• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    改良抗酸染色法對(duì)泌尿系結(jié)核的臨床診斷價(jià)值

    2018-11-23 08:19:00袁洋劉月英李?yuàn)檴?/span>肖璠陳南山陳華
    西藏科技 2018年10期
    關(guān)鍵詞:改良法染色法抗酸

    袁洋 劉月英 李?yuàn)檴?肖璠 陳南山 陳華

    (1.西藏山南市乃東區(qū)人民醫(yī)院,西藏 山南 856100;2.武漢市金銀潭醫(yī)院,湖北 武漢 430023)

    結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis,MTB)是抗酸桿菌(acid-fast bacilli)的一種類型。結(jié)核菌可侵犯全身各組織器官引起結(jié)核病。結(jié)核病是單一病原菌引起的感染性疾病中死亡率最高的疾病之一,是人類面臨的重大公共衛(wèi)生和社會(huì)問(wèn)題,中國(guó)約有50%的人感染過(guò)結(jié)核分枝桿菌。近年來(lái),由于艾滋病發(fā)病率的不斷攀升、免疫抑制劑等藥物的大范圍使用和耐多藥菌株增多等原因,結(jié)核病的發(fā)生率正不斷回升[22],除了常見(jiàn)的肺結(jié)核、漿膜腔結(jié)核、骨關(guān)節(jié)結(jié)核、消化道結(jié)核、淋巴結(jié)結(jié)核、神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核病之外,原本發(fā)病率很低的泌尿系統(tǒng)結(jié)核病也呈不斷增多趨勢(shì)。根據(jù)報(bào)導(dǎo),現(xiàn)在全世界每年有將近1000萬(wàn)人感染各類結(jié)核病,其中泌尿系結(jié)核(腎結(jié)核、輸尿管結(jié)核、膀胱結(jié)核等)大約占到8-20%.本病早期癥狀不典型易被誤診為慢性尿路感染,常常被使用氟喹諾酮類抗生素反復(fù)抗感染治療。由于氟喹諾酮類抗生素有殺滅部分結(jié)核分枝桿菌的作用,所以前期的治療往往有一定療效,但由于反復(fù)單用氟喹諾酮類藥物短期抗結(jié)核治療,很容易引起耐藥結(jié)核菌株的集中繁殖導(dǎo)致耐藥結(jié)核病,故對(duì)后期結(jié)核病的治療帶來(lái)了很大困難[13]。而泌尿系結(jié)核病往往被發(fā)現(xiàn)時(shí),病變已侵犯到雙側(cè),腎功能已經(jīng)嚴(yán)重受損,故對(duì)人們的身體健康危害極大,嚴(yán)重影響了生活質(zhì)量,而且治愈率低。因此早期診斷對(duì)治療尤為重要。在眾多輔助檢查中,病理診斷作為確診的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”占有重要地位,但該方法多通過(guò)創(chuàng)傷性檢查完成,患者依從性差,診斷的敏感性和陽(yáng)性率較低,操作耗時(shí)費(fèi)力,故臨床上不作為診斷的首選方式。血清學(xué)方法比較方便,但是缺乏敏感性和特異性,往往作為輔助診斷。PPD試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果不易區(qū)分是否卡介苗接種、MTB潛伏感染及NTM感染。近年來(lái),DNA技術(shù)以及其他快速培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展使得檢測(cè)結(jié)核桿菌的時(shí)間大大縮短,但由于價(jià)格昂貴,尚未能在臨床廣泛推廣使用。實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)檢查具有較高的特異性,且操作簡(jiǎn)便,患者無(wú)痛苦。傳統(tǒng)的抗酸染色法(Ziehl–Neelsen染色法)對(duì)結(jié)核桿菌只有3-5%的檢出率,且準(zhǔn)確度低。MTB培養(yǎng)是診斷結(jié)核病的金標(biāo)準(zhǔn),陽(yáng)性率只有25-37%,培養(yǎng)所需時(shí)間長(zhǎng),一般在4-8周,雖然現(xiàn)在有先進(jìn)的BD液體快速培養(yǎng)技術(shù),但是也往往需要2-3周才會(huì)觀察到結(jié)核桿菌生長(zhǎng)[18],這樣往往會(huì)耽誤病情診斷及后續(xù)治療,導(dǎo)致病情進(jìn)展。近幾年,應(yīng)用玻片離心沉淀儀的改良抗酸染色技術(shù)大大提高了結(jié)核性腦膜炎的診斷效率,其原理為首先應(yīng)用玻片離心沉淀儀濃縮腦脊液中的細(xì)胞和分枝桿菌,然后進(jìn)行固定細(xì)胞和破壞細(xì)胞膜蛋白,再行抗酸染色。由于其濃縮原理較離心沉淀法好,避免了菌的浮力和轉(zhuǎn)移損失的問(wèn)題,加之收集的菌沉淀面積小,染色后可以同時(shí)觀察細(xì)胞內(nèi)外的分枝桿菌,所以陽(yáng)性率較離心涂片法提高了將近80%[3].因此,我們推測(cè)改良染色法亦可應(yīng)用于診斷泌尿系結(jié)核患者,該檢驗(yàn)方法有可能在泌尿系結(jié)核的早期診斷中發(fā)揮重要作用。本研究旨在探討建立泌尿系結(jié)核的尿沉渣改良抗酸染色法,并進(jìn)一步明確其臨床應(yīng)用價(jià)值?,F(xiàn)將傳統(tǒng)的抗酸菌涂片染色、改良羅氏培養(yǎng)及改良抗酸染色法三種檢測(cè)方法本別應(yīng)用到泌尿系結(jié)核病例的診斷中,分析比較診斷結(jié)果,以評(píng)估各種方法對(duì)診斷泌尿系結(jié)核病的應(yīng)用價(jià)值。

    1 資料與方法

    1.1 研究對(duì)象

    以2014年5月至2017年11月期間,在武漢市金銀潭醫(yī)院診斷泌尿系結(jié)核病的病人為研究對(duì)象,84例入組病例均符合全國(guó)結(jié)核病分類診斷標(biāo)準(zhǔn),且抗結(jié)核治療有效,并經(jīng)隨訪確診[1]。全部患者24小時(shí)尿沉渣均為首次采集,其中一側(cè)腎結(jié)核、輸尿管結(jié)核病變58例,男性52例,女性6例,患者年齡19-85歲,平均年齡48.15±22.73歲;雙側(cè)病變26例,男性10例,女性16例,患者年齡18-80歲,平均年齡47.11±18.59歲。合并其他系統(tǒng)結(jié)核?。ㄈ缂怪Y(jié)核、髖關(guān)節(jié)結(jié)核、腸結(jié)核、陰囊結(jié)核、結(jié)核性胸膜炎、結(jié)核性腹膜炎、頸淋巴結(jié)結(jié)核、神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核、肺結(jié)核等)50例,約占59.5%.采集時(shí)未經(jīng)抗結(jié)核治療患者48例,已進(jìn)行抗結(jié)核治療患者36例:其中治療1-30天者20例,治療>30天者16例(其中2例耐藥、4例因過(guò)敏等嚴(yán)重藥物不良副反應(yīng)未能完成抗結(jié)核療程)。

    1.2 方法

    每例尿沉渣標(biāo)本同時(shí)送檢傳統(tǒng)的抗酸菌涂片染色、改良羅氏培養(yǎng)及改良抗酸染色法。

    傳統(tǒng)抗酸菌涂片染色法:留取24小時(shí)尿液,靜置,傾去上清液,留取沉淀,通過(guò)離心、涂片、固定、石碳酸復(fù)紅染液染色、沖洗、美藍(lán)染色、沖洗、瀝干、干燥等程序,再使用10×100倍鏡檢。

    改良羅氏培養(yǎng)法:指導(dǎo)患者連續(xù)留取三天尿液標(biāo)本,每天取24小時(shí)尿液。靜置,傾去上清液,留存沉淀部分20-30毫升,均保存在2-8攝氏度的冰箱中?;旌先斓哪蛞哼M(jìn)行培養(yǎng)檢測(cè)。通過(guò)離心、在培養(yǎng)基上接種、在培養(yǎng)箱中孵育的流程進(jìn)行培養(yǎng)操作[16]。定時(shí)判讀有無(wú)菌落生長(zhǎng)。若培養(yǎng)基的斜面上發(fā)現(xiàn)菌落出現(xiàn),則選取菌落做涂片完成抗酸染色的檢查。

    改良抗酸染色法:前期用3-氨丙基-3-乙氣基甲硅烷工作溶液處理載玻片,晾干備用。囑患者留取全天24小時(shí)的尿液,靜置,丟棄上清液,只留下尿液沉淀部分。用粟氏FMU細(xì)胞涂片沉淀器裝盛0.5毫升尿液沉渣,以500-700轉(zhuǎn)/分鐘的速度將標(biāo)本離心3-5分鐘后尿液的有形成分沉積在玻片上,再以4%多聚甲醛溶液將玻片固定15分鐘,通過(guò)水洗并晾干。接下來(lái)使用0.3%Trition-100溶液將玻片浸泡15分鐘,再使用0.1摩爾/升磷酸鹽緩沖液將玻片沖洗3次并晾干[2]。使用0.3%TritonX-100石碳酸復(fù)紅溶液染色玻片5分鐘,再水洗。使用3%鹽酸乙醇脫色1分鐘,水洗、晾干。最后使用堿性亞甲藍(lán)復(fù)染5分鐘后再水洗。自然干燥后,使用10×100倍鏡檢[5]。

    1.3 結(jié)果

    以國(guó)際公認(rèn)的國(guó)家結(jié)核病公職規(guī)劃(RN-TCP)指南為標(biāo)準(zhǔn),統(tǒng)計(jì)檢測(cè)結(jié)果,改良抗酸染色法和傳統(tǒng)的Ziehl-Neelsen染色法所檢測(cè)到的抗酸桿菌均呈現(xiàn)為紅色[8]。在100個(gè)顯微鏡視野內(nèi)可見(jiàn)10-100條抗酸桿菌即為抗酸染色(+),若檢測(cè)值低于以上標(biāo)準(zhǔn)即為抗酸染色陰性。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    使用通用的SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件作數(shù)據(jù)歸納。使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()來(lái)表示計(jì)量資料。通過(guò)McNemar x2檢驗(yàn),分別比較Ziehl-Neelsen染色法、培養(yǎng)法和改良染色法各自對(duì)抗酸桿菌的檢出率;通過(guò)x2檢驗(yàn)法,比較改良法在已治療者和未治療患者中的抗酸桿菌陽(yáng)性的檢出率。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。

    表1 84例患者尿液檢查改良法與傳統(tǒng)法抗酸桿菌檢測(cè)結(jié)果(n)

    表2 84例患者尿液檢查改良法與培養(yǎng)法抗酸桿菌檢測(cè)結(jié)果(n)

    2 結(jié)果

    84例泌尿系結(jié)核病患者尿液改良法和傳統(tǒng)法、培養(yǎng)法抗酸桿菌檢出率分別為57.14%(48/84)和4.76%(4/84)和26.19%(22/84),三者比較之差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1,表2)。

    48例未治療患者尿液檢查改良法和傳統(tǒng)法、培養(yǎng)法的抗酸桿菌檢出率分別為62.5%(30/48)和4.16%(2/48)和37.5%(18/48),三者比較之差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表 3、表4)。

    表3 48例未治療患者的尿液Ziehl-Neelsen染色法與改良法抗酸桿菌檢測(cè)結(jié)果(n)

    表4 48例未治療患者尿液改良法和培養(yǎng)法抗酸桿菌檢測(cè)結(jié)果(n)

    隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng),尿沉渣內(nèi)分支桿菌數(shù)量不斷減少,各種方法對(duì)抗酸桿菌的檢出數(shù)量均顯著降低。但在對(duì)治療時(shí)間大于一個(gè)月的16例病案的檢測(cè)中,改良法仍然檢測(cè)出6例(+),其中一位患者在藥物治療4個(gè)半月后尿沉渣中仍能通過(guò)改良法檢測(cè)出抗酸桿菌。

    未治療和已治療的患者尿液改良法的抗酸桿菌檢出率分別為62.5%(30/48)和50%(18/36),兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,表5)。

    表5 未治療患者與已治療患者尿沉渣改良法的抗酸桿菌檢測(cè)結(jié)果(p<0.05)

    3 討論

    目前在泌尿結(jié)核(腎結(jié)核、輸尿管結(jié)核、膀胱結(jié)核等)的診斷過(guò)程當(dāng)中,醫(yī)學(xué)影像學(xué)和病原微生物學(xué)檢查被最廣泛的接受和使用。在泌尿系結(jié)核疾病的早期,超聲多普勒的診斷意義極其有限,往往多普勒檢查只用于疾病的初篩和復(fù)查[4]。雖然CT或IVU的典型征象對(duì)中晚期泌尿系結(jié)核具有確診的價(jià)值[5],但此時(shí)疾病的治療難度大、治療費(fèi)用昂貴、患者預(yù)后也差。由此可見(jiàn),對(duì)泌尿系結(jié)核病的早期臨床診斷而言,微生物病原學(xué)檢查價(jià)值更大。

    傳統(tǒng)Ziehl-Neelsen染色法,其優(yōu)點(diǎn)在于操作簡(jiǎn)便,對(duì)設(shè)備的要求很低,檢測(cè)時(shí)間短,僅需1-2個(gè)小時(shí)就可以出報(bào)告,而且病人經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)輕,可廣泛用于結(jié)核病的篩查;短板在于其準(zhǔn)確率跟檢驗(yàn)操作者的熟練程度相關(guān),而且檢驗(yàn)靈敏度相對(duì)低,陽(yáng)性率通常在25%-28%[1].而且必須在每毫升標(biāo)本內(nèi)存在 5000-10000條菌的前提下才可檢測(cè)出陽(yáng)性報(bào)告。

    由于有檢測(cè)靈敏度高、特異性強(qiáng),相對(duì)被污染的幾率小、實(shí)驗(yàn)步驟簡(jiǎn)便,對(duì)儀器設(shè)備水平要求低等優(yōu)點(diǎn),而且還可以進(jìn)一步進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)和菌型鑒定來(lái)指導(dǎo)臨床治療,改良羅氏培養(yǎng)法一直被看做臨床上結(jié)核病診斷的"黃金標(biāo)準(zhǔn)”[6]。但此法的缺點(diǎn)也顯而易見(jiàn):實(shí)驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng),可能延誤診斷和治療,而且于前期的經(jīng)驗(yàn)性抗結(jié)核治療可能引起繼發(fā)性耐藥導(dǎo)致檢驗(yàn)結(jié)果不能精準(zhǔn)、適時(shí)的運(yùn)用于臨床。

    近年來(lái)新興的熒光定量PCR、結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT)和GeneExpert等檢測(cè)技術(shù),雖然靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)時(shí)間短[15],但對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境要求極高[19]、診斷成本較高,病人經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)較重,故目前尚未能在臨床廣泛開(kāi)展。

    綜上所述,抗酸染色法雖然存在著陽(yáng)性率低和其他一些劣勢(shì),但目前仍是腎結(jié)核、輸尿管結(jié)核、膀胱結(jié)核等疾病確診的主要方法[2]。

    離心對(duì)傳統(tǒng)的染色和培養(yǎng)法都是必不可少的重要步驟,離心的主要作用是濃集抗酸桿菌,但離心的過(guò)程可能進(jìn)一步丟失掉本身數(shù)量就有限的分枝桿菌。針對(duì)傳統(tǒng)方法離心過(guò)程中可能丟失上浮的抗酸桿菌、分枝桿菌在離心過(guò)程中由于緊貼在管壁而沒(méi)能集中到底部導(dǎo)致進(jìn)一步丟失、在染色水洗的過(guò)程導(dǎo)致分支桿菌丟失等問(wèn)題[7],改良法使用了Cytospin玻片離心沉淀儀,通過(guò)合理使用濾紙等方式,有效地克服了以上弊端,最終使尿液有形成分的沉淀面積(直徑6毫米)遠(yuǎn)小于傳統(tǒng)方法,達(dá)到了濃縮集菌的目的[11]。

    針對(duì)結(jié)核桿菌的細(xì)胞壁富含脂質(zhì),改良法所使用的TritonX-100是一種非離子型表面活性劑[14],它可以溶解分枝桿菌菌細(xì)胞壁所富含的脂質(zhì),以此增加細(xì)菌細(xì)胞壁對(duì)染色劑的通透程度[9],從而增加胞內(nèi)抗酸桿菌的檢出率,提高染色的陽(yáng)性率。

    本研究顯示,對(duì)于腎結(jié)核、輸尿管結(jié)核、膀胱結(jié)核等患者,改良法對(duì)尿液的抗酸桿菌檢出率顯著顯高于Ziehl-Neelsen染色法(P均=0.000),這與在結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液中所作出的研究結(jié)論相符[7]。特別對(duì)于尚未開(kāi)始抗結(jié)核治療的病例,改良法針對(duì)尿液中抗酸桿菌檢出率達(dá)到62.5%,而Ziehl-Neelsen染色法僅為4.16%,其陽(yáng)性檢出率有質(zhì)的提升[10]。這對(duì)于早期發(fā)現(xiàn)、診斷和治療病人意義重大。

    經(jīng)過(guò)有效抗結(jié)核治療的患者,其抗酸桿菌的檢出率呈不斷下降趨勢(shì)。本研究中,對(duì)于2例耐藥和4例因嚴(yán)重藥物副反應(yīng)未能完成抗結(jié)核治療的病例,改良法亦從患者后期的尿液中檢出了抗酸桿菌。提示改良抗酸染色法不僅可用于早期診斷,而且在及時(shí)反映患者病情演變、監(jiān)測(cè)療效等方面,也具有傳統(tǒng)檢測(cè)方法所不具備的治療指導(dǎo)意義。

    傳統(tǒng)的Ziehl-Neelsen染色法在操作過(guò)程中將細(xì)胞結(jié)構(gòu)完全破壞,故無(wú)法檢測(cè)出細(xì)胞內(nèi)的分枝桿菌[12]。但在本研究中,通過(guò)改良法有30例患者檢出了胞內(nèi)的抗酸桿菌。改良法使用特殊處理的載玻片以及粟氏FMU細(xì)胞涂片沉淀器,能夠最大程度的保留尿沉渣標(biāo)本中細(xì)胞的原始結(jié)構(gòu),再通過(guò)TritonX-100使胞內(nèi)菌體更充分的著色來(lái)檢出胞內(nèi)分支桿菌[21]。往往因?yàn)榫w形態(tài)的不典型,細(xì)胞外的抗酸桿菌很容易與一般雜質(zhì)相混淆,改良法對(duì)胞內(nèi)菌的檢出可以成功避開(kāi)這個(gè)矛盾,檢測(cè)特異性更高。

    綜上所述,改良法能提升抗酸桿菌檢出率,可以同時(shí)檢測(cè)出細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)的抗酸桿菌,而且對(duì)抗結(jié)核治療過(guò)程中患者標(biāo)本的檢出陽(yáng)性率也高于傳統(tǒng)Ziehl-Neelsen染色法。因此,通過(guò)改良法檢測(cè)尿沉渣中的抗酸桿菌,對(duì)于泌尿系結(jié)核患者的早期診斷和治療,具有很高的臨床應(yīng)用價(jià)值,且該方法操作簡(jiǎn)單、實(shí)驗(yàn)時(shí)間短,檢驗(yàn)成本低,尿液標(biāo)本容易獲取,患者沒(méi)有二次感染的風(fēng)險(xiǎn),適合在廣大的基層醫(yī)院廣泛開(kāi)展。

    雖然改良法在泌尿結(jié)核病的診斷上較傳統(tǒng)方法有很大改進(jìn),但由于仍可能存在假陰性或假陽(yáng)性報(bào)告[20],其檢測(cè)的特異性和靈敏度需要在臨床中進(jìn)一步驗(yàn)證并指導(dǎo)方法改進(jìn)。由于改良抗酸染色法只能檢出抗酸桿菌,不能分辨是否為結(jié)核分枝桿菌,也不能提供檢出菌是否致病狀態(tài)或潛伏感染狀態(tài)的依據(jù)[17],故臨床上還需要進(jìn)一步分析判斷以決定最終治療。因此,完整的泌尿系結(jié)核診斷仍然需要將病史特點(diǎn)、臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)、影像學(xué)資料、病理學(xué)診斷、診斷性治療的療效等多方面因素相結(jié)合進(jìn)行綜合分析研判,才能精準(zhǔn)提升泌尿系結(jié)核病的及時(shí)診斷率,為早期、規(guī)則的抗結(jié)核治療贏得寶貴時(shí)機(jī)。

    猜你喜歡
    改良法染色法抗酸
    抗酸染色法、細(xì)菌培養(yǎng)法和實(shí)時(shí)熒光PCR法在分枝桿菌檢查中的應(yīng)用比較
    改良法測(cè)量胃管留置長(zhǎng)度對(duì)腦卒中患者胃內(nèi)殘留量監(jiān)測(cè)的影響
    改良法口服硫酸鋇X線下復(fù)位胃扭轉(zhuǎn)的應(yīng)用價(jià)值
    改良法處理人脫細(xì)胞真皮的脫細(xì)胞效果及其與體外細(xì)胞的相容性研究
    初發(fā)翼狀胬肉切除聯(lián)合羊膜移植術(shù)改良法與傳統(tǒng)法療效對(duì)比研究
    PCR技術(shù)、抗酸染色法在肺結(jié)核病理學(xué)診斷中應(yīng)用比較
    改良抗酸染色法在結(jié)核性漿膜炎臨床診斷中的價(jià)值
    痰標(biāo)本替代物的抗酸染色效果分析
    酶組織化學(xué)雙重染色法在腫瘤組織脈管新生研究中的應(yīng)用
    午夜福利18| 成人手机av| 国产不卡一卡二| 色婷婷久久久亚洲欧美| 久久人妻av系列| 在线av久久热| a级毛片在线看网站| www.999成人在线观看| 搡老岳熟女国产| 大型黄色视频在线免费观看| 免费无遮挡裸体视频| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 久久国产精品人妻蜜桃| 热99re8久久精品国产| 亚洲人成电影观看| 天天添夜夜摸| 美女大奶头视频| 国产精品亚洲美女久久久| 亚洲男人的天堂狠狠| 操出白浆在线播放| a级毛片在线看网站| 90打野战视频偷拍视频| 久久精品国产清高在天天线| 99国产极品粉嫩在线观看| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| av电影中文网址| 91大片在线观看| 亚洲成国产人片在线观看| 好男人在线观看高清免费视频 | 欧美国产精品va在线观看不卡| 久久热在线av| 午夜福利成人在线免费观看| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 免费人成视频x8x8入口观看| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 国产精品1区2区在线观看.| 热re99久久国产66热| 正在播放国产对白刺激| 精品日产1卡2卡| 美女扒开内裤让男人捅视频| 国内精品久久久久久久电影| 久久精品成人免费网站| 亚洲av电影在线进入| 88av欧美| 午夜福利,免费看| 久久婷婷人人爽人人干人人爱 | 这个男人来自地球电影免费观看| 日日干狠狠操夜夜爽| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 久久亚洲精品不卡| 亚洲美女黄片视频| 国产午夜福利久久久久久| 女性被躁到高潮视频| 亚洲在线自拍视频| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 精品久久久久久成人av| 精品久久蜜臀av无| 91麻豆av在线| 极品人妻少妇av视频| 久久这里只有精品19| 91国产中文字幕| 黄片大片在线免费观看| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 俄罗斯特黄特色一大片| 深夜精品福利| 老汉色∧v一级毛片| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 成人欧美大片| 国产片内射在线| 91麻豆av在线| 亚洲男人的天堂狠狠| 老司机午夜福利在线观看视频| 日日干狠狠操夜夜爽| 国产精品免费一区二区三区在线| 亚洲国产看品久久| 亚洲国产精品sss在线观看| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 日韩欧美一区视频在线观看| 国产成人欧美| 精品国产国语对白av| 亚洲精品国产色婷婷电影| e午夜精品久久久久久久| 日韩有码中文字幕| 黄片大片在线免费观看| 欧美在线一区亚洲| 国产精品,欧美在线| 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 亚洲人成伊人成综合网2020| 午夜精品久久久久久毛片777| www.www免费av| 性色av乱码一区二区三区2| 亚洲av日韩精品久久久久久密| av在线播放免费不卡| 99国产精品一区二区三区| 99国产精品99久久久久| 99在线视频只有这里精品首页| 国产成人系列免费观看| 99久久99久久久精品蜜桃| 精品久久久久久成人av| 女人精品久久久久毛片| 制服诱惑二区| 久久久久九九精品影院| 免费搜索国产男女视频| 69av精品久久久久久| 久久精品91无色码中文字幕| 两个人视频免费观看高清| 99国产综合亚洲精品| АⅤ资源中文在线天堂| 在线天堂中文资源库| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 露出奶头的视频| 一区福利在线观看| 国产单亲对白刺激| 91大片在线观看| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 国产精品99久久99久久久不卡| 午夜福利影视在线免费观看| 我的亚洲天堂| 国产在线精品亚洲第一网站| 黄片播放在线免费| 91大片在线观看| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 精品国产乱子伦一区二区三区| 亚洲情色 制服丝袜| 天堂影院成人在线观看| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 大码成人一级视频| 国产麻豆69| 热99re8久久精品国产| 桃色一区二区三区在线观看| 桃色一区二区三区在线观看| 国产欧美日韩一区二区精品| 91国产中文字幕| 久久久久国内视频| 国产av又大| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 一夜夜www| 亚洲国产欧美一区二区综合| 色精品久久人妻99蜜桃| 亚洲五月天丁香| 嫁个100分男人电影在线观看| 亚洲精华国产精华精| 男女下面插进去视频免费观看| 麻豆av在线久日| 午夜福利视频1000在线观看 | 最近最新中文字幕大全电影3 | 国产成人精品无人区| 国产成人精品无人区| 十八禁人妻一区二区| 日韩有码中文字幕| www国产在线视频色| 亚洲男人的天堂狠狠| 成人18禁在线播放| 啦啦啦观看免费观看视频高清 | 国产不卡一卡二| 黄片小视频在线播放| 国产一区二区激情短视频| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 亚洲精品中文字幕一二三四区| av网站免费在线观看视频| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 狂野欧美激情性xxxx| 欧美中文综合在线视频| 看片在线看免费视频| 热re99久久国产66热| netflix在线观看网站| 欧美乱码精品一区二区三区| 亚洲av成人一区二区三| 岛国在线观看网站| 中文亚洲av片在线观看爽| 自线自在国产av| 久久精品国产清高在天天线| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 久久精品人人爽人人爽视色| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 两个人视频免费观看高清| 一级,二级,三级黄色视频| 一本久久中文字幕| 精品无人区乱码1区二区| 校园春色视频在线观看| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 我的亚洲天堂| 国产亚洲精品av在线| 99国产精品一区二区三区| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 999久久久国产精品视频| 国产在线观看jvid| 婷婷六月久久综合丁香| 亚洲精品粉嫩美女一区| 亚洲九九香蕉| 大香蕉久久成人网| 香蕉国产在线看| e午夜精品久久久久久久| 国产亚洲欧美精品永久| 亚洲精品国产色婷婷电影| 窝窝影院91人妻| 搞女人的毛片| 日韩中文字幕欧美一区二区| 欧美一区二区精品小视频在线| 好男人电影高清在线观看| 涩涩av久久男人的天堂| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 他把我摸到了高潮在线观看| 91精品三级在线观看| 欧美激情高清一区二区三区| 搡老妇女老女人老熟妇| 久久性视频一级片| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 精品久久蜜臀av无| 人人澡人人妻人| 又黄又粗又硬又大视频| 亚洲三区欧美一区| 乱人伦中国视频| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 亚洲av美国av| 久久精品国产亚洲av高清一级| 国产欧美日韩一区二区精品| 婷婷丁香在线五月| 丁香六月欧美| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 丝袜在线中文字幕| 国产xxxxx性猛交| 天堂动漫精品| 99国产精品一区二区蜜桃av| 99在线视频只有这里精品首页| 91麻豆av在线| 午夜日韩欧美国产| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 怎么达到女性高潮| 手机成人av网站| 久久久久亚洲av毛片大全| 长腿黑丝高跟| 老鸭窝网址在线观看| 日本vs欧美在线观看视频| 91大片在线观看| 国产精品国产高清国产av| 久久人人精品亚洲av| 日本精品一区二区三区蜜桃| 两个人视频免费观看高清| 国内精品久久久久久久电影| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 欧美激情久久久久久爽电影 | 禁无遮挡网站| 成熟少妇高潮喷水视频| 黑人操中国人逼视频| 身体一侧抽搐| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 后天国语完整版免费观看| 成人18禁在线播放| 国产精品国产高清国产av| 精品久久久久久,| 99在线人妻在线中文字幕| 搡老妇女老女人老熟妇| 久久午夜亚洲精品久久| 精品久久蜜臀av无| 国产在线精品亚洲第一网站| 成人永久免费在线观看视频| 成人av一区二区三区在线看| 日本欧美视频一区| 免费高清在线观看日韩| www.www免费av| 欧美黄色淫秽网站| 一级毛片精品| 亚洲成人免费电影在线观看| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 女性生殖器流出的白浆| 99riav亚洲国产免费| 欧美中文日本在线观看视频| 一级毛片精品| 亚洲专区国产一区二区| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 99在线人妻在线中文字幕| 一本久久中文字幕| 久久国产精品人妻蜜桃| 制服丝袜大香蕉在线| 桃红色精品国产亚洲av| 国产成人欧美在线观看| 一级毛片精品| 久久香蕉精品热| 男人舔女人下体高潮全视频| 免费高清在线观看日韩| 男人的好看免费观看在线视频 | 真人做人爱边吃奶动态| 亚洲av五月六月丁香网| 亚洲全国av大片| 十八禁网站免费在线| 又大又爽又粗| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 18禁美女被吸乳视频| 欧美色欧美亚洲另类二区 | 99精品欧美一区二区三区四区| 久久久久国内视频| 中文字幕最新亚洲高清| 无限看片的www在线观看| 国产男靠女视频免费网站| 日韩视频一区二区在线观看| 一进一出抽搐动态| 久久青草综合色| 欧美日韩黄片免| 国产一卡二卡三卡精品| cao死你这个sao货| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 99国产精品99久久久久| 精品电影一区二区在线| 99在线人妻在线中文字幕| 久99久视频精品免费| 国产成人免费无遮挡视频| 12—13女人毛片做爰片一| 99精品欧美一区二区三区四区| a级毛片在线看网站| 国产成人啪精品午夜网站| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 日本欧美视频一区| 99国产精品一区二区蜜桃av| 中文字幕人妻熟女乱码| 怎么达到女性高潮| 色哟哟哟哟哟哟| 欧美激情极品国产一区二区三区| 黄色片一级片一级黄色片| 亚洲av片天天在线观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 嫩草影院精品99| 日本一区二区免费在线视频| 色播在线永久视频| 国产av在哪里看| 国产伦人伦偷精品视频| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产三级在线视频| 黄色视频不卡| av福利片在线| 9191精品国产免费久久| 欧美日本亚洲视频在线播放| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 国产成人av教育| 欧美一级a爱片免费观看看 | videosex国产| 午夜精品久久久久久毛片777| 成人欧美大片| ponron亚洲| 久久久久久国产a免费观看| 最新在线观看一区二区三区| 午夜福利影视在线免费观看| 男女下面进入的视频免费午夜 | 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| av视频在线观看入口| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 国产精品1区2区在线观看.| 在线观看一区二区三区| 日本a在线网址| 亚洲av电影不卡..在线观看| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 国产精品久久久人人做人人爽| 大香蕉久久成人网| 国产精品一区二区免费欧美| 欧美日韩黄片免| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 操出白浆在线播放| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 啦啦啦免费观看视频1| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 91老司机精品| 精品国产亚洲在线| 99国产精品免费福利视频| 热99re8久久精品国产| 香蕉久久夜色| 亚洲国产看品久久| 欧美在线一区亚洲| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国产视频一区二区在线看| 亚洲av美国av| 波多野结衣一区麻豆| 一级毛片高清免费大全| 久久久久久人人人人人| 久久香蕉国产精品| 国内精品久久久久久久电影| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 久久狼人影院| 桃红色精品国产亚洲av| 国产激情欧美一区二区| 亚洲精品在线观看二区| а√天堂www在线а√下载| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 久久国产乱子伦精品免费另类| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 国产片内射在线| 精品不卡国产一区二区三区| 老汉色av国产亚洲站长工具| 可以在线观看的亚洲视频| av电影中文网址| 99re在线观看精品视频| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 九色国产91popny在线| 男人舔女人的私密视频| 黑丝袜美女国产一区| 校园春色视频在线观看| 亚洲中文字幕日韩| 久久香蕉国产精品| 老司机午夜十八禁免费视频| 激情在线观看视频在线高清| 91精品三级在线观看| 国内精品久久久久久久电影| www日本在线高清视频| 国产91精品成人一区二区三区| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 日韩av在线大香蕉| 日本三级黄在线观看| 国产成人欧美| 黄频高清免费视频| 天堂影院成人在线观看| 悠悠久久av| 国产亚洲精品久久久久5区| 久久国产精品人妻蜜桃| 少妇粗大呻吟视频| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 在线观看日韩欧美| 免费看a级黄色片| 午夜免费激情av| avwww免费| 国产成人精品在线电影| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 日日爽夜夜爽网站| 国产真人三级小视频在线观看| 黄片大片在线免费观看| 国产精品野战在线观看| 国产不卡一卡二| 国产欧美日韩一区二区精品| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 精品国产美女av久久久久小说| 99久久国产精品久久久| 无限看片的www在线观看| 久久婷婷人人爽人人干人人爱 | 动漫黄色视频在线观看| 99国产综合亚洲精品| 久久伊人香网站| av天堂在线播放| 这个男人来自地球电影免费观看| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 成人三级做爰电影| 亚洲一区二区三区不卡视频| 午夜福利欧美成人| 一本久久中文字幕| 午夜福利影视在线免费观看| 久久中文看片网| 极品人妻少妇av视频| 亚洲色图av天堂| av有码第一页| 国产激情久久老熟女| 黄色 视频免费看| 精品免费久久久久久久清纯| 精品第一国产精品| 亚洲精品一区av在线观看| 国产成人精品久久二区二区91| 久久青草综合色| 一区福利在线观看| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 色老头精品视频在线观看| 国产一区二区激情短视频| 在线观看免费午夜福利视频| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 精品人妻1区二区| 午夜精品在线福利| 国产精品免费视频内射| 久久久精品欧美日韩精品| 黄片播放在线免费| 日韩精品免费视频一区二区三区| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 精品国产亚洲在线| 国产成人精品久久二区二区91| 看黄色毛片网站| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 多毛熟女@视频| 一级a爱片免费观看的视频| 久99久视频精品免费| 一区二区三区激情视频| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 国产午夜精品久久久久久| 黄色丝袜av网址大全| 国产精品久久久av美女十八| 亚洲人成伊人成综合网2020| 久久婷婷成人综合色麻豆| 久久久久国内视频| 又黄又爽又免费观看的视频| 黑丝袜美女国产一区| 国产精品电影一区二区三区| 男女床上黄色一级片免费看| 国产精品 欧美亚洲| 国产真人三级小视频在线观看| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 亚洲一区二区三区色噜噜| 一区二区三区精品91| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 一本综合久久免费| 久久久久久大精品| 中文字幕久久专区| 国产精品,欧美在线| 精品久久久久久成人av| 丁香欧美五月| 在线av久久热| 国产亚洲精品第一综合不卡| 免费在线观看亚洲国产| 国产精品综合久久久久久久免费 | 精品一区二区三区av网在线观看| 国产主播在线观看一区二区| 亚洲欧美精品综合久久99| 无遮挡黄片免费观看| 欧美色欧美亚洲另类二区 | 可以在线观看的亚洲视频| 亚洲三区欧美一区| 免费看十八禁软件| 97人妻天天添夜夜摸| 一边摸一边抽搐一进一小说| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 91成年电影在线观看| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 久久久水蜜桃国产精品网| av天堂久久9| 两个人免费观看高清视频| 欧美黄色淫秽网站| av中文乱码字幕在线| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 国产成人欧美| 给我免费播放毛片高清在线观看| 国产精品1区2区在线观看.| 满18在线观看网站| 搞女人的毛片| 欧美激情高清一区二区三区| 亚洲中文日韩欧美视频| 亚洲中文av在线| 精品国内亚洲2022精品成人| 日韩三级视频一区二区三区| 中文字幕久久专区| 一二三四社区在线视频社区8| 久久午夜综合久久蜜桃| 午夜免费观看网址| 国产精品久久电影中文字幕| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 精品欧美一区二区三区在线| 亚洲成人精品中文字幕电影| 免费不卡黄色视频| 乱人伦中国视频| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 波多野结衣高清无吗| 久久香蕉激情| 女同久久另类99精品国产91| 精品免费久久久久久久清纯| 高清在线国产一区| 久久久久亚洲av毛片大全| 黄片大片在线免费观看| 亚洲国产精品合色在线| 亚洲无线在线观看| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 天堂√8在线中文| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 此物有八面人人有两片| 精品国产一区二区久久| 午夜激情av网站| 亚洲五月天丁香| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 99国产综合亚洲精品| 欧美久久黑人一区二区| 国产在线观看jvid| 一区在线观看完整版| 国产免费男女视频| 亚洲av电影在线进入| 黄色成人免费大全| 国产成人av教育| 黄色女人牲交| 久久精品国产综合久久久| 国产成人影院久久av| 午夜精品国产一区二区电影| 亚洲avbb在线观看| 国产精品日韩av在线免费观看 | 欧美日韩福利视频一区二区| av在线播放免费不卡| 亚洲精品av麻豆狂野| 母亲3免费完整高清在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 黄色丝袜av网址大全| 黄色视频,在线免费观看| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 操美女的视频在线观看| 免费在线观看完整版高清| 国产成+人综合+亚洲专区| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 久久久国产欧美日韩av| 亚洲情色 制服丝袜| 久久人妻熟女aⅴ| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 色综合站精品国产| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 精品欧美一区二区三区在线| 国产午夜精品久久久久久| 免费无遮挡裸体视频| 99久久国产精品久久久| 久久精品国产清高在天天线| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 两性夫妻黄色片| 精品一品国产午夜福利视频| 丝袜美足系列| 国产精华一区二区三区| 美女免费视频网站| 亚洲精品av麻豆狂野| 日韩高清综合在线| 精品久久久久久,| 啦啦啦韩国在线观看视频| 最近最新免费中文字幕在线|