刺梨不同提取成分對(duì)B16細(xì)胞增殖及酪氨酸酶活性的影響

浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 杭州 310053

近年來(lái)，隨著環(huán)境污染的日益嚴(yán)重，大氣臭氧層遭到破壞，紫外線照射日益強(qiáng)烈。紫外線可以促使人體皮膚中黑色素細(xì)胞合成黑色素，導(dǎo)致皮膚色素沉積失常，影響面容外觀，給人們帶來(lái)一定的心理和精神壓力，影響生活質(zhì)量[1]。酪氨酸酶是一種含銅的氧化還原酶，可以催化黑色素細(xì)胞中的酪氨酸生成黑色素，是黑色素合成過(guò)程的主要限速酶，其表達(dá)水平和活性決定著黑色素合成的速度和產(chǎn)量[2]。研究表明，抑制酪氨酸酶活性可以減少皮膚黑色素的生成，并具有良好的美白功效[3]。近年來(lái)隨著綠色自然理念的日益普及，植物成分的化妝品因取材天然、安全性高、符合消費(fèi)者對(duì)健康的追求等特點(diǎn)，在化妝品領(lǐng)域異軍突起，眾多的研究者開(kāi)始嘗試從植物提取物中篩選抑制酪氨酸酶活性的天然成分。

刺梨（Rosa roxburghii）為薔薇科薔薇屬植物繅絲花的果實(shí)，又名茨梨、木梨子、文光果、送春歸，為云貴高原特有的野生植物，有消食健脾、收斂止瀉的功效[4]。刺梨中含有豐富的維生素、多酚、黃酮、有機(jī)酸、多糖、氨基酸以及微量元素等物質(zhì)，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)，刺梨中多種活性成分，如刺梨多酚、刺梨黃酮、刺梨多糖等均具有抗衰老、抗氧化以及清除自由基的作用，在美白化妝品開(kāi)發(fā)領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景[7-8]。鄭殿欽[9]以刺梨為原料，開(kāi)發(fā)了刺梨美白茶，發(fā)現(xiàn)其具有抗氧化、美白、健胃消食等作用。目前對(duì)于刺梨多糖、黃酮及多酚的提取技術(shù)和效率，以及其具體作用機(jī)制尚沒(méi)有系統(tǒng)研究，限制了刺梨作為美白添加劑的應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)以刺梨為原料，制備了刺梨多糖、黃酮及多酚提取物，并研究其對(duì)小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞增殖及細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性的影響，以期為刺梨在美白化妝品中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥材 刺梨采自貴州黔南，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥資源研究所陳孔榮副教授鑒定為薔薇科薔薇屬植物繅絲花（Rosa roxburghii Tratt.）的果實(shí)。

1.2 細(xì)胞和主要試劑 小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞購(gòu)于蘇州北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：BNCC 100653）。RPMI-1640培養(yǎng)基、胰酶、PBS均購(gòu)于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司（批號(hào)：20170213、20170310、20170321）；胎牛血清購(gòu)于浙江天杭生物科技股份有限公司（批號(hào)：20161207）；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）、乙醇購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（批號(hào)：20170113、20170317）；四甲基偶氮唑藍(lán)購(gòu)于杭州昊天生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：3068B512）；左旋多巴（levodopa，L-DOPA）購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司（批號(hào)：O25M8K32143）；Triton X-100、維生素C購(gòu)于Sigma公司（批號(hào)：WXBC3534V、WXBB4747V）；大孔吸附樹(shù)脂HPD-600、AB-8購(gòu)于滄州寶恩吸附材料科技有限公司（批號(hào)：20170421、20170422）。

1.3 主要儀器設(shè)備 BLX-800酶標(biāo)儀為美國(guó)Bio-Tek公司產(chǎn)品；二氧化碳培養(yǎng)箱、生物安全柜為美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品；倒置顯微鏡為日本Nikon公司產(chǎn)品；UV-1800型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)購(gòu)于日本島津公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 刺梨不同提取成分的制備及純度檢測(cè)

1.4.1.1 刺梨多糖 采用水提法提取刺梨多糖[10]。將干燥的刺梨果實(shí)粉碎，過(guò)50目篩，取適量粉末，放入圓底燒瓶中，加入50倍量的蒸餾水，在80℃下提取3次，每次1h。過(guò)濾得到多糖溶液，再經(jīng)過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干水分，得到多糖粉末，采用苯酚-硫酸法測(cè)定刺梨多糖純度[11]。

1.4.1.2 刺梨黃酮 采用醇提法提取刺梨黃酮[12]。將干燥的刺梨果實(shí)粉碎，過(guò)50目篩，取適量粉末，加入15倍量的80%乙醇，在90℃下提取3次，時(shí)間分別為80、40、40min。過(guò)濾得到黃酮溶液，再經(jīng)過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干乙醇，濃縮液蒸干后得到粗黃酮浸膏，用HPD-600大孔吸附樹(shù)脂裝柱上樣，吸附1h，10倍柱體積的蒸餾水以4mL·min-1的流速洗去糖類等雜質(zhì)，10倍柱體積40%的乙醇以3mL·min-1的流速洗脫，得到洗脫液，再經(jīng)過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干水分，真空干燥得到刺梨黃酮粉末，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法測(cè)定刺梨黃酮純度[13]。

1.4.1.3 刺梨多酚 采用超聲提取法提取刺梨果實(shí)中的多酚[14]。將干燥的刺梨果實(shí)粉碎，過(guò)50目篩。稱取刺梨粉末，液料比100:1，加入70%乙醇，超聲功率250w，30℃超聲提取 40min，過(guò)濾，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，得到粗多酚浸膏。用AB-8大孔樹(shù)脂裝柱上樣，上樣液濃度 0.7mg·mL-1，上樣液 pH 5.9，流速 3mL·min-1；洗脫液濃度70%，洗脫液pH 6.3，流速3mL·min-1進(jìn)行洗脫，得到洗脫液。再經(jīng)過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干水分，真空干燥得到刺梨多酚粉末，采用Folin-Ciocaltean法測(cè)定刺梨多酚純度[15]。

1.4.2 細(xì)胞培養(yǎng) 無(wú)菌條件下，將B16細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合狀態(tài)，以胰酶消化傳代，每2d傳代1次。

1.4.3 實(shí)驗(yàn)分組 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至4×104個(gè)/mL，接種于96孔板中，每孔100μL。37℃、5%CO2飽和濕度環(huán)境下孵育24h后，根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將細(xì)胞分為空白組、正常組、刺梨多糖組（200、400、800、1 600μg·mL-1）、刺梨黃酮組（30、60、120、240μg·mL-1）、刺梨多酚組（40、80、160、320μg·mL-1），陽(yáng)性對(duì)照組（維生素 C 90μg·mL-1）。正常組細(xì)胞中加入100μL不含藥物的培養(yǎng)基，空白組不接種細(xì)胞，代之等量培養(yǎng)基，其余各組分別加入100μL含有相應(yīng)劑量藥物培養(yǎng)基。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，于37℃、5%CO2飽和濕度環(huán)境下孵育48h。

1.4.4 MTT法測(cè)定刺梨不同提取成分對(duì)B16細(xì)胞增殖活性的影響 按“1.4.3”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞48h后，棄去培養(yǎng)液，以PBS洗滌1次，每孔加入無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基 100μL 和 5mg·mL-1的 MTT 溶液 20μL，在37℃、5%CO2飽和濕度環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)4h后，棄去上清液，每孔加入DMSO溶液150μL，震蕩5～10min使結(jié)晶充分溶解，酶標(biāo)儀檢測(cè)A490，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞增殖活性=[（藥物處理組A490-空白組A490）/（正常組 A490-空白組 A490）]×100%，計(jì)算 IC50。

1.4.5 倒置顯微鏡觀察刺梨不同提取成分對(duì)B16細(xì)胞形態(tài)的影響 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至 1×105個(gè)/mL，接種于 6 孔板中，每孔 1.5mL，37℃、5%CO2飽和濕度環(huán)境下孵育24h后，添加各含藥培養(yǎng)基，分組及藥物濃度同前，作用48h后，置于倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)、大小、生長(zhǎng)密度及融合狀態(tài)等，并拍照記錄。

1.4.6 多巴氧化法測(cè)定刺梨不同提取成分對(duì)B16細(xì)胞酪氨酸酶活性的影響 按“1.4.3”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞48h后，用PBS洗滌兩遍，每孔加1%TritonX-100溶液100μL，迅速放入-80℃冰箱凍存1h，隨后移至室溫下裂解細(xì)胞，37℃預(yù)溫后每孔加入濃度為0.1%的 L-DOPA 100μL，37℃水浴 2h，酶標(biāo)儀檢測(cè) A490，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞酪氨酸酶活性=[（藥物處理組A490-空白組A490）/（正常組A490-空白組A490）]×100%。采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算IC50。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用 SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用±s表示,多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著差異法（LSD-t法），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 刺梨不同部位的提取率和純度測(cè)定 刺梨不同提取成分的提取率差別較大，其中刺梨多糖的提取率最高，可達(dá)45.33%，是刺梨黃酮和刺梨多酚提取率的7.56和5.21倍。雖然刺梨黃酮提取率最低，僅為6.00%，但其純度顯著高于刺梨多糖和刺梨多酚，經(jīng)亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法檢測(cè)獲得的刺梨黃酮純度為52.50%，分別是刺梨多糖純度和刺梨多酚純度的1.56和1.69倍。見(jiàn)表1。

表1 刺梨不同提取成分的提取率及純度（±s，%）Tab.1 Extraction rate and purity of Rosa roxburghii different extraction parts(±s,%)

表1 刺梨不同提取成分的提取率及純度（±s，%）Tab.1 Extraction rate and purity of Rosa roxburghii different extraction parts(±s,%)

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2.2 刺梨不同提取成分對(duì)B16細(xì)胞增殖活性和形態(tài)的影響 刺梨的不同提取成分對(duì)B16細(xì)胞增殖均具有抑制作用，并呈一定的濃度依賴性，和正常組比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05，P＜0.01）。藥物處理 48h后，400、800μg·mL-1的刺梨多糖組B16細(xì)胞的增殖活性分別是76.16%和45.01%，與正常組比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。30μg·mL-1刺梨黃酮組細(xì)胞增殖活性為89.14%，當(dāng)黃酮濃度增加到120μg·mL-1時(shí)，B16細(xì)胞的增殖活性可下降至48.81%，對(duì)細(xì)胞增殖的抑制效果是低濃度刺梨黃酮處理組的4.71倍，與正常組比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。40、80μg·mL-1的刺梨多酚處理48h后，B16細(xì)胞的增殖活性分別是84.27%和80.84%，與正常組比較，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），其對(duì)細(xì)胞增殖的抑制效果介于刺梨多糖和刺梨黃酮之間。見(jiàn)表2。處理48h后，刺梨多糖、刺梨黃酮和刺梨多酚抑制B16細(xì)胞增殖的IC50分別為649.83μg·mL-1、105.87μg·mL-1、134.16μg·mL-1，其中刺梨黃酮對(duì)B16細(xì)胞增殖活性的抑制效果最佳，120、240μg·mL-1刺梨黃酮對(duì)B16細(xì)胞增殖的抑制作用優(yōu)于維生素C（P＜0.05或P＜0.01）。正常組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，形態(tài)正常，貼壁牢固，融合度好。不同濃度的刺梨提取物處理之后，細(xì)胞密度減少，細(xì)胞形態(tài)均出現(xiàn)了不同程度的變化，融合度降低，不能相互融合成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，隨著藥物劑量增加，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，碎片增多。見(jiàn)圖1。

表2 刺梨不同提取成分對(duì)B16細(xì)胞增殖活性的影響（±s）Tab.2 Effects of different extracts of Rosa roxburghii on proliferation of B16 cells(±s)

表2 刺梨不同提取成分對(duì)B16細(xì)胞增殖活性的影響（±s）Tab.2 Effects of different extracts of Rosa roxburghii on proliferation of B16 cells(±s)

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。Note:compared with normal group,*P＜0.05,**P＜0.01;compared with positive control group,#P＜0.05,##P＜0.01.

組別 藥物濃度（μg·mL-1） B16細(xì)胞增殖活性（%）正常組陽(yáng)性對(duì)照組刺梨多糖0刺梨黃酮刺梨多酚90 200 400 800 1 600 30 60 120 240 40 80 160 320 100 54.29±4.4**93.14±3.21*76.16±5.97**45.01±4.63**#4.60±0.15**##89.14±2.7**83.52±3.74**48.81±3.54**#7.91±1.05**##84.27±2.82**80.84±3.23**45.34±1.84**#10.37±2.46**##

圖1 刺梨不同提取成分對(duì)B16細(xì)胞形態(tài)的影響（10×）Fig.1 Effects of different extracts of Rosa roxburghii on the morphology of B16 cells（10×）

2.3 刺梨不同提取成分對(duì)B16細(xì)胞酪氨酸酶活性的影響 刺梨多糖、刺梨黃酮、刺梨多酚對(duì)B16細(xì)胞酪氨酸酶活性均具有抑制作用，并呈一定的濃度依賴性，與正常組比較，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05，P＜0.01）。刺梨不同提取成分對(duì)細(xì)胞酪氨酸酶活性的抑制差異較大，其中刺梨黃酮的效果最好，刺梨多糖最差。處理48h后，400μg·mL-1刺梨多糖組B16細(xì)胞酪氨酸酶活性為41.84%，800μg·mL-1刺梨多糖組酪氨酸酶活性僅為3.67%，與正常組比較，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。30μg·mL-1刺梨黃酮組 B16細(xì)胞酪氨酸酶活性為76.93%，120μg·mL-1刺梨黃酮組B16細(xì)胞酪氨酸酶活性下降為6.43%，其抑制效果是低濃度刺梨黃酮處理組的11.96倍，與正常組比較，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），中、高濃度刺梨黃酮組（≥60μg·mL-1）細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性顯著低于陽(yáng)性對(duì)照（P＜0.01）。40、80μg·mL-1的刺梨多酚處理 48h 后，B16 細(xì)胞的酪氨酸酶活性分別是95.96%和46.50%，與正常組比較，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05，P＜0.01），中、高濃度刺梨多酚組（≥80μg·mL-1）細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.01），其酪氨酸酶抑制效果介于刺梨多糖和刺梨黃酮之間。處理48h后，刺梨多糖、刺梨黃酮和刺梨多酚抑制細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性的IC50分別為 376.13μg·mL-1、57.51μg·mL-1、82.42μg·mL-1，其中刺梨黃酮對(duì)B16細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性的抑制效果最佳，且刺梨黃酮、刺梨多酚以及高濃度刺梨多糖對(duì)酪氨酸酶的抑制效果優(yōu)于維生素C。見(jiàn)圖2。

圖2 刺梨不同提取成分對(duì)B16細(xì)胞酪氨酸酶活性的影響Fig.2 Effects of different extraction parts of Rosa roxburghii on tyrosinase activity in B16 cells

3 討論

美白是近年來(lái)護(hù)膚品行業(yè)及消費(fèi)者最熱衷追求的護(hù)膚功效之一，酪氨酸酶作為黑色素生成的限速酶，其表達(dá)和活性與黑色素合成的速度和產(chǎn)量密切相關(guān)[16]，近年來(lái)以酪氨酸酶為靶點(diǎn)的活性成分篩選在祛斑美白領(lǐng)域中的應(yīng)用日益廣泛。黃少丹等[17]以酪氨酸酶為靶點(diǎn)對(duì)中藥美白成分進(jìn)行了篩選，李紅艷等[18]通過(guò)對(duì)酪氨酸酶抑制作用的研究快速篩選出紅花中具有酪氨酸酶抑制活性的成分。近年來(lái)，無(wú)毒高效的天然植物酪氨酸酶抑制劑成為了美白化妝品及皮膚用藥的研究熱點(diǎn)[19]。嚴(yán)航等[20]研究發(fā)現(xiàn)，加8倍量的70%乙醇提取2h，兩次提取得到的薏苡仁提取物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率達(dá)33.3%，具有潛在的美白功效。王國(guó)林等[21]測(cè)定不同乙醇濃度的洗脫物對(duì)蘑菇酪氨酸酶的抑制作用，其中經(jīng)MCI柱后體積分?jǐn)?shù)30%乙醇洗脫物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制最靈敏。本文首先通過(guò)水提法、醇提法和超聲提取法獲得刺梨多糖、黃酮和多酚，隨后研究了以上3種提取成分對(duì)黑色素瘤B16細(xì)胞增殖活性、細(xì)胞形態(tài)和酪氨酸酶活性的影響，結(jié)果表明刺梨的3種提取物均能抑制B16細(xì)胞增殖和酪氨酸酶活性，并呈一定的濃度依賴性，其中刺梨黃酮抑制效果最佳，刺梨多酚次之，刺梨多糖效果最差。刺梨黃酮和刺梨多酚對(duì)酪氨酸酶活性的抑制程度優(yōu)于維生素C。本文的研究結(jié)果表明，刺梨多糖的提取率最高，可達(dá)45.33%，但對(duì)B16細(xì)胞增殖及酪氨酸酶活性作用效果不佳，猜測(cè)可能與多糖未經(jīng)過(guò)純化，粗提物效果不好有關(guān)，后續(xù)研究中將進(jìn)一步優(yōu)選純化工藝，提純后再進(jìn)行后續(xù)酪氨酸酶抑制劑篩選，以提高刺梨多糖利用率。本研究表明，與B16細(xì)胞增殖活性實(shí)驗(yàn)相比，相同濃度下刺梨提取成分對(duì)細(xì)胞酪氨酸酶活性的抑制作用更強(qiáng)，提示刺梨黃酮和刺梨多酚可作為高效的酪氨酸酶抑制劑用于后續(xù)的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)。

黑色素瘤B16細(xì)胞作為美白產(chǎn)品的活性篩選模型，可用于美白產(chǎn)品祛斑初步功效的評(píng)價(jià)。趙京霞等[22]以B16細(xì)胞為模型，通過(guò)酶學(xué)方法研究滋補(bǔ)肝腎方含藥血清對(duì)細(xì)胞酪氨酸酶活性的影響。本文中以B16細(xì)胞為模型，檢測(cè)了刺梨不同提取成分對(duì)酪氨酸酶活性的影響，結(jié)果表明刺梨黃酮對(duì)B16細(xì)胞的酪氨酸酶活性具有顯著的抑制作用，作用48h時(shí)其IC50值可達(dá)57.51μg·mL-1。近年來(lái)的研究結(jié)果表明，眾多植物來(lái)源的黃酮類化學(xué)成分對(duì)酪氨酸酶具有顯著的抑制作用[23]。付小華[24]研究發(fā)現(xiàn)甘草黃酮可有效抑制酪氨酸酶單酚酶與二酚酶的活性。Nquyen等[25]研究發(fā)現(xiàn)異葉蒿黃酮能有效抑制酪氨酸酶活性，是皮膚增白劑的潛在來(lái)源。本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)醇提法提取刺梨黃酮，并用大孔樹(shù)脂純化，制備出的刺梨黃酮純度較高，為52.50%，表明優(yōu)化技術(shù)較為成熟，具有良好的開(kāi)發(fā)前景，但是得率較低，后續(xù)將進(jìn)一步優(yōu)化刺梨黃酮提取工藝，提高黃酮得率，為刺梨黃酮的后續(xù)開(kāi)發(fā)提供研究基礎(chǔ)。

刺梨生長(zhǎng)于我國(guó)云南、貴州等西南省份山區(qū)，尤以貴州資源最為豐富，是貴州的民族特色藥材，適應(yīng)性強(qiáng)、易栽種，具有來(lái)源豐富、價(jià)格低廉的特點(diǎn)。我國(guó)在上世紀(jì)80年代開(kāi)始就對(duì)其藥理作用進(jìn)行了較為全面的研究，發(fā)現(xiàn)刺梨具有提高免疫、延緩衰老、抗氧化、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗癌、降血脂等功能，但是目前對(duì)于刺梨的整體開(kāi)發(fā)利用程度較低[26]。本實(shí)驗(yàn)為刺梨提取物，特別是刺梨黃酮的研究奠定了基礎(chǔ)，為化妝品行業(yè)開(kāi)發(fā)新的美白原料提供了研究思路。