松花粉對紅白錦鯉生長性能、消化及非特異性免疫力的影響

朱浩然， 劉 芳， 張寶龍， 楊 廣， 王 洋， 朱國霞， 高微微， 白東清

(1.天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384； 2.天津現(xiàn)代晨輝科技集團有限公司天津市水族動物功能性飼料企業(yè)重點實驗室，天津 301800)

錦鯉(Cyprinuscarpiovar.koi)在生物學(xué)上屬于鯉形目鯉科(Cyprinidae)，是名貴觀賞魚品種之一。錦鯉是一種高檔觀賞魚，已在全世界風(fēng)靡，有“水中活寶石”“會游泳的藝術(shù)品”的美稱。其中，以紅白錦鯉為代表種，但紅白錦鯉屬于近親繁殖，自身免疫力低下，易感染疾病，從而降低了觀賞價值。因此，開發(fā)一種新的免疫增強劑，提高其生長性能、消化能力及非特異性免疫力是觀賞漁業(yè)發(fā)展過程中的研究難點。

松花粉(pollenpini)是松科植物馬尾松(PinusmassonianaLamb.)、油松(PihustabulaefermisCarr.)或同屬數(shù)種植物的干燥花粉，有止血的功效[1]，且?guī)缀鯚o毒[2]。松花粉具有提高抗氧化能力、增強身體免疫功能、延緩衰老[3-4]等作用，松花粉中所含微量元素、黃酮類、維生素E及胡蘿卜素等，均有清除體內(nèi)自由基作用[5]，可提高機體抗氧化酶類的活性，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。松花粉含有豐富多糖，已有大量試驗表明，多糖能有效消除自由基，提高機體抗氧化能力[6-7]。松花粉大多用作人體保健品，作為動物免疫增強劑的研究較少，在水產(chǎn)方面還未見報道。鑒于此，本試驗選取紅白錦鯉為研究對象，在飼料中添加不同含量水平的松花粉，研究其對紅白錦鯉的生長性能、消化酶活力、非特異性免疫能力的影響，探索紅白錦鯉飼料添加松花粉的最適水平，為水產(chǎn)動物免疫增強劑的開發(fā)提供一定理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗魚 試驗用魚購自天津現(xiàn)代晨輝科技集團有限公司，均為同批次健康且規(guī)格一致的紅白錦鯉，初始體質(zhì)量為(8.14±1.56) g，初始體長為(7.84±0.33) cm。

1.1.2 試驗試劑 試驗用配合飼料購自天津市晨輝飼料有限公司，飼料營養(yǎng)成分：粗蛋白含量為40.11%，粗脂肪含量為11.15%，粗灰分含量為9.67%，水分含量為5.79%，鈣含量為2.57%，磷含量為0.29%。

松花粉為煙臺新時代健康食品有限公司生產(chǎn)的國珍破壁松花粉(含粗多糖16.20 mg/g)。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗魚分組及管理 將540尾試驗用魚在天津現(xiàn)代晨輝科技集團有限公司的養(yǎng)殖池中暫養(yǎng)1周后進行分組，隨機分配到18個網(wǎng)箱(1 m×1 m×1 m)中，每6個網(wǎng)箱放置于1個養(yǎng)殖池(2.25 m×2.25 m×0.70 m)內(nèi)，標(biāo)記為S1～S6，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)30尾魚，每日投喂2次(08：00、16：00)，投喂率為3%，每2 d換水1/5，每7 d刷池子1次。飼養(yǎng)時間為2017年7—10月。

1.2.2 飼料配制及飼養(yǎng)管理 在基礎(chǔ)飼料中添加不同含量水平(0.0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)的松花粉，添加不同含量水平(3.5%、3.0%、2.5%、2.0%、1.5%、1.0%)次粉，每組均加入0.5%大蒜素，配制成6種飼料，記為S1～S6。飼料粉末用80目篩進行過篩，混合均勻，用飼料顆粒機將混合好的飼料制成粒徑大約為2.00 mm的沉性顆粒飼料，放在通風(fēng)、陰涼處晾干。

1.2.3 樣本采集 養(yǎng)殖30 d后，禁食48 h，測量各組魚的體質(zhì)量、體長，計算增質(zhì)量率、特定生長率、蛋白質(zhì)效率及餌料系數(shù)，解剖魚體，將采集的肝胰臟、脾、頭腎、中腎、腦、鰓組織分別放進自封袋(整個過程在冰袋上操作以保持組織新鮮)，凍存于-80 ℃冰箱。組織測定前用勻漿機在冰浴條件下研磨，各組織與鹽水體積比1 ∶9浸入生理鹽水(0.85%)，將勻漿液倒入離心管中，于4 ℃、3 500 r/min條件下離心10 min后，吸取上清液轉(zhuǎn)移到新離心管中，再進行各指標(biāo)的測定。

1.2.4 生長指標(biāo)測定 生長試驗開始和結(jié)束時，測量各組魚的體質(zhì)量、體長，計算增質(zhì)量率、特定生長率、餌料系數(shù)及蛋白質(zhì)效率。

增質(zhì)量率(WG)=(Wt-W0)/W0×100%；特定生長率(SGR)=[ln(Wt)-ln(W0)]/t×100%；蛋白質(zhì)效率(PER)=(Wt-W0)/(Id×Pd)；飼料系數(shù)(FCR)=Id/(Wt-W0)。

式中：Wt為末期魚體質(zhì)量(g)；W0為初始魚體質(zhì)量(g)；L為試驗?zāi)~體長(cm)；Id為攝食總量(g)；Pd為飼料中蛋白含量(g)；t為飼養(yǎng)時間(d)。

1.2.5 非特異性免疫指標(biāo)測定 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，簡稱SOD)活性、丙二醛(malonaldehyde，簡稱MDA)含量、過氧化氫酶(catalase，簡稱CAT)活性、谷胱甘肽(glutathione，簡稱GSH)含量、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，簡稱GSH-PX)活性、一氧化氮(NO)含量等指標(biāo)均采用南京建成生物科技有限公司的試劑盒測定。

1.2.6 消化酶測定 脂肪酶(lipase，簡稱LPS)、淀粉酶(amylase，簡稱AMS)活性等指標(biāo)均采用南京建成生物科技公司的試劑盒測定。蛋白酶測定采用福林酚法。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計 試驗數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，采用SPSS 16.0進行分析，試驗結(jié)果用單因素方差分析(one-way ANOVA)進行數(shù)據(jù)處理，差異顯著時用鄧肯氏多重比較(Duncan’s multiple range tests)法進行平均值的多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料中不同含量水平松花粉對紅白錦鯉生長性能及飼料利用率的影響

養(yǎng)殖1個月后，飼料中不同水平松花粉明顯影響紅白錦鯉的生長性能和餌料系數(shù)。由表1可知，S5組錦鯉末期平均體質(zhì)量顯著高于其他組。各組的增質(zhì)量率、蛋白質(zhì)效率等指標(biāo)隨著松花粉含量水平的增加整體呈先上升后下降的趨勢，且S1組最低，其中S5組增質(zhì)量率、特定生長率和蛋白質(zhì)效率顯著高于其他組。餌料系數(shù)隨著松花粉含量水平的增加呈先下降后上升的趨勢，試驗組各項指標(biāo)均低于S1組。S4～S6組餌料系數(shù)顯著低于對照組，餌料系數(shù)最低值出現(xiàn)在S5組，比S1組降低49.02%。

表1 飼料中不同含量水平松花粉對紅白錦鯉生長指標(biāo)和飼料利用率的影響

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著，下表同。

2.2 飼料中不同含量水平松花粉對紅白錦鯉非特異性免疫力的影響

2.2.1 飼料中不同含量水平松花粉對紅白錦鯉組織中SOD活性的影響 由表2可知，養(yǎng)殖1個月后，在紅白錦鯉肝胰臟、脾臟、中腎、頭腎、腦、和鰓中SOD活性最強的器官是肝胰臟。各試驗組紅白錦鯉體內(nèi)SOD活性均大于S1組，在肝胰臟中，SOD活性最高值出現(xiàn)在S3組，是S1組的2.29倍，S2、S4、S5、S6組SOD活性分別是S1組的1.89、1.23、1.61、1.54倍；S2、S5組中腎中SOD活性明顯提升，分別是S1組的1.09、1.17倍。S2～S6組腦中SOD活性明顯提升，均顯著高于S1組，各組SOD活性分別是S1組的2.76、3.15、3.45、3.33、2.34倍。S4組鰓中SOD活性顯著高于S1、S2、S3、S6組，分別是S1、S2、S3、S6組的2.21、2.16、1.98、2.01倍。松花粉對紅白錦鯉脾臟、頭腎的SOD活性影響不大。

2.2.2 飼料中不同含量水平松花粉對紅白錦鯉組織中CAT活性的影響 由表3可知，隨著松花粉含量水平的增加，各組組織中CAT活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。對照組(S1組)CAT活性排序為肝胰臟>頭腎>中腎>鰓>腦>脾臟。S5組肝胰臟CAT活性顯著高于其他組，是S1組的 1.66 倍，且其他組間差異不顯著。S4、S5組脾臟CAT活性顯著高于S1組，分別為S1組的3.85、3.93倍，且S5組CAT活性最高。S2～S6組頭腎的CAT活性顯著高于S1組，分別是S1組的2.82、3.11、3.29、3.81、2.30倍。S4組中腎CAT活性顯著高于S1組，是S1組的1.55倍。S2、S3組腦中CAT活性顯著高于S1組，分別是S1組的6.14、9.94倍。S3組鰓CAT活性明顯高于S1組，是S1組的3.00倍。

表2 飼料中不同含量水平松花粉對紅白錦鯉組織中SOD活性的影響

表3 飼料中不同含量水平松花粉對紅白錦鯉組織中CAT活性的影響

2.2.3 飼料中不同含量水平松花粉對紅白錦鯉組織中MDA含量的影響 由表4可知，隨著松花粉含量水平的增加，各組組織中MDA含量整體呈先下降后上升的趨勢，且各試驗組MDA含量均低于對照組。S1組各組織中MDA含量由高到低依次為腦>頭腎>肝胰臟>脾臟>鰓>中腎。與S1組相比，S2～S5組肝胰臟中MDA含量顯著降低，比S1組分別降低了69.53%、70.35%、82.31%、86.40%；S3～S6組的脾臟中MDA含量顯著下降，最低值出現(xiàn)在S4組，比對照組降低38.07%；S5組頭腎中MDA含量比對照組低93.20%；S3組中腎MDA含量比對照組下降46.46%；各組腦、鰓中MDA含量變化不大，但最低值均出現(xiàn)在S5組。

表4 飼料中不同含量水平松花粉對紅白錦鯉組織MDA含量的影響

2.2.4 飼料中不同含量水平松花粉對紅白錦鯉組織中GSH含量的影響 由表5可知，在紅白錦鯉肝胰臟、頭腎、中腎、腦、脾臟和鰓中，GSH含量最高的組織是肝胰臟，且各添加組組織中GSH含量均高于對照組。S5組肝胰臟中GSH含量顯著高于其他各組，分別是其他各組的3.03、2.52、1.80、1.60、2.41 倍；與S1組相比，S5組頭腎中GSH含量顯著提高；S5、S6組中腎中GSH含量顯著增加；S4組腦中GSH含量比對照組提高了4.55倍；各組脾臟、鰓中GSH含量最大值均出現(xiàn)在S4組，分別比對照組提高了4.15、1.42倍，但各組均無顯著差異。

表5 飼料中不同含量水平松花粉對紅白錦鯉組織中GSH含量的影響

2.2.5 飼料中不同含量水平松花粉對紅白錦鯉組織中 GSH-PX 活性的影響 由表6可知，各試驗組組織中GSH-PX活性整體高于對照組，對照組GSH-PX活性由高到低依次為肝胰臟>頭腎>脾臟>中腎>腦>鰓。S4、S5組脾臟與S3～S6頭腎中GSH-PX活性均顯著高于對照組，分別比S1組提高 10.36%～17.29%、116.57%～240.57%；S3、S4組中腎GSH-PX活性顯著高于對照組和其他各試驗組(P<0.05)，其中S4組活性比對照組提高 1.37 倍；S3～S5組腦中GSH-PX活性比S1組提高1.53～4.31倍(P<0.05)，且顯著高于S1、S2、S6組；投喂含松花粉的飼料30 d對肝胰臟、鰓中GSH-PX活性影響不大。可見，S3～S6處理均在不同程度上提高了組織中GSH-PX活性。

2.2.6 飼料中不同含量水平松花粉對紅白錦鯉組織中NO含量的影響 由表7可知，飼料中添加松花粉對紅白錦鯉頭腎、腦、鰓中NO含量均無明顯影響。S3組肝胰臟中NO含量顯著高于其他組；S3～S6組脾臟中NO含量均顯著高于S1、S2組，其中含量最高組出現(xiàn)在S5組，為對照組的2.11倍。S5組中腎中NO含量顯著高于S1、S2、S4組。

表6 飼料中不同含量水平松花粉對紅白錦鯉組織中GSH-PX活性的影響

表7 飼料中不同含量水平松花粉對紅白錦鯉組織中NO含量的影響

2.3 飼料中不同含量水平松花粉對紅白錦鯉腸道消化酶活性的影響

2.3.1 飼料中不同含量水平松花粉對紅白錦鯉腸道脂肪酶活性的影響 由表8可知，試驗組前腸、中腸、后腸的脂肪酶活性呈先上升后下降的趨勢，對照組脂肪酶活性排序為中腸>前腸>后腸。S4組前腸的脂肪酶活性顯著高于對照組，比對照組提高了1.07倍；中腸、后腸脂肪酶活性變化不明顯。

表8 松花粉對錦鯉腸道脂肪酶活性的影響

2.3.2 飼料中不同含量水平松花粉對紅白錦鯉腸道淀粉酶活性的影響 由表9可知，試驗組的前腸、中腸、后腸的淀粉酶活性整體呈先上升后下降的趨勢。松花粉對前腸淀粉酶活性影響不大；S5組中腸淀粉酶活性顯著高于其他各組，比S1組提高了70.33%；S4組后腸淀粉酶活性顯著高于對照組，且S4組提高最大，比對照組提高了3.80倍。

表9 松花粉對錦鯉腸道淀粉酶活性的影響

2.3.3 飼料中不同含量水平松花粉對紅白錦鯉腸道蛋白酶活性的影響 由表10可知，試驗組的前腸、中腸、后腸的蛋白酶活性基本上均高于對照組，且后腸蛋白酶活性最高。S3、S4、S6組前腸蛋白酶活性顯著高于S1、S2組；S3～S6組中腸蛋白酶活性顯著高于S1組，最高值出現(xiàn)在S5組，比S1組高1.62倍。各組后腸蛋白酶活性變化不大。

表10 松花粉對錦鯉腸道蛋白酶活性的影響

3 討論

3.1 飼料中添加松花粉對紅白錦鯉生長性能及飼料利用率的影響

在本試驗條件下，松花粉添加水平在2.0%時，增質(zhì)量率、特定生長率、蛋白質(zhì)效率顯著高于對照組，餌料系數(shù)顯著降低，說明飼料中添加松花粉可以在一定程度上促進紅白錦鯉的生長性能，提高飼料利用率。松花粉具有豐富的多糖，可以促進動物生長，與中藥多糖在生長中的作用結(jié)論類似，如吳旋用4種中藥多糖，可促進黃顙魚生長增質(zhì)量、降低餌料系數(shù)[8]。同時，松花粉中含有多種氨基酸、常量及微量礦物元素與維生素等營養(yǎng)成分，尤其是松花粉中含有豐富的類胡蘿卜素。白東清等發(fā)現(xiàn)，1.0 g/kgβ-胡蘿卜素組紅白錦鯉的增長率、增質(zhì)量率、特定增長率顯著高于對照組，1.0～2.5 g/kg組的餌料系數(shù)均顯著低于對照組[4]，與本試驗結(jié)果相似。

3.2 飼料中添加松花粉對紅白錦鯉非特異性免疫的影響

抗氧化能力主要是由超氧化物歧化酶、過氧化氫酶以及丙二醛來綜合反映的。SOD是魚體內(nèi)氧化的關(guān)鍵酶，能消除魚體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，其活性的高低可以反映抗氧化系統(tǒng)氧自由基清除機制的高低和體內(nèi)氧自由基水平的高低。SOD活性的升高促使SOD催化分解超氧陰離子，從而在一定程度上保護細胞免受氧自由基的損害，在修復(fù)受損細胞上也有一定作用[9]。CAT的作用是分解H2O2生成O2和H2O，保護細胞免受損傷[10]。MDA是脂質(zhì)過氧化作用的最終產(chǎn)物，其含量可以間接反映機體的活性氧自由基和脂質(zhì)的過氧化水平[11]。還原型谷胱甘肽是機體內(nèi)最重要的非酶型抗氧化物，具有清除自由基、解毒、促進鐵質(zhì)吸收及維持細胞的正常生長發(fā)育及細胞免疫等多種重要生理功能。谷胱甘肽過氧化酶可以促進GSH反應(yīng)生成H2O及氧化型谷胱甘肽。本試驗結(jié)果表明，松花粉在一定程度上可以有效提高紅白錦鯉魚體抗氧化能力，表現(xiàn)在提高SOD、CAT、GSH-PX活性，使魚體內(nèi)GSH含量升高，降低MDA含量。

中醫(yī)衰老說的藥理試驗證明，松花粉中含有大量抗氧化物質(zhì)，如維生素E、胡蘿卜素及微量元素硒，可以抑制體內(nèi)脂肪和蛋白質(zhì)氧化反應(yīng)。同時近期的研究表明，松花粉具有提高抗氧化能力、增強免疫功能等功效[12]。此外，松花粉含有酶、黃酮、多肽等生理活性物質(zhì)。已有大量研究表明，黃酮可以有效清除自由基，提高抗氧化活力：周曉麗等利用體外試驗檢測發(fā)現(xiàn)，木瓜黃酮對DPPH自由基有清除作用[13]。王芳等發(fā)現(xiàn)，桑葉黃酮對DPPH自由基也有顯著的清除作用[14]。本試驗結(jié)果表明，不同水平松花粉對組織的CAT活性、MDA含量、SOD活性、GSH含量、GHS-PX活性有顯著影響，說明松花粉可有效清除自由基?？梢?，松花粉可將多種超氧化物、過氧化物、氧化物等自由基分解或還原，從而起到抗氧化、提高免疫力的作用。張暾等發(fā)現(xiàn)，破壁松花粉對小鼠免疫有調(diào)節(jié)功能[15]。回晶等研究發(fā)現(xiàn)，松花粉黃酮提取物對超氧陰離子自由基有良好清除能力，表明松花粉黃酮提取物具有良好的體外抗氧化作用[16]。趙立新等發(fā)現(xiàn)，用含松花粉的飼料投喂小鼠，結(jié)果表明松花粉能明顯增加衰老小鼠血清中SOD活性、CAT活性、GSH-PX活性，降低腦組織中MDA含量[17]。以上研究成果與本試驗結(jié)果基本相吻合，值得注意的是本試驗中松花粉對腦中MDA含量變化影響不顯著，但各試驗組MDA含量均低于對照組，這可能與養(yǎng)殖對象、抗氧化劑和組織沉積部位有關(guān)。

本研究結(jié)果表明，隨著松花粉含量水平的增高，魚體內(nèi)各組織SOD、CAT活性均提高，且各組織的CAT活性均高于對照組；肝胰臟、中腎、腦、鰓的SOD活性均較對照組有明顯提升，試驗組頭腎、脾臟SOD活性與對照組差異不顯著；肝胰臟、脾臟、頭腎、中腎的MDA含量均明顯低于對照組，而腦、鰓降低不顯著。此結(jié)果說明，松花粉可以提高錦鯉魚體抗氧化酶活性和促進還原性物質(zhì)的生成。

添加松花粉后，紅白錦鯉肝胰臟、頭腎、中腎、腦的GSH含量明顯提升，脾臟、鰓提升不顯著；部分處理脾臟、頭腎、中腎、腦的GSH-PX活性顯著高于對照組；頭腎、中腎、腦中GSH含量、GSH-PX活性呈正相關(guān)。GSH-PX的主要生理功能是催化GSH參與過氧化反應(yīng)，清除在細胞呼吸代謝過程中產(chǎn)生的過氧化物和羥自由基，從而維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[18]。由于該指標(biāo)在各個組織的含量分布不同，所以其調(diào)控機制還須要深入研究。

一氧化氮(即血管內(nèi)皮舒張因子)在魚體內(nèi)作為一種反應(yīng)性極強的自由基，具有廣泛的生理作用，如免疫調(diào)節(jié)。本研究結(jié)果表明，肝胰臟、脾臟、中腎中NO含量有明顯變化，腦、鰓、頭腎中NO含量變化不明顯。NO產(chǎn)生異常與某些疾病發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系，但是NO的免疫調(diào)節(jié)影響還須要進一步探討。

3.3 飼料中添加松花粉對紅白錦鯉腸道消化酶的影響

腸道是錦鯉的消化吸收器官，其對魚類來說尤其重要，紅白錦鯉無胃，對營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收只能通過腸道。消化酶是消化系統(tǒng)分泌的具有催化食物分解作用的一類酶，蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶是紅白錦鯉腸道中較重要的消化酶。消化酶活性的大小直接影響魚體對食物中營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，從而對魚類的生長具有重要作用[19-20]。

松花粉富含多種營養(yǎng)成分和生物活性物質(zhì)，其中的維生素B1可以促進腸道蠕動，增強消化功能，張玉英等觀察發(fā)現(xiàn)，投喂黑松花粉可以使豚鼠結(jié)腸、小腸平滑肌活動加強，增加豚鼠腸道雙歧桿菌數(shù)量[21]。趙霖等在家豬飼料中添加3.5%松花粉，發(fā)現(xiàn)松花粉飼料顯著增加了家豬糞便中甘油三酯、膽固醇、脂肪酸及膽酸的排泄量[22]。本試驗對錦鯉的前腸、中腸、后腸進行了消化酶測定，結(jié)果表明，試驗組的淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶活性對比對照組均有所提升，1.0%～2.0%水平的松花粉添加組效果較好，說明松花粉對錦鯉腸道的消化有促進作用，且松花粉添加量在1.0%～2.0%時，中腸的脂肪酶、淀粉酶含量均高于前腸、后腸。這可能與松花粉含有的促消化的特殊營養(yǎng)成分，例如維生素E、胡蘿卜素等有關(guān)。羅輝試驗表明，幼建鯉腸道皺襞高度受到飼料中維生素E的影響，維生素E通過抗氧化作用保護腸道細胞的結(jié)構(gòu)完整和膜的流動[23]。同時，有關(guān)松花粉對觀賞魚腸道影響的研究還很少，有待于深入研究。

4 結(jié)論

本試驗在飼料中添加不同水平的松花粉(0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)對紅白錦鯉進行投喂30 d的養(yǎng)殖試驗，綜合生長指標(biāo)、抗氧化指標(biāo)和消化酶指標(biāo)結(jié)果表明，紅白錦鯉飼料中松花粉適宜添加水平為2.0%。