肉豆蔻揮發(fā)油對低氧誘導肺動脈平滑肌細胞增殖的抑制作用及其抗氧化活性

馬 可，南星梅，蘇姍姍，張得鈞，李占強，，蘆殿香，

（1.青海大學高原醫(yī)學研究中心，青海西寧 810001；2.青海省高原醫(yī)學應(yīng)用基礎(chǔ)研究重點實驗室，青海西寧 810001；3.青海出入境檢驗檢疫局，青海西寧 810006；4.青海大學生態(tài)環(huán)境工程學院，青海西寧 810016）

低氧性肺動脈高壓（hypoxic pulmonary artery hypertension，HPAH）在臨床是一種由低氧引起的危及生命的慢性進行性疾病，伴有肺壓異常升高和右心衰竭等癥狀，其病因復雜，預后極差，屬于肺動脈高壓中重要的一類［1］。目前，HPAH的發(fā)病機制尚無明確定論，持續(xù)低氧會引起肺動脈平滑肌一系列的適應(yīng)性變化，包括肺動脈平滑肌細胞（pulmo?nary artery smooth muscle cells，PASMC）增殖和肺動脈管腔狹窄等［1］，其發(fā)病機制包括2個階段：早期低氧性肺動脈收縮和后期低氧性肺血管重構(gòu)［2］。國內(nèi)外多項研究證實，低氧誘導PASMC的異常增殖是HPAH發(fā)病進程中的關(guān)鍵因素，同時PASMC也是引起肺血管收縮及肺血管重構(gòu)過程的主要效應(yīng)細胞［3］。目前，臨床上現(xiàn)有的藥物包括他汀類、一氧化氮類和內(nèi)皮素類［4］等，作用雖較明顯，但臨床表現(xiàn)的副作用也十分嚴重［5-6］。

三味檀香散最早收載于藏醫(yī)藥經(jīng)典著作《四部醫(yī)典》，由檀香、肉豆蔻和廣棗3味藥材組成，具有清熱的功效，用于胸悶不適和心煩心痛等癥狀。前期研究發(fā)現(xiàn)，該藥能改善低氧誘導的大鼠肺動脈高壓及肺小動脈血管的重構(gòu)［7-8］。肉豆蔻（Myristica fragrans）作為三味檀香散中主要藥材之一，其活性成分主要為揮發(fā)油和木脂素類化合物，具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗癌、降血糖和保肝等作用［9］，但這些成分在該藥干預低氧性肺動脈高壓過程中的作用和機制尚不明確。本研究分析肉豆蔻揮發(fā)油（volatile oil fromM.fragrans，VOMF）的化學成分，并對其體內(nèi)外抗氧化及對低氧誘導的PASMC增殖的作用進行研究，為三味檀香散干預HPAH的藥效物質(zhì)及作用機制研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥材、試劑和主要儀器

藥材于2017年8月購于青海中藏藥材市場，由青海大學張得鈞教授鑒定為肉豆蔻。1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，美國 Sigma公司），2，4，6-三吡啶基三嗪（TPTZ，東京化工業(yè)株式會社）、抗壞血酸（Vc）（天津市永大化學試劑有限公司），MTS（美國普羅麥格公司），乙醇、乙酸、濃鹽酸、硫酸亞鐵（Fe?SO4）和三氯化鐵（FeCl3）（分析純）；Gibco胎牛血清（美國賽默飛公司），雙抗（北京索萊寶有限公司），DMEM培養(yǎng)基（美國Hyclone公司），丙二醛（malo?ndialdehyde，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

細胞培養(yǎng)瓶、細胞培養(yǎng)板（美國Corning公司），氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatographymass spectrometer，GC-MS）（美國賽默飛世爾，ISQ單四極桿氣質(zhì)），色譜柱DB-1701毛細管色譜柱（柱長30 m，內(nèi)徑0.25 mm，涂布厚度0.25 μm，Agilent Technologies），X-MarK全自動酶標儀分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad），電熱恒溫水浴箱（北京市六一儀器廠），CO2培養(yǎng)箱和三氣培養(yǎng)箱（瑞士TECAN公司），普通光學顯微鏡（德國Zeiss公司）。

1.2 SD大鼠PASMC的制備

Sprague-Dawley（SD）健康雄性大鼠，購于西安交通大學動物實驗中心〔實驗動物使用許可證號SCXK（陜）2012-003〕，體重150～220 g。給于普通大鼠飲料喂養(yǎng)，自由進食飲水，飼養(yǎng)環(huán)境溫度22～24℃，相對濕度為45%～55%。健康SD大鼠，經(jīng)2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，置于75%乙醇中浸泡1 min。用無菌手術(shù)剪沿大鼠劍突向上剪開暴露胸腔后取出心臟和肺臟，找到肺動脈主干并快速分離血管，保留2～3級肺小動脈血管。之后將分離的肺小動脈血管剪開后輕輕刮去內(nèi)膜，同法處理以除去外膜，將處理過的血管剪成約2 mm組織塊后輕輕平鋪于培養(yǎng)瓶中，加入3 mL含20%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基中（組織塊不飄起）。放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，期間不做移動，貼壁4 d后，顯微鏡下觀察組織塊周圍是否爬出細胞，待細胞密度約達70%時，用0.25%胰酶消化并傳代。用含15%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)大鼠原代PASMC并傳代，培養(yǎng)箱條件為5%CO2，37℃，取3～8代細胞用于實驗。

1.3 VOMF提取

取肉豆蔻種仁，粉粹，稱取1000 g粉末，用水浸泡8 h，采用水蒸氣蒸餾法提取至無油滴出，收集后用無水Na2SO4脫水，即得淡黃色VOMF 48.25 g，產(chǎn)油率為4.83%，備用。

1.4 VOMF氣相色譜-質(zhì)譜分析條件

程序升溫（初始溫度50℃，保持2 min，以2℃·min-1的速率升溫至120℃，保持5 min，以2℃·min-1的速率升溫至190℃，保持2 min，以20℃·min-1的速率升溫至280℃，保持2 min；進樣量1.0μL；不分流進樣；載氣（流量）為氦氣（1.2mL·min-1）；進樣口溫度250℃，離子傳輸管溫度250℃。離子源溫度280℃。質(zhì)譜檢測器為EI離子源，70 eV；掃描范圍50～600m/z。

1.5 DPPH法檢測VOMF自由基清除能力

準確量取0.3 mmol·L-1DPPH乙醇溶液180 μL于96微孔板內(nèi)，再加入20 μL無水乙醇制備不同濃度（0.1，0.2，0.4，0.8，1.6，3.2和6.4 g·L-1）的VOMF溶液，以6.4 g·L-1的Vc作為陽性對照。用封板膠封板后，室溫下避光，靜置60 min，測定517 nm處吸光度值為Ai，以等體積無水乙醇代替樣品溶液測得的吸光度為Ao，以等體積的無水乙醇代替DPPH溶液測得的吸光度為Aj，平行3組測定。自由基清除率（%）=〔1-（Ai-Aj）〕/Ao×100%。

1.6 鐵離子還原/抗氧化能力（ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）法檢測VOMF的還原能力

精密稱取TPTZ樣品3.12 mg，配制10 mmol·L-1TPTZ鹽酸溶液，置冰箱冷藏中備用。在300mmol·L-1醋酸鹽緩沖溶液（pH=3.6）中，加入2.5 mL TPTZ備用溶液和2.5 mL 20 mmol·L-1FeCl3溶液，混勻得到TPTZ工作液。準確吸取TPTZ工作液100 μL于96微孔板內(nèi)，再加入100 μL不同濃度（0.5～32 g·L-1）的VOMF溶液，以溶劑作空白對照，加樣后混勻，置37℃水浴鍋中反應(yīng)10 min，593 nm處測定吸光度值（A593nm），同時測定 FeSO45，10，20，40，60，80和160 μmol·L-1標準溶液A593nm。

1.7 MTS法檢測細胞增殖

將貼壁細胞用0.2%胰酶消化后離心收集，配制成5×107L-1單細胞懸液，接種于96孔板中，每孔培養(yǎng)24 h至貼壁后，換無血清培養(yǎng)基，12 h后將細胞分為2組：常氧組（5%CO2+95%O2條件下培養(yǎng)）和低氧組（3%O2+5%CO2+92%N2條件下培養(yǎng)），每組設(shè)置VOMF 1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5和4.0 g·L-1處理，37℃作用12 h后，每孔加入10 μL MTS試劑，反應(yīng)3 h，490 nm波長下測定吸光度值（A490nm），并用空白孔調(diào)零。計算細胞增殖抑制率及IC50值。細胞增殖抑制率（%）=1-低氧組A490nm/常氧組A490nm×100%。

1.8 檢測細胞SOD，GSH和MDA水平

將貼壁細胞用0.2%胰酶消化后離心收集，配制成5×107L-1單細胞懸液，接種于6孔板中，每孔培養(yǎng)24 h至貼壁后，換無血清培養(yǎng)基同步化處理，12 h后將細胞分為2組：正常對照組（5%CO2+95%O2條件下培養(yǎng)）和低氧組（3%O2+5%CO2+92%N2條件下培養(yǎng)），每孔分別加入3 mL不同濃度（0.8，1.6和3.2 g·L-1）的VOMF，作用12 h 后，以超聲波提取法收集蛋白，按照SOD，GSH和MDA試劑盒說明書進行檢測。

1.9 統(tǒng)計學分析

實驗結(jié)果數(shù)據(jù)采用表示，采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析。組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 VOMF化學成分

經(jīng)GC-MS分析，并通過Xcalibur色譜工作站NIST譜庫檢索標準MS圖庫及有關(guān)MS圖文獻解析，從VOMF中共鑒定出75個化合物，鑒定化合物的百分比為99.95%，并利用峰面積歸一化法確定各組分在VOMF中的相對含量（表1）。

Tab.1 Chemical composition of volatile oil from M.fragrans（VOMF）

續(xù)表1

2.2 不同濃度VOMF清除DPPH自由基的能力

VOMF清除DPPH自由基結(jié)果（圖1）表明，Vc（陽性對照組）濃度在6.4 g·L-1時，對自由基清除能力達到80%。VOMF在0.1～6.4 g·L-1范圍內(nèi)的清除率具有一定的量-效關(guān)系（P＜0.05），但VOMF＜3.2 g·L-1的自由基清除能力較Vc弱（P＜0.05）。

Fig.1 Scavenging activity of VOMF on 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl（DPPH） free radical.Pulmonaryartery smooth muscle cells（PASMCs）in 96-well microplates were treated with DPPH 0.3 mmol·L-1，meanwhile，different concen?trations of VOMF（0.1-6.4 g·L-1），Vc 6.4 g·L-1（positive con?trol） or alcohol（vehicle control） were added according to groups.Absorbance was measured at 517 nm.，n=3.＊P＜0.05，compared with vehicle control group；#P＜0.05，compared with Vc group.

2.3 VOMF對Fe3+還原能力的影響

以FeSO4濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，得標準曲線方程為y=0.0059x-0.0088（R2=0.9977），在10～160 μmol·L-1濃 度 范 圍 內(nèi) 線 性 關(guān) 系 良 好。VOMF在實驗濃度范圍內(nèi)對Fe3+具有一定的還原能力（P＜0.05），但其還原能力較Vc 6.4 g·L-1弱（P＜0.05）（圖2）。

Fig.2 Reducing power of VOMF on Fe 33++.PASMCs in 96-well microplates were treated by tripyridyltriazine（TRTZ），mean?while，different concentrations of VOMF（0.5-32 g·L-1），Vc 6.4 g·L-1（positive control）or alcohol（vehicle control）were added according to groups.Absorbance was measured at 593 nm.Reducing power was calculated from standard curve of FeSO4.，n=3.＊P＜0.05，compared with vehicle control group；#P＜0.05，compared with Vc group.

2.4 VOMF對PASMC增殖的影響

不同濃度VOMF對低氧誘導的PASMC增殖的影響結(jié)果（圖3）顯示，VOMF 1～4 g·L-1對低氧誘導的PASMC增殖的抑制作用呈濃度依賴性（r=0.938，P＜0.05），明顯高于常氧條件下的增殖抑制作用（P＜0.05）。VOMF對低氧誘導的PASMC增殖抑制作用的IC50為1.66 g·L-1。因此，以肉豆蔻揮發(fā)油0.8，1.6和3.2 g·L-1進行后續(xù)相關(guān)實驗。

Fig.3 Inhibitory effect of VOMF on PASMCs.PASMCs were treated with VOMF 1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 and 4.0 g·L-1 for 12 h.Cellular proliferation inhibitory rate（%）=1-hypoxia group A490 nm/normoxic group A490 nm×100%.n=3.＊P＜0.05，compared with corresponding normoxic group.

2.5 VOMF對GSH，MDA和SOD水平的影響

在無揮發(fā)油干預情況下，與常氧組相比，低氧組PASMC中GSH含量降低（P＜0.05）。經(jīng)VOMF干預后，當VOMF濃度達到1.6和3.2 g·L-1時，低氧組中GSH含量均升高，分別是常氧組的1.64和1.86倍（P＜0.05），且隨VOMF濃度的升高，GSH含量呈上升趨勢（圖4）。

Fig.4 Effect of VOMF on level of glutathione（GSH）in PASMCs.PASMCs were treated with VOMF 0.8，1.6 and 3.2 g·L-1for 12 h.，n=3.＊P＜0.05，compared with corre?sponding normoxic group.

在無揮發(fā)油干預的情況下，低氧刺激PASMC導致MDA含量比常氧組提高，是常氧組的1.28倍（P＜0.05）。經(jīng)過VOMF干預后，低氧刺激下PASMC中MDA含量降低（P＜0.05）（圖5）。

Fig.5Effect of VOMF on level of malondialdehyde（MDA）in PASMCs.See Fig.4 for the cell treatment.，n=3.＊P＜0.05，compared with corresponding normoxic group.

低氧下未加VOMF組細胞SOD的活性與相應(yīng)常氧組相比降低（P＜0.05），經(jīng)過VOMF處理后，細胞中SOD的活性升高（P＜0.05）。當VOMF濃度達到3.2 g·L-1時，低氧刺激下PASMC中SOD的活性是常氧組的1.12倍（圖6）。

Fig.6 Effect of VOMF on activity of superoxide dismutase（SOD）in PASMCs.See Fig.4 for the cell treatment.，n=3.＊P＜0.05，compared with corresponding normoxic group.

3 討論

持續(xù)發(fā)生的肺動脈血管收縮和PASMC增殖是發(fā)生HPAH的2個關(guān)鍵因素［2］。前期研究發(fā)現(xiàn)，三味檀香散能有效改善低氧誘導的肺動脈高壓［10-11］，而肉豆蔻作為其主要藥材之一，其藥用效果一直受到廣泛關(guān)注，但迄今尚未見肉豆蔻對PASMC增殖影響的文獻報道。

本研究通過GC-MS實驗分析并鑒定了VOMF的化學成分。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中以萜類化合物的含量最多（60.26%），其次是芳香族化合物（32.36%）和其他類化合物（7.33%）。VOMF中主要化學成分的分析結(jié)果與張根榮等［12］報道的結(jié)果基本一致。

體外抗氧化實驗結(jié)果表明，VOMF具有清除DPPH自由基的能力，并具有一定的量-效關(guān)系，同時VOMF對于Fe3+具有一定的還原能力，但其能力較Vc（6.4 g·L-1）弱。結(jié)合已有實驗結(jié)果和相關(guān)文獻可以初步推測，抗氧化活性應(yīng)與其含有的單萜類和芳香族類化合物有關(guān)。Nguyen等［13］研究報道，肉豆蔻抗氧化的活性成分主要是VOMF。亦有文獻報道，單萜類化合物以及芳香性化合物中的肉豆蔻醚和欖香脂素等具有明確的抗氧化作用［10-13］。本研究結(jié)果表明，VOMF有較好的抗氧化能力。

本研究通過考察不同濃度VOMF對低氧刺激下PASMC增殖的抑制作用，發(fā)現(xiàn)其對低氧誘導PASMC增殖的抑制作用明顯高于對常氧條件下的抑制作用，且具有濃度依賴性，提示VOMF對低氧刺激下的PASMC增殖具有選擇性抑制作用。作為肉豆蔻中的主要成分，VOMF中的成分復雜，各成分之間含量差異大，且中藥中的藥效物質(zhì)并不一定是其中活性強的化學成分［14］。所以盡管本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)其活性濃度偏高，但為后續(xù)藥效物質(zhì)的確定仍具有指導意義。

在細胞水平的抗氧化實驗中，發(fā)現(xiàn)VOMF能顯著提高細胞內(nèi)GSH的含量和SOD活性，降低MDA含量，從而清除細胞內(nèi)有害自由基，發(fā)揮細胞抗氧化能力。而且在常氧條件下依然具有此活性，并且VOMF濃度達到3.2 g·L-1時，抗氧化活性最高。

Chen等［15］和Rao等［16］研究表明，在低氧誘導的PASMC增殖過程中，氧化應(yīng)激反應(yīng)增強。而體內(nèi)的氧化應(yīng)激常常會促進細胞的增殖、生長和分化。因此，本研究中VOMF很可能通過抗氧化途徑抑制低氧環(huán)境下PASMC增殖。VOMF的抗氧化活性與其治療HPAH之間的關(guān)系有效成分有待進一步研究。