桂枝加芍藥湯顆粒指紋圖譜及多指標成分含量測定方法研究

李明 李蕊 張佳諾 付靜

摘要 目的：探討桂枝加芍藥湯顆粒指紋圖譜及多指標成分含量測定方法。方法：采用島津高效液相色譜儀（LC-2010A），以乙腈-0.1%磷酸為流動相進行梯度洗脫，對標志性成分進行測定。結(jié)果：建立了桂枝加芍藥湯指紋圖譜、標定了5個共有峰，指認其中3個峰并對其進行含量測定。結(jié)論：本研究所建立的指紋圖譜及多指標含量測定方法能較好地評價桂枝加芍藥湯顆粒的質(zhì)量，并可提高該制劑的質(zhì)量標準，為保證產(chǎn)品質(zhì)量奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 桂枝加芍藥湯；HPLC指紋圖譜；芍藥苷

桂枝加芍藥湯出自《傷寒論》，常用于施治脾陰虧損、腸道失潤所致便秘、腹脹滿、口唇干燥的老年習慣性便秘患者^[1]。本方由桂枝、白芍、生姜、大棗、炙甘草組成。方中重用陰柔之芍藥滋養(yǎng)脾陰，復(fù)用味甘之炙甘草、大棗佐芍藥補益脾陰^[2]。方中用桂枝、生姜等陽藥是為脾陰不足、運化失職、氣機壅遏所致之腹脹滿而設(shè)。如此配伍，動靜結(jié)合，共奏滋養(yǎng)脾陰、調(diào)暢氣機之功，則斯癥愈矣。桂枝加芍藥湯作為中藥傳統(tǒng)經(jīng)典方已經(jīng)經(jīng)過了長期的臨床使用，不僅具有療效確切以及不良反應(yīng)較少的優(yōu)勢，而且來源于傳統(tǒng)，更突出了中醫(yī)藥特色。但是通過檢索文獻發(fā)現(xiàn)，未能檢索到對桂枝加芍藥湯質(zhì)量控制的方法。桂枝加芍湯中活性成分復(fù)雜多樣，為彌補質(zhì)量評價的不足，本實驗采用高效液相色譜法建立了桂枝加芍湯顆粒的指紋圖譜，并同時對其中3種活性成分進行控制，從而為深入研究桂枝加芍湯顆粒的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、配伍基礎(chǔ)提供了有效的分析手段，為經(jīng)典名方的開發(fā)提供參考依據(jù)。

材料

儀器：島津高效液相色譜儀（LC-2010A），KQ-3000DB超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；MettlerToledo AL104電子天平（瑞士梅特勒一托利多公司，精度：0.001 g），Mettler ToledoXP26電子天平（瑞士梅特勒一托利多公司，精密度：0.01 mg）。

試藥：乙腈（色譜純，411瓶飛世爾批號：146971），水為屈臣氏蒸餾水（4.5 L/瓶，廣州屈臣氏食品飲料有限公司北京飲料分公司），磷酸為分析純（500 mL/瓶，國藥集團化學試劑有限公司，批號：20141104）。桂枝加芍藥湯顆粒南北京康仁堂藥業(yè)有限公司自制^[3-5]；芍藥苷對照品（批號：110736-201640，購于中國食品藥品檢定研究院）；甘草苷（批號：111610-201106購于中國食品藥品檢定研究院）；甘草酸銨對照品（批號：110731-201116，購于中國食品藥品檢定研究院）。

方法與結(jié)果

色譜條件：①色譜柱：美國安捷倫科技有限公司Agilent C18（4.6 mm × 250 mm，5μm）；檢則波長267 nm，流速1 mL/min；②柱溫：25℃；進樣量10 μL；③流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B）采用下表梯度洗脫^[6]。見表1，進樣量10 μL，色譜圖，見圖1。

供試品溶液的制備：取桂枝加芍藥湯顆粒約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加蒸餾水50 mL，稱定重量，超聲處理15 min，使溶解，放冷，再稱定重量，用蒸餾水補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

陰性樣品制備：制備缺白芍、缺炙甘草陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性溶液。

對照品溶液的制備：精密稱取芍藥苷適量，加甲醇制成每1 mL含芍藥苷60μg；精密稱取甘草苷、甘草酸銨對照品適量，加70%乙醇制成每1 mL含甘草苷20μ斗g、含甘草酸銨0.2 mg的混合對照品，即得。

方法學考察^[7，8]：①精密度試驗：取同一供試品溶液，在2.1項下的色譜條件下重復(fù)進樣6次，測得各共有峰相對保留時間和相對峰面積（參比峰為甘草苷）的RSD均<3%，表明儀器精密度良好，符合指紋圖譜的技術(shù)要求。②穩(wěn)定性試驗：取同一供試品溶液，在2.1項下的色譜條件下，分別在0、2、4、8、12、24 h進樣，測得各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均<3%，表明供試品溶液在24 h穩(wěn)定。③重復(fù)性試驗：取同一批桂枝加芍藥湯顆粒6份，按2.2項下制備供試品溶液，在2.1項下的色譜條件下，測得各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均<3%表明該方法重復(fù)性良好，符合指紋圖譜的技術(shù)要求。

指紋圖譜建立及相似度分析：桂枝加芍藥湯顆粒的HPLC指紋圖譜的建立：取10批桂枝加芍藥湯顆粒樣品，分別按供試品溶液的制備和檢測方法進行檢測，記錄指紋圖譜。因甘草苷峰面積相對加大且穩(wěn)定，故以其為參照峰，計算各共有峰相對保留時間，10批樣品共有峰相對保留時間的RSD均<0.5%符合指紋圖譜的要求。運用中國藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012版”對10批樣品的指紋圖譜進行分析，設(shè)定樣品1為參照圖譜。選取9個特征峰進行多點校正，自動匹配，生成對照指紋圖譜，見圖2。匹配后的10批樣品譜圖見圖3，然后進行各樣品相似度評價，樣品1～10的相似度分別為0.987、0.978、 0.987、 0.988、 0.994、 0.978、0.979、0.981、0.979、0.971。10批桂枝加芍藥湯顆粒指紋圖譜相似度均>0.90，符合指紋圖譜要求。

含量測定方法與結(jié)果^[9]

色譜條件：按2.1項下色譜條件進行檢測，以3種對照品計算理論塔板數(shù)>5 000，分離度> 1.5。

對照品溶液的制備：精密稱取芍藥苷適量，加甲醇制成每1 mL含芍藥苷60 μg；精密稱取甘草苷、甘草酸銨對照品適量，加70%乙醇制成沒1 mL含甘草苷20μg、含甘草酸銨0.2 mg的混合對照品，即得。

對照品溶液的制備：取桂枝加芍藥湯顆粒約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加蒸餾水50 mL，稱定重量，超聲處理15 min，使溶解，放冷，再稱定重量，用蒸餾水補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

線性范圍的考察：精密稱取芍藥苷對照品12.18 mg，置于100 mL容量瓶中，加甲醇使溶解，定溶至刻度，搖勻。分別吸取1 mL、3 mL、5 mL、7 mL、9 mL、10 mL溶液置10 mL容量瓶中，加甲醇定溶至刻度，即得。取芍藥苷對照品溶液10 μL注入液相色譜儀，按2.1項下色譜條件測定，記錄峰面積，以色譜峰的峰面積為縱坐標，進樣量為橫坐標，繪制標準曲線，求得芍藥苷的回歸方程y=14 011x+14 883（R²=0.999 9） （R²=0.999 9），表明芍藥苷0.122～ 1.218μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。精密稱取甘草苷、10.08 mg甘草酸銨對照品10.27 mg，置50 mL容量瓶中，加70%乙醇使溶解，定容至刻度，搖勻。分別吸取1 mL、3 mL、5 mL、7 mL、9 mL、10 mL溶液置10 mL容量瓶中，加70%乙醇定容至刻度，即得。取甘草苷、甘草酸銨混合對照品溶液10 μL注入液相色譜儀，按2.1項下色譜條件測定，記錄峰面積，以色譜峰的峰面積為縱坐標，進樣量為橫坐標，繪制標準曲線，求得甘草苷的回歸方程為y=2E+ 06x-3975.9（R²=0.9999），表明甘草苷在0.202～ 4.032μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。求得甘草酸銨的回歸方程y=533487x+8668.2（R²=0.9995），表明甘草酸銨在0.201～ 4.025μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。見圖4～6。

準確度實驗：精密稱取桂枝加芍藥湯顆粒6份，每份0.5 g，置于50 mL容量瓶中，加水適量，超聲溶解后，加入濃度為1.392 0 mg/mL的芍藥苷、0.182 6mg/mL甘草苷、0.426 4 mg/mL的甘草酸胺混合對照品溶液5 mL，加水定容至50 mL，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按2.1項下色譜條件測定，測定芍藥苷、肉桂酸、甘草苷的含量，并計算回收率，芍藥苷平均回收率為104.1%，RSD為0.39%，甘草苷平均回收率為100.12%，RSD為2.72%，甘草酸銨平均回收率為100.45%，RSD為1.97%，回收率符合相關(guān)要求。見表2。

專屬性實驗：將2.3項所獲得的陰性供試品溶液按2.1項下色譜條件進行測定，所得結(jié)果無陰性干擾，故本方法專屬性較好，見圖7。

樣品測定：精密稱取10批桂枝加芍藥湯顆粒，分別按2.2項下制備供試品，按2.1項下條件測定，見表3。

討論

指紋圖譜與一測多評結(jié)合的優(yōu)勢：由于桂枝加芍藥湯顆粒成分復(fù)雜多樣，目前還沒有針對桂枝加芍藥湯相關(guān)的質(zhì)量控制方法出現(xiàn)，故本實驗采用梯度洗脫對桂枝加芍藥湯顆粒中芍藥苷、甘草苷、甘草酸銨含量進行測定，并同時建立了指紋圖譜的研究方法。將指紋圖譜技術(shù)與多指標成分定量技術(shù)相結(jié)合，建立了桂枝加芍藥湯配方顆粒的質(zhì)量控制方法。

定量指標的選擇：桂枝加芍藥湯中白芍養(yǎng)營陰，緩肝急，止腹痛。炙甘草益氣和中，調(diào)和諸藥。故本研究選取其中相對穩(wěn)定的芍藥苷、甘草苷、甘草酸銨作為質(zhì)量控制成分；適合對桂枝加芍藥湯顆粒質(zhì)量進行完整表達。

色譜條件的選擇：本實驗參照相關(guān)文獻，選擇峰強度及分離度相對較好的267 nm作為檢測波長，通過實驗考察將乙腈-0.1%磷酸溶液作為梯度洗脫流動相，得到的色譜峰分離效果好，樣品獲得了合適的保留值，通過方法學的驗證，所得檢測結(jié)果RSD值均符合要求，故以上述建立的指紋圖譜結(jié)合多指標成分定量方法及樣品處理條件對桂枝加芍藥湯顆粒進行指紋圖譜比對及定量分析是可行的。

參考文獻

[1]高鳳霞.對桂枝加芍藥湯和桂枝加大黃湯的功用分析[J].西南國防醫(yī)藥，2010，20（4）：455-456.

[2]李飛.方劑學[M].北京：人民衛(wèi)生出版社.2015.

[3]尹蕊.黃芪桂枝五物湯的提取工藝研究[J].中國藥學報，2014，42（3）：76-78.

[4]陳永祥.正交試驗優(yōu)選黃芪桂枝五物湯的水提取工藝[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18（2）：56-58.

[5]陳瑩蓉.桂枝湯類方化學成分含量研究[J].中成藥，2010，32（6）：996-1000.

[6]陳永祥.黃芪桂枝五物湯顆粒的藥學研究[D].河南中醫(yī)藥學院，2012.

[7]國家藥品監(jiān)督管理局注冊司.中藥新藥質(zhì)量標準、穩(wěn)定性、對照品研究的技術(shù)要求[J].中藥新藥與臨床藥理.1999，10（5）：314-318.

[8]尹睿卓，王嘉仡，包永睿，等.山綠茶降壓指紋圖譜及一測多評法多指標成分定量研究[J].中國新藥雜志，2015，24（15）：132-137.

[9]孟憲生，艾立，羅國安，等.基于腰痛寧指紋圖譜多指標成分定量方法研究[J].中成藥，2009，31（5）：657-659.