異丙醇法提取超氧化物歧化酶的工藝優(yōu)化研究

田小海 崔洪艷 王莘

摘 要：目的：探索優(yōu)化異丙醇法從活性干酵母中提取超氧化物歧化酶的最佳工藝條件。方法：通過L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定異丙醇濃度、攪拌時(shí)間、1次丙酮沉淀體積、2次丙酮沉淀體積對(duì)超氧化物歧化酶提取效果的影響，并采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定超氧化物歧化酶的活性。結(jié)果：最佳工藝條件：異丙醇濃度85%、攪拌時(shí)間16h、1次丙酮沉淀體積比（丙酮：粗提液）為0.8、2次丙酮沉淀體積比（丙酮：粗提液）為0.9，所得酶活性為810.00U/g，比活力為3240.00U/mg。結(jié)論：通過試驗(yàn)研究，改善了現(xiàn)有的異丙醇法從活性干酵母提取超氧化物歧化酶的工藝條件，減少了原料的消耗，節(jié)省了時(shí)間和能源。

關(guān)鍵詞：活性干酵母；超氧化物歧化酶；提取工藝

中圖分類號(hào) TS201.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2018）21-0029-03

Study on Optimization of Extraction of Superoxide Dismutase by Isopropanol

Tian Xiaohai et al.

Abstract：Objective：Optimization of the best conditions for extraction of superoxide dismutase from active dried yeast by isopropanol.Method：The effects of isopropanol concentration，stirring time，primary acetone precipitation volume and secondary acetone precipitation volume on the extraction effect of superoxide dismutase were determined by the orthogonal test design of L9（34）.The activity of superoxide dismutase was determined by the autooxidation method of catechol.Result：Best process conditions：85% isopropanol concentration，16 H stirring time，first acetone precipitation volume ratio（acetone：crude extract）of 0.8，second acetone precipitation volume ratio（acetone：crude extract）of 0.9，the resulting enzyme activity is 810.00U/g，The specific activity is 340.00 U/mg.Conclusion：Best process conditions：85% isopropanol concentration，16 H stirring time，first acetone precipitation volume ratio（acetone：crude extract）of 0.7，second acetone precipitation volume ratio（acetone：crude extract）of 0.9，the resulting enzyme activity is 810.00U/g，The specific activity is 3240.00 U/mg. Conclusion：The present process of extraction of superoxide dismutase from active dry yeast by isopropanol was improved，which reduced the consumption of raw materials and saved time and energy.

Key words：Active dry yeast；Superoxide dismutase；The extraction process

超氧化物歧化酶又名肝蛋白，能專一地清除生物氧化過程中產(chǎn)生的超氧陰離子自由基并減少和阻止脂質(zhì)的過氧化反應(yīng)、延緩機(jī)體衰老，在生物體中具有重要功能[1，2]。目前，超氧化物歧化酶的主要來源是從牲畜動(dòng)物血中提取，其安全性及質(zhì)量均不穩(wěn)定，且原料來源受到很大的限制[3]。隨著發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展，到了20世紀(jì)80年代后期，美國(guó)和日本先后利用發(fā)酵法生產(chǎn)超氧化物歧化酶，雖然大大降低了生產(chǎn)成本，但也存在著提取工藝復(fù)雜的問題。目前國(guó)內(nèi)一些實(shí)驗(yàn)室研究利用酵母菌提取超氧化物歧化酶，酵母菌生產(chǎn)超氧化物歧化酶具有繁殖快、代謝時(shí)間短、產(chǎn)率高、易培養(yǎng)、易規(guī)模化生產(chǎn)、不受季節(jié)與自然條件的限制等優(yōu)點(diǎn)[4]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道酵母菌是眾多微生物中超氧化物歧化酶含量最多的菌種之一[5]，本研究以酒精活性干酵母為提取原料，并對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1 方法與流程

1.1 菌種活化、保存與擴(kuò)大培養(yǎng) 菌種活化（采用葡萄糖水培養(yǎng)基[6]）：取5g葡萄糖置于500mL三角瓶中，加水200mL，溶解后于電爐加熱煮沸，冷卻后于121.3℃，103.4kP滅菌20min?；钚愿山湍?.4g，35℃條件下加入活化液中，自然冷卻至28℃后，置于28℃恒溫水浴箱中水浴活化4h。斜面保存（采用葡萄糖蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基）：按葡萄糖∶蛋白胨∶瓊脂∶酵母膏為8∶2∶2∶1的比例取量后加蒸餾水于121.3℃，103.4kP滅菌20min。取活化后菌種，在無菌工作臺(tái)進(jìn)行斜面接種，培養(yǎng)5d，冷藏保存?zhèn)溆?。擴(kuò)大培養(yǎng)（采用液體培養(yǎng)基[7]）∶按葡萄糖∶蛋白胨∶酵母膏∶磷酸二氫鉀：七水硫酸鎂為20∶5∶5∶2.5∶1的比例取量后加入微量Fe粉，加蒸餾水后于121.3℃，103.4kP滅菌20min。取適量保存菌種，接種后于28℃搖床培養(yǎng)24h后4000r/min離心10min后取濕菌體備用提取超氧化物歧化酶。

1.2 超氧化物歧化酶提取 采用異丙醇破壁，丙酮二次沉淀法。濕菌體與異丙醇（90%）按照1∶9的比例浸泡后抽濾除去有機(jī)溶劑，加入3倍體積、pH為7.0的磷酸鹽緩沖溶液，攪拌后4000r/min離心10min，收集上清液即為粗酶液。

1.3 酒精活性干酵母超氧化物歧化酶純化[8] 利用鹽酸調(diào)pH至5.0，按丙酮∶粗酶液體積為1∶1的比例混合搖勻，靜置一段時(shí)間后高速離心去除雜蛋白，調(diào)節(jié)pH至4.0為超氧化物歧化酶等電點(diǎn)，再按照適當(dāng)?shù)捏w積比混合丙酮與粗酶液后高速離心10min收集沉淀即可。

1.4 超氧化物歧化酶提取流程 酒精活性干酵母擴(kuò)大培養(yǎng)→收集發(fā)酵液→離心收集菌體→異丙醇浸泡→抽濾去除有機(jī)溶劑→磷酸鹽緩沖液攪拌處理→收集上清液→等電點(diǎn)沉淀法除雜蛋白→一次丙酮沉淀→等電點(diǎn)沉淀得超氧化物歧化酶→二次丙酮沉淀。

1.5 超氧化物歧化酶比活力測(cè)定方法[9] 活性干酵母超氧化物歧化酶酶活力測(cè)定：鄰苯三酚自氧化法（酶活單位定義：在25℃恒溫條件下，1mL反應(yīng)液中，1min抑制鄰苯三酚自氧化速率達(dá)50%的酶量定義為1個(gè)酶活單位）。

2 儀器與材料

2.1 試驗(yàn)儀器 無菌工作臺(tái)、恒溫?fù)u床、TDL-5離心機(jī)、多循環(huán)水式真空泵、恒溫磁力攪拌器、PHS-3型酸度計(jì)、布氏漏斗、抽濾瓶、分光光度計(jì)（可見光和紫外光）、高壓蒸汽滅菌箱、電子天平、三角瓶、燒杯、酸堿滴定管、移液管、玻璃棒、試管、接種環(huán)

2.2 試驗(yàn)材料 酒精活性干酵母（市售湖北安琪酵母公司生產(chǎn)）、異丙醇、丙酮、考馬斯亮藍(lán)G-250、磷酸緩沖溶液、Tris-HCL緩沖溶液、EDTA、鄰苯三酚、蛋白胨、瓊脂、酵母膏、葡萄糖、Fe粉、蒸餾水。

3 結(jié)果與分析

3.1 酒精活性干酵母超氧化物歧化酶提取的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 通過文獻(xiàn)報(bào)道與反復(fù)實(shí)驗(yàn)，確定提取工藝中的4個(gè)主要影響因素，分別是：A：異丙醇濃度；B：攪拌時(shí)間；C：1次丙酮濃度（體積比）；D：2次丙酮濃度（體積比），并根據(jù)文獻(xiàn)與實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，進(jìn)行水平取值，結(jié)果見表1，采用L9（34）正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果 通過正交試驗(yàn)結(jié)果分析，各項(xiàng)影響因素最佳水平組合為A2B1C2D2，即異丙醇濃度85%、攪拌時(shí)間16h、1次丙酮沉淀體積比（丙酮：粗提液）0.8、2次丙酮沉淀體積比（丙酮：粗提液）0.9。

3.3 優(yōu)化提取工藝后試驗(yàn)結(jié)果 L9（34）正交實(shí)驗(yàn)有效地優(yōu)化了活性干酵母超氧化物歧化酶的提取工藝，為了驗(yàn)證正交試驗(yàn)的結(jié)果，試驗(yàn)選取優(yōu)化后的工藝技術(shù)參數(shù)進(jìn)行反復(fù)試驗(yàn)，得出優(yōu)化提取工藝后的試驗(yàn)結(jié)果見表3。從表3可知，粗提液中酶的比活力、1次丙酮沉淀后酶的比活力、2次丙酮沉淀后酶的比活力呈遞進(jìn)式增長(zhǎng)，充分證明丙酮2次沉淀法純化活性干酵母超氧化物歧化酶的重要作用，且此法生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、成本低，具有一定的推廣研究?jī)r(jià)值。

4 結(jié)論與討論

異丙醇濃度水平取值為80%、85%、90%，實(shí)驗(yàn)證明：有機(jī)溶劑濃度為85%時(shí)，破壁提取效果最好好，選擇85%。通過對(duì)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析，發(fā)現(xiàn)2次丙酮沉淀體積是最大的影響因素，優(yōu)化后2次丙酮沉淀體積為0.9，攪拌時(shí)間是第2影響因素16h，且16h縮短了工藝流程，利于生產(chǎn)成本的降低，第3影響因素為1次丙酮沉淀體積，1次丙酮沉淀體積不能過高，否則導(dǎo)致過多超氧化物歧化酶隨著雜蛋白沉淀，降低酶提取率，最小的影響因素為異丙醇濃度。

通過大量實(shí)驗(yàn)，證明從活性干酵母中提取SOD的最佳工藝為異丙醇-丙酮2次沉淀法，基本工藝流程與關(guān)鍵技術(shù)參數(shù)如下：A：菌種活化與保存?zhèn)溆茫?5℃加入活化液，30℃活化4h）；B：液體發(fā)酵擴(kuò)大培養(yǎng)（28℃搖床振蕩培養(yǎng)，150rpm，培養(yǎng)24h）；C：異丙醇法細(xì)胞破壁提酶（85%異丙醇，攪拌16h，測(cè)定酶活）；D：第1步純化（1次丙酮沉淀）[丙酮：粗提液=0.8（體積比），測(cè)定酶活]；E：第2步純化（2次丙酮沉淀）[丙酮：粗提液=0.9（體積比），測(cè)定酶活]。

通過查閱文獻(xiàn)，對(duì)從酒精活性干酵母中制備的超氧化物歧化酶酶活性進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)：采用酶裂解法、氯仿-乙醇法、細(xì)胞自溶法和石英砂研磨法提取超氧化物歧化酶[10]，酶活性分別為691.7U/g、225.8U/g、706.9U/g和236.67U/g。在此次試驗(yàn)過程中經(jīng)過優(yōu)化的異丙醇-丙酮2次沉淀法酶活性為810.00U/g。因此，試驗(yàn)中獲得的酶活性較高優(yōu)于其他4種方法。

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（責(zé)編：張宏民）