO/W分別為0.026 0和0.170 6,即將苦杏仁苷制備成磷脂復(fù)合物使其油水分配系數(shù)提高了6.6倍。

    3 討論

    制備磷酯復(fù)合物一般選用介電常數(shù)小的非質(zhì)子傳遞溶劑,如甲醇、丙酮、四氫呋喃和二氯甲烷等[17]。這可能是由于在強極性溶劑中,不利于異種電荷離子間的化合反應(yīng)。結(jié)合實驗結(jié)果,甲醇與四氫呋喃的復(fù)合率均在95%以上,考慮到溶劑的毒性最終選用甲醇作為反應(yīng)溶劑。

    由IR、XRD和DSC研究可知,苦杏仁苷磷脂復(fù)合物不同于簡單的物理混合物。IR圖譜中顯示苦杏仁苷中-CN在2 260 cm-1處的特征吸收峰消失,且沒有新的化學(xué)鍵形成,推測復(fù)合物是通過-CN與磷脂中的極性基團之間的偶極-偶極作用形成復(fù)合物。XRD與DSC圖譜分別顯示與苦杏仁苷相比,復(fù)合物的晶體性質(zhì)與相變特性均發(fā)生改變,這可能是由于苦杏仁苷高度分散于磷脂分子中所致。

    藥物的油水分配系數(shù)與藥物在體內(nèi)的吸收密切相關(guān),是劑型設(shè)計的重要參數(shù)之一[18-19]。理化性質(zhì)的初步研究表明,苦杏仁苷通過制成磷脂復(fù)合物,其油水分配系數(shù)提高了6.6倍,脂溶性明顯增加,推測其原因,一方面由于苦杏仁苷在磷脂中高度分散并呈無定型狀態(tài),另一方面由于苦杏仁苷與磷脂的極性端結(jié)合后,磷脂的非極性端可自由轉(zhuǎn)動包裹住磷脂的極性部分形成一個親脂性的表面[20]。綜合以上2種作用,最終使苦杏仁苷復(fù)合物表現(xiàn)出較大的脂溶性。

    本文制備了苦杏仁苷磷脂復(fù)合物,并通過單因素考察確定了其制備工藝:甲醇為反應(yīng)溶劑,苦杏仁苷與磷脂的質(zhì)量比為1∶1.5,反應(yīng)液中藥物質(zhì)量濃度為4 mg·mL-1,在25 ℃下磁力攪拌1 h。IR、DSC和XRD研究均顯示,苦杏仁苷與磷脂形成了分子型復(fù)合物,復(fù)合物的脂溶性提高,油水分配系數(shù)增大。下一步將研究苦杏仁苷磷脂復(fù)合物腸吸收情況,為進(jìn)一步開發(fā)苦杏仁苷新劑型、提高生物利用度提供實驗基礎(chǔ)。

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