基于衍生化技術(shù)的甘油磷脂分析方法研究進展

馬會芳，魏 芳，董緒燕，陳 洪，黃鳳洪

(中國農(nóng)業(yè)科學院油料作物研究所，農(nóng)業(yè)部油料加工重點實驗室，農(nóng)業(yè)部油料作物生物學與遺傳育種重點實室，油料油脂加工技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室，油料脂質(zhì)化學與營養(yǎng)湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430062)

脂質(zhì)是生物的重要組成成分，它不但是某些結(jié)構(gòu)的主要成分(例如細胞膜)，同時也參與信號傳導等重要的生理過程，脂質(zhì)的異常代謝會引發(fā)阿爾茲海默癥[1]、癌癥[2]、炎癥反應(yīng)[3]、精神分裂癥[4]、心臟病[5]等疾病。研究生物體的脂質(zhì)組成、脂質(zhì)代謝以及脂質(zhì)相互作用的科學被稱為脂質(zhì)組學。與各種組學相似，脂質(zhì)組學也需對復雜體系中的脂質(zhì)分子盡可能多的定性和定量。廣義上脂質(zhì)可定義為：存在于生物體中或食品中微溶于水，能溶于有機溶劑的一類化合物的總稱?；谥|(zhì)定義，LIPID MAPS分類系統(tǒng)將脂質(zhì)分為脂肪酸(Fatty acids)[6-7]、甘油脂(Glycerolipids)、甘油磷脂(Glycerophospholipids)[8]、鞘磷脂(Sphingolipids)、糖脂(Saccharolipids)、聚酮化合物(Polyketides)、異戊二烯醇脂(Prenol lipids)和甾醇脂(Sterol lipids) 8類，每類脂質(zhì)又能進一步分為許多亞類或分子種[9]?；诮Y(jié)構(gòu)和化學性質(zhì)的不同，脂質(zhì)可被分為脂質(zhì)代謝物、非極性脂和極性脂。脂質(zhì)代謝物主要包括游離脂肪酸、長鏈酰基輔酶A等；非極性脂主要包括膽固醇、膽固醇酯以及甘油脂類；極性脂主要包括甘油磷脂、鞘脂和糖脂。甘油磷脂(PLs)和溶血磷脂(LPLs)均歸類為極性脂。甘油磷脂是構(gòu)成細胞膜的重要組成部分，是具有關(guān)鍵生物學功能的化合物。溶血磷脂在生物信號傳導方面發(fā)揮著重要的功能，包括作為細胞外介質(zhì)誘導細胞的增殖，參與神經(jīng)系統(tǒng)和血管的發(fā)育，細胞內(nèi)信號的傳導以及抑制細胞的凋亡。甘油磷脂和溶血磷脂因頭部基團、鏈長和脂肪酸組成的不同可以分為不同的種類。因此，分析混合物中的甘油磷脂仍是一項重大挑戰(zhàn)。自然界尤其是生物樣本中的甘油磷脂種類十分龐大，質(zhì)譜技術(shù)作為脂質(zhì)組學領(lǐng)域中最核心的研究手段，目前已能對各種脂質(zhì)進行高分辨率、高靈敏度、高通量的分析。然而，質(zhì)譜或高分辨質(zhì)譜在甘油磷脂分析中仍存在技術(shù)瓶頸，如不同種類或相同種類不同脂肪酸組成的脂質(zhì)離子化效率差異大，會對離子化效率低的甘油磷脂分析造成干擾；商品化的甘油磷脂標準品種類有限且價格高，造成定量分析困難；甘油磷脂異構(gòu)體的鑒定仍是脂質(zhì)分析中的挑戰(zhàn)等?；谘苌馁|(zhì)譜技術(shù)可成為解決上述技術(shù)瓶頸的有效方法。

隨著電噴霧電離(ESI)、基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)、大氣壓化學電離(APCI)等軟電離技術(shù)的發(fā)展，質(zhì)譜分析已成為代謝組學分析不可或缺的手段，并憑借其高靈敏度和高分離能力，逐漸成為最具潛力的分析技術(shù),可滿足更快速、靈敏和高選擇性的檢測要求[10]。相較于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)，質(zhì)譜(MS)或液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)的優(yōu)勢在于可省去衍生化過程。為了增強分析物的揮發(fā)性和穩(wěn)定性，或影響分析物的裂解碎片，GC-MS分析中多進行衍生化。目前衍生化技術(shù)在LC-MS分析中的應(yīng)用遠不如在GC-MS法中廣泛，部分物質(zhì)并不適用于LC-MS分析，尤其是性質(zhì)不穩(wěn)定、離子化效率低、不易裂解的物質(zhì)。而衍生化技術(shù)與質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合將增強基于MS或LC-MS分析平臺的分析能力，并為無法攻克的分析技術(shù)難題提供選擇方法。衍生化方法與質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合的優(yōu)勢如下：①增加分析物的穩(wěn)定性；②增加分析物分子量，提高質(zhì)譜選擇性[11-13]；③利于結(jié)構(gòu)鑒定[14-15]；④通過引入易電離的基團提高檢測靈敏度[16]；⑤同位素衍生化便于定量分析[17]；⑥增加定量線性動態(tài)范圍等。鑒于上述優(yōu)勢，基于衍生化的質(zhì)譜技術(shù)在蛋白質(zhì)組學[18-19]、糖組學[20- 21]、藥物代謝動力學[22]及代謝物分析[23]等領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛。

在Google學術(shù)數(shù)據(jù)庫中以“MS”、“Derivatization”及“Lipid”為關(guān)鍵詞搜索從2007年至今發(fā)表的論文情況，結(jié)果顯示，近10年，報道了數(shù)以萬計基于衍生化的質(zhì)譜分析方法相關(guān)論文，其中包括許多綜述[24-26]。此外，基于衍生化的質(zhì)譜分析技術(shù)在脂質(zhì)分析中的相關(guān)研究維持在5.5%以上，且在近兩年呈較快增長趨勢。因此，本文結(jié)合近10年相關(guān)研究，綜述了基于衍生化的質(zhì)譜分析技術(shù)在脂質(zhì)分析中的最新研究進展，主要集中于甘油磷脂這一具有重要生物學功能的脂質(zhì)，并對脂質(zhì)衍生化分析方法在脂質(zhì)組學中的應(yīng)用和脂質(zhì)衍生化所面臨的問題及解決途徑進行總結(jié)，以激發(fā)衍生化技術(shù)在脂質(zhì)組學分析中的應(yīng)用潛能。

1 化學衍生化技術(shù)概述

質(zhì)譜新技術(shù)的研究和發(fā)展推動了脂質(zhì)組學的發(fā)展。然而，盡管近年來脂質(zhì)組學取得相當大的進展，但這些分析方法仍存在許多挑戰(zhàn)。首先，大多數(shù)天然存在的脂質(zhì)存在于差異較小的質(zhì)量數(shù)范圍內(nèi)，且常有同位素的干擾(相同質(zhì)量數(shù)、結(jié)構(gòu)不同的脂質(zhì))。其次，盡管色譜分離可將脂質(zhì)種類分開，但許多重要的低豐度脂質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定常被一些高濃度或易離子化的脂質(zhì)部分或全部抑制。最后，內(nèi)源性和外源性化學信號會干擾阻礙生物樣本中復雜脂質(zhì)的定性分析。為克服這些缺點，研究人員對儀器的設(shè)計進行優(yōu)化改進，以提高色譜分離度和質(zhì)譜的分辨率。但濃縮小體積的生物樣本十分困難，所以通過降低檢出限(LOD)和提高靈敏度可以降低檢測分析所需生物樣本的體積。

化學衍生化是提高質(zhì)譜檢測靈敏度的有效策略，大量的衍生化試劑已被合成且相應(yīng)的衍生化方法已被建立[27]。在進行MS分析前，應(yīng)針對目標化合物的特異性基團進行衍生化反應(yīng)以增強離子化效率。衍生化反應(yīng)后，化合物的物理和化學性質(zhì)會發(fā)生變化，從而影響其穩(wěn)定性、極性、溶解度、保留時間和電離效率[28]。大多數(shù)基于質(zhì)譜技術(shù)的衍生化技術(shù)旨在提高檢測的靈敏度、選擇性和特異性。

1.1 衍生化反應(yīng)

衍生化反應(yīng)是基于目標化合物中的反應(yīng)基團和衍生化試劑發(fā)生的一種特定的化學反應(yīng)。根據(jù)目標化合物基團的結(jié)構(gòu)和研究目的確定衍生化試劑以及衍生化反應(yīng)的類型。另外，衍生化試劑中的修飾基團可以增強目標化合物的特異性。衍生化試劑可與含有各種基團的目標化合物反應(yīng)，包括羰基[29]、羥基[30]、羧基[31]和氨基[32]。衍生化反應(yīng)具有以下特征：①衍生化反應(yīng)較穩(wěn)定且完全。②產(chǎn)生的副反應(yīng)和副產(chǎn)物較少，且副產(chǎn)物易去除。③反應(yīng)針對特定的基團進行，可減少復雜基質(zhì)的干擾。④衍生化產(chǎn)物較穩(wěn)定，在較長的時間內(nèi)不發(fā)生降解，便于檢測分析。因此，適當?shù)难苌瘜崿F(xiàn)基于衍生化結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)的快速、特異性脂質(zhì)分析十分重要。

1.2 衍生化反應(yīng)的優(yōu)點

衍生化反應(yīng)主要用于提高分析物的檢測靈敏度和選擇性，根據(jù)其在質(zhì)譜分析過程中的作用，可將衍生化反應(yīng)的優(yōu)點分為以下方面：

(1)引入易電離的基團。在利用ESI和APCI對中性化合物進行分析時電離效率較低，從而阻礙了常規(guī)質(zhì)譜在這類化合物中的分析應(yīng)用[33-34]。在正離子ESI模式下，引入堿性化學基團，包括帶永久電荷(季銨和吡啶)和易于離子化的基團(伯胺、仲胺和叔胺等)，可顯著增強質(zhì)譜的響應(yīng)。在正離子APCI模式下，目標化合物中引入含氧和氮原子的基團可有效提高靈敏度[35-38]。在負離子ESI模式下，引入易去質(zhì)子化的酸性基團(如磺酸基和羧基)可提高靈敏度。而在負離子APCI模式下，目標化合物中引入易與電子親和的衍生化試劑[39-41]可顯著提高離子化效率。

(2)確定特定的化學基團?；瘜W衍生化與質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合有利于分析物的結(jié)構(gòu)鑒定和解析。通過分析化學衍生化前后的質(zhì)譜數(shù)據(jù)很容易獲得大量的結(jié)構(gòu)信息[42]。此外，通過衍生化引入的基團標記化合物，可以提高MS/MS法的選擇性，且適于應(yīng)用中性丟失和前體離子掃描模式篩選特定的化合物。在化學衍生化過程中，代謝物已按照不同基團進行分類，分別對其進行分析，通過綜合多次分析的結(jié)果，可獲知代謝物的結(jié)構(gòu)及含量。該方案適用的脂質(zhì)及其代謝物種類有氨基化合物、羥基化合物、巰基化合物、羰基化合物和羧基化合物。相關(guān)研究已獲得一定的進展，如氨基化合物12C/13C丹磺酰氯標記法[43-45]、H/D雙甲基化標記法[46]及H/D 雙乙基化標記法[47]。本實驗室[48]使用H/D丙酮對羧酸化合物(磷脂酰乙醇胺)進行同位素標記和相對定量分析。Xu等[49]則利用H/D二甲胺基苯甲酸與羥基化合物的酯化反應(yīng)實現(xiàn)了體液中激素的同位素標記和相對定量分析。

(3)提高定量分析的準確性。質(zhì)譜是一種高選擇性、高靈敏度的檢測器，但具有穩(wěn)定性較差、信號受基質(zhì)影響大等缺點，因此外標法并不適用于質(zhì)譜定量分析。通過使用穩(wěn)定同位素內(nèi)標，可實現(xiàn)對相應(yīng)目標物的絕對定量。然而，對于部分分析物，其內(nèi)標獲得困難，不利于使用內(nèi)標法進行定量分析。例如，通過合成大量的同位素標記的多肽作為內(nèi)標，對多肽實現(xiàn)大規(guī)模的絕對定量分析是十分困難的。為解決以上問題，開發(fā)了穩(wěn)定同位素標記技術(shù)，即實驗組在生長和發(fā)育過程中所攝入的營養(yǎng)元素被輕穩(wěn)定同位素所標記，而對照組攝入的這種營養(yǎng)元素則為天然的同位素形式。一段時間后，實驗組和對照組分別被不同的同位素穩(wěn)定標記，經(jīng)過相同的樣品前處理步驟處理，等量混合后進行分離和質(zhì)譜鑒定。由于化學結(jié)構(gòu)及保留時間相同，重同位素標記后的化合物與天然同位素形式的化合物具有相同的基質(zhì)效應(yīng)，一級質(zhì)譜圖中兩個同位素的相對峰高反映了兩組樣品中該分析物的相對含量。對樣品分別進行輕、重穩(wěn)定同位素標記，不同穩(wěn)定同位素標記的樣品等量混合后，利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進行分析，通過比較不同標記的分析物的色譜峰面積以及質(zhì)譜的離子化碎片，對其進行相對定量分析，以找出具有顯著性差異的分析物。

2 甘油磷脂的化學衍生化分析

甘油磷脂是所有活體細胞膜的主要成分，包含1個極性的磷酸頭部基團和1個或2個非極性脂肪?；膊炕鶊F。由于極性頭部基團的差異，甘油磷脂呈現(xiàn)不同的種類：磷脂酸(Phosphatidicacid,PA)、磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylethanilamine,PE)、磷脂酰膽堿(Phosphatidylcholine,PC)、磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine,PS)、磷脂酰肌醇(Phosphatidylinoitide,PI)和磷脂酰甘油(Phosphatidylglycerol,PG)等(圖1)。各類甘油磷脂的差別主要在于頭部基團的極性大小、形狀和電荷的差異；每一類甘油磷脂均含2個脂肪酸酰基鏈(sn-1和sn-2)和特異性的頭部基團(sn-3)，且因脂肪酸酰基鏈長度、不飽和度及頭部基團的不同而存在若干種結(jié)構(gòu)的甘油磷脂[50-52]。根據(jù)sn-1位置上脂肪鏈的不同，又可將各類甘油磷脂進一步分成磷脂酰酯、磷脂縮醛醚酯和磷脂烷基醚酯3個亞類(圖2)。甘油磷脂中含有氨基、羧基、羥基、磷酸鹽等活性基團，對甘油磷脂的衍生化通?；谏鲜龌鶊F進行。

圖1 甘油磷脂的結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structures of glycerophospholipid

圖2 磷脂酰酯(A)、磷脂縮醛醚酯(B)和磷脂烷基醚酯(C)的結(jié)構(gòu)簡式Fig.2 Structures of diacyl PL(A),alkenyl-acyl PL(B) and alkyl-acyl PL(C)

2.1 甘油磷脂的甲基化化學衍生分析

目前衍生化方法主要用于蛋白質(zhì)和代謝物的分析，在甘油磷脂中的應(yīng)用相對較少且主要針對某類或含有特定共同基團的某幾類甘油磷脂進行，對所有甘油磷脂共同衍生的報道相對較少。甲基化是脂質(zhì)分析中常用的衍生化技術(shù)，常見于脂肪酸分析的甲酯化，該方法在質(zhì)譜分析中的作用日益突出。甲基化不僅能提高MS檢測靈敏度，還可用于甘油磷脂的MS鑒定和擴充MS在脂質(zhì)組學中的應(yīng)用廣度。甘油磷脂的質(zhì)譜分析中，電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)是鑒定總脂質(zhì)提取物中PC的有力工具。PC含有帶正電的季胺膽堿頭部基團，易在正離子模式下以fmol/L靈敏度被檢出。碰撞誘導解離質(zhì)子化的PC可產(chǎn)生大量碎片離子，并具有磷酸膽堿m/z184.07部分，該片段常用于通過三重四極桿或混合四極桿飛行時間質(zhì)譜儀前體離子掃描(PIS)定量分析PC分子種。而含氨基的甘油磷脂常含有伯胺、仲胺和叔胺的甘油磷脂頭部基團，此化學性質(zhì)使其易受內(nèi)源性PC、三酰甘油和基質(zhì)成分潛在離子抑制效應(yīng)影響。

PC和鞘磷脂(Sphingomyelin，SM)是兩類含有季銨鹽基團的甘油磷脂，一般難以實現(xiàn)衍生化，但可通過對磷酸根上的氧負離子或羥基衍生，中和其負電荷，固定季銨鹽基團上的正電荷。所以，對于所有甘油磷脂的衍生一般是基于其共同存在的磷酸基團進行。Wasslen等[53]使用重氮甲烷與氨基和磷酸基團作用，甲基化固定氨基上的正電荷，中和磷酸根上的負電荷，使甘油磷脂帶上了恒定的正電荷。通過電離特性的改善和鞏固離子解離形成1個或2個很強的特征極性頭部碎片，使衍生后脂質(zhì)的MS檢測靈敏度顯著提高，其中PS和PE的檢測靈敏度分別提高了32.4倍和2.21倍。

Canez等[54]同樣采用12C/13C重氮甲烷標記從HeLa細胞中提取的PE、PC、PS，并通過前體離子掃描模式對其進行檢測。由于其在前體離子掃描時均有不同的特異性碎片，通過衍生化標記可區(qū)分PE和PC的同分異構(gòu)體，其中PE的前體離子碎片為m/z202.1，PS的前體離子碎片為m/z148.1和261.1，PC和鞘磷脂(SM)的前體離子碎片均為m/z199.1，雖然PC和SM前體離子掃描的結(jié)構(gòu)相同，但其質(zhì)荷比分別為奇數(shù)和偶數(shù)。經(jīng)重氮甲烷衍生化反應(yīng)后PE、PC和SM的靈敏度分別提高了10.72、2.36和1.05倍。但重氮甲烷衍生化試劑對呼吸道有強烈的刺激作用，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有抑制作用，且屬于易爆、可燃和高毒的危險品。因此，需找到一種易于合成、使用，質(zhì)譜分析時穩(wěn)定性較好的同位素標記衍生化試劑。Lee 等[55]采用超臨界流體色譜-質(zhì)譜聯(lián)用對與三甲基硅烷化重氮甲烷(TMSD)發(fā)生甲基化反應(yīng)的甘油磷脂進行分析(圖3)，在所有甘油磷脂的磷酸根上引入1個甲基，使得甘油磷脂的質(zhì)譜響應(yīng)及色譜峰形均得到極大改善。其中PS、PA、溶血磷脂酰絲氨酸(LPS)、溶血磷脂酰甘油(LPI)、 溶血磷脂酸(LPA)、神經(jīng)酰胺-1-磷酸(Ceramide-1-phosphate,Cer1P)、鞘氨醇-1-磷酸(Sphingosine-1-phosphate,So1P)和神經(jīng)鞘氨醇-1-磷酸(Sphinganine-1-phosphate,Sa1P)的檢出限分別提高了7.5、26.7、600、116.7、500、75、3 000和4 500倍。該方法在6 min內(nèi)實現(xiàn)了對19類(包含甘油磷脂、溶血磷脂和鞘脂)極性脂質(zhì)的高通量、高分辨率分析。Cai等[56]報道了用穩(wěn)定同位素標記的三甲基硅烷化重氮甲烷與甘油磷脂發(fā)生衍生化反應(yīng)的方法，可以快速對生物樣本中的6類甘油磷脂進行定性和相對定量分析。將氫/氘(H/D)標記的甘油磷脂以已知比例混合，對其進行相對定量分析。該方法具有足夠的靈敏度、準確度、重現(xiàn)性，且平均變異系數(shù)為9.1%。

圖3 三甲基硅烷化重氮甲烷(TMSD)標記甘油磷脂[55]Fig.3 TMSD derivatization of glycerophospholipid[55]

磷脂酰肌醇是甘油磷脂中較為重要的一部分，包含磷脂酰肌醇磷酸(PtdInsP)、磷脂酰肌醇二磷酸(PtdInsP2)、磷脂酰肌醇三磷酸(PtdInsP3)、磷脂酰肌醇四磷酸(PtdInsP4)和磷脂酰肌醇五磷酸(PtdInsP5)。它們在組織中具有重要作用，參與細胞信號的傳導和蛋白質(zhì)的運輸?shù)戎匾顒?由于其極性較強，含量和離子化效率較低，特別是磷酯酰肌醇-3,4,5-磷酸(PtdIns(3,4,5)P3)，故對細胞中此類低濃度脂質(zhì)進行準確定量極其困難。已報道的分析方法對PtdIns(3,4,5)P3的檢測局限性主要在于：靈敏度低、放射性元素標記、通量較低和無法確定脂肪酸酰基組成等。2011年Clark等[57]以TMSD與PtdIns(3,4,5)P3的磷酸根進行甲基化反應(yīng)，結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用方法，對小鼠和人細胞或組織中的PtdIns(3,4,5)P3進行定性和定量分析，克服了之前分析方法的缺點。2014年Kielkowska等[58]應(yīng)用TMSD對細胞和組織中的PtdIns、PtdInsP、PtdInsP2和PtdInsP34類脂類進行衍生化處理[59-60]，對其進行準確的定性和定量分析，為進一步了解該類脂質(zhì)在正?；虿±頎顟B(tài)的生物體中所起的作用提供了一種靈敏和準確的方法。2016年Cai等[61]建立了一種可以快速、靈敏分析磷脂酰肌醇三磷酸、磷脂酰肌醇二磷酸和磷脂酰肌醇磷酸的新方法，使用“甘油二酯離子碎片+多重前體離子掃描”技術(shù)(DAG+MPIS)對甲基化的磷脂酰肌醇進行定性分析。利用這種簡單高效的方法對牛腦提取物或前列腺癌細胞系中32個PtdIns、28個PtdInsP、30個PtdInsP2和3個PtdInsP3分子種類進行定性分析，發(fā)現(xiàn)了許多此前未檢測到的脂肪酸組成的磷脂酰肌醇。該分析方法利用氘代標記的重氮甲烷(CD2N2)對內(nèi)源性磷酸肌醇進行同位素標記，實現(xiàn)了磷脂酰肌醇的準確定量分析。結(jié)果表明，同位素標記可以實現(xiàn)PtdInsP3、PtdInsP2和PtdInsP的準確定量，具有良好的線性和重現(xiàn)性，平均變異系數(shù)為18.9%。更為重要的是，該方法無需多種磷脂酰肌醇內(nèi)標。DAG+MPIS和基于同位素標記的磷脂酰肌醇質(zhì)譜分析相對于現(xiàn)有的分析方法具有一定優(yōu)勢，為磷酸肌醇代謝途徑研究提供了強有力的工具。

本實驗室[62]以TMSD作為衍生化試劑，對甘油磷脂進行甲基化，并結(jié)合shotgun-ESI-MS技術(shù)建立了基于甲基化和穩(wěn)定同位素標記技術(shù)的甘油磷脂的高效定性和定量分析方法。通過TMSD衍生結(jié)合穩(wěn)定同位素標記技術(shù)，一方面建立了甘油磷脂的相對定量分析方法，另一方面通過在各類甘油磷脂中選擇多個“輕”同位素標記的標準品作為內(nèi)標制作校準曲線，建立了6類甘油磷脂的準確定量分析方法。應(yīng)用該方法結(jié)合混合模式固相萃取技術(shù)，分析了高血脂病人血漿中甘油磷脂組分含量的變化，同時驗證了所建立的相對定量和絕對定量分析方法在實際生物樣本中應(yīng)用的可行性。這種絕對定量方法解決了因碳鏈長度不同與不飽和度導致的甘油磷脂質(zhì)譜響應(yīng)差異及定量不準確的問題，能獲得PLs較為準確的定量結(jié)果，且極大增加了甘油磷脂定量過程中內(nèi)標物選擇的廣度。Han等[63]以TMSD為衍生化試劑，對多不飽和磷脂酰肌醇(PPI)進行甲基化反應(yīng)，用于全面分析PPI磷酸的位置和脂肪酸?；湹慕Y(jié)構(gòu)，并應(yīng)用該方法定量分析糖尿病小鼠中PPI的組成及含量，首次揭示了db/db小鼠腦皮質(zhì)中PPI水平有顯著降低的趨勢。Ejsing等[64]基于PE等含氨基甘油磷脂與含重氫的碘甲烷(CD3I)發(fā)生甲基化反應(yīng)可生成PC類似物，并分別產(chǎn)生一定分子量的特異性分子偏移的原理，建立了一種“Mass tag”方法，同時鑒定和定量分析了脂質(zhì)提取物中PE、單甲基化磷脂酰乙醇胺(MMPE)、雙甲基化磷脂酰乙醇胺(DMPE)、PE和PC的種類。

2.2 氨基甘油磷脂的化學衍生化分析

氨基甘油磷脂是頭部基團帶氨基的甘油磷脂，主要包括磷PE和PS兩類甘油磷脂。2005年Murphy等[65]采用穩(wěn)定同位素標記的N-甲基哌嗪乙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(DMABA)標記氨基甘油磷脂時，發(fā)現(xiàn)N-甲基哌嗪-酰胺標記的氨基甘油磷脂在質(zhì)譜檢測中產(chǎn)生m/z114～117的碎片離子，不易于定性分析，而改用MS3方法時可成功用于對人類多形核白細胞和巨噬細胞中多不飽和氨基甘油磷脂的定量分析。2009年Murphy等[66]應(yīng)用含有4種穩(wěn)定同位素標記的4-(二甲基氨基)苯甲酸(DMABA)N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯試劑與PE的伯胺基團發(fā)生衍生化反應(yīng)，在正離子模式下應(yīng)用前體離子掃描m/z191.1、195.1、197.1和201.1，對(D0、D4、D6和D10)-DMABA衍生化標記的PE進行特異性分析。并利用2,2′-偶氮二 -(2-脒基丙烷)鹽酸鹽(AAPH)對RAW 264.7細胞分別處理0、30、60、300 min，將經(jīng)不同處理時間的細胞分別用(D0、D4、D6和D10)-DMABA衍生化標記后進行分析，發(fā)現(xiàn)隨著處理時間的延長，內(nèi)源性PE和氧化PE的含量均有所升高。

2012年Fhaner等[67]利用穩(wěn)定同位素標記的S，S′-二甲基硫代丁酰羥基琥珀酰亞胺酯(DMBNHS)對含有氨基的磷脂酰乙醇胺和磷脂酰絲氨酸進行標記，并成功對直腸癌細胞SW480中249種脂質(zhì)進行了相對定量分析。DMBNHS衍生化反應(yīng)前后分析物的質(zhì)量位移可減少脂質(zhì)間的干擾，且提高分析靈敏度，為應(yīng)用直接進樣法鑒定同類脂質(zhì)或脂質(zhì)同分異構(gòu)體分子提供了一種新思路。2015年Nie等[68]同樣利用DMBNHS和碘/甲醇對氨基甘油磷脂進行衍生化標記，與未衍生化標記的氨基甘油磷脂相比，衍生化標記的氨基磷脂靈敏度顯著提高，且經(jīng)過對MS3裂解碎片的分析可實現(xiàn)對同分異構(gòu)體(烷基醚酯和縮醛醚酯)的鑒定。

Han等[69]通過用芴基甲氧羰基(Fmoc)氯化物對脂質(zhì)提取物進行簡單的前處理，將PE和溶血PE物質(zhì)衍生為相應(yīng)的氨基甲酸酯。適當稀釋后，將反應(yīng)溶液直接注入電噴霧電離質(zhì)譜儀的離子源。由于在碰撞誘導解離時，易產(chǎn)生Fmoc母核中性丟失的特異性碎片，從而顯著提高了分析靈敏度，且更有利于對低豐度脂質(zhì)分子種類進行定性和定量分析。該方法比直接進樣質(zhì)譜法的靈敏度提高了100倍以上，且線性動態(tài)范圍大于15 000倍，方法簡單、高效，為實現(xiàn)多種脂質(zhì)化合物(特別是分子量相近或同分異構(gòu)體脂質(zhì))的同時定性和定量分析提供了一種新策略。本實驗室[48]采用丙酮穩(wěn)定同位素衍生化結(jié)合雙中性丟失掃描直接進樣質(zhì)譜法(ASID-DNLS)對PE進行定性和定量分析，方法簡單、高效、準確、價廉，且避免了過量衍生試劑影響離子化效率的問題以及同位素峰重疊現(xiàn)象，特別適合于相對定量分析。采用該方法共鑒定了大鼠肝臟樣本中的45種PE，與對照組相比，高脂飲食組大鼠肝臟的總PE水平呈下降趨勢。

2.3 基于化學衍生化方法分析甘油磷脂同分異構(gòu)體

2.3.1甘油磷脂脂肪酸鏈異構(gòu)體的分析18-crown-6 ether(18C6)衍生PE也能使PE產(chǎn)生質(zhì)量偏移，從而將分子結(jié)構(gòu)相似且某些情況下分子量相同的PC和PE區(qū)分。 Pham等[70]用18C6與PE發(fā)生非共價絡(luò)合，產(chǎn)生264 Da的分子偏移而將PE與其同分異構(gòu)體形式的PC分離。同時，由于18C6的加入能顯著影響電噴霧離子化的離子豐度，使得衍生化后PE的分析靈敏度提高了1個數(shù)量級。此外，非共價絡(luò)合衍生還能進行甘油磷脂脂肪酰基異構(gòu)體鑒定。當前脂質(zhì)組學方法主要依賴于傳統(tǒng)的串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)進行脂質(zhì)鑒定，該法可應(yīng)用于鑒定脂質(zhì)種類，確定酰基鏈碳原子數(shù)及不飽和度，但由于傳統(tǒng)的低能量碰撞誘導解離不能從脂肪?；逆滈g斷裂產(chǎn)生產(chǎn)物離子，故在鑒定由雙鍵位置、鏈分支和環(huán)狀結(jié)構(gòu)引起的同分異構(gòu)體方面存在局限性。為此，Pham等[71]首次將自由基定向解離(RDD)應(yīng)用于脂質(zhì)分析，在該方法中，包含1個光電籠形自由基引發(fā)劑和脂質(zhì)內(nèi)收基團的雙官能團分子(如：4-碘苯胺、4-碘苯甲酸)被用于與脂質(zhì)在電噴霧離子化過程中形成非共價復合物(即加合離子)。激光照射(UV 波長266 nm)這些復合物裂解C—I鍵可釋放一種高活性的苯自由基，后續(xù)活化新生自由基離子將導致自由基定向解離，從而使得?；糠之a(chǎn)生顯著的鏈內(nèi)碎片。利用脂質(zhì)標準品驗證了RDD分析可應(yīng)用于脂質(zhì)同分異構(gòu)體的鑒定，同時還揭示了橄欖油和人極低密度脂蛋白的結(jié)構(gòu)多樣性。18C6與PE非共價絡(luò)合也能應(yīng)用于RDD對PE脂肪?；湲悩?gòu)體進行鑒定。此法可以產(chǎn)生雙鍵位置和脂肪酸鏈相關(guān)的診斷碎片，為甘油磷脂、鞘磷脂和甘油三酯同分異構(gòu)體鑒定提供了一種方法。

圖4 丙酮與不飽和PC18∶0/18∶1(9)的光催化衍生化反應(yīng)[73]Fig.4 PB reactions and CID fragmentation pathways of PC isomers:PC 18∶0/18∶1(9)[73]

3 展 望

近年來,脂質(zhì)衍生化相關(guān)研究逐漸增多,基于穩(wěn)定同位素標記與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的應(yīng)用也日益廣泛，同時，各種相應(yīng)的數(shù)據(jù)分析軟件的編寫,均為脂質(zhì)衍生化的研究提供了理論基礎(chǔ)和條件。盡管目前已有很多商業(yè)化的穩(wěn)定同位素標記試劑,但開發(fā)新的試劑仍將是今后的工作重點。為獲得較好的實驗結(jié)果，體現(xiàn)衍生化的優(yōu)勢，開發(fā)的衍生化試劑需考慮以下因素：①衍生化試劑盡可能同時標記樣品中所有的甘油磷脂；②衍生化標記后的甘油磷脂質(zhì)量差易于檢測分析；③衍生化試劑廉價易得，衍生化反應(yīng)的步驟簡單、條件溫和，過量的衍生化試劑應(yīng)去除，以降低其對衍生化產(chǎn)物的干擾；④衍生化產(chǎn)物在多維色譜分離和質(zhì)譜中穩(wěn)定，較少產(chǎn)生干擾譜圖解析的碎片離子；⑤衍生化標記對甘油磷脂離子化效率和出峰時間的影響；⑥衍生化產(chǎn)物可以產(chǎn)生豐富的二級碎片離子，利于甘油磷脂位置異構(gòu)體(雙鍵位置異構(gòu)、順反異構(gòu)等)的結(jié)構(gòu)鑒定；⑦衍生化方法能否允許兩個或兩個以上的樣品同時分析；⑧衍生化方法盡可能適用于所有生物樣本。開發(fā)新型的穩(wěn)定同位素標記試劑的同時,也應(yīng)開展新型質(zhì)譜的研發(fā)。更快的掃描速度，更高的靈敏度、準確度及分辨率將是未來質(zhì)譜的發(fā)展方向。此外，各種與數(shù)據(jù)分析相關(guān)軟件的編寫也至關(guān)重要。這些問題均為基于衍生化的脂質(zhì)組學分析方法研究的重點和難點,也是未來研究的發(fā)展趨勢。