激活腺苷酸活化蛋白激酶 α在苯扎貝特抑制氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥中的作用

李 騫，張 強(qiáng)，葉偉祥，黃志堅，李秀研

（福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院老年病科，福建泉州 362000）

心血管疾病已成為死亡的最常見原因［1］。在中國，每年有300萬人死于心血管疾病，占死亡總?cè)藬?shù)＞40%［2］。心血管疾病的高發(fā)病率以及高死亡率造成嚴(yán)重的家庭和社會問題。動脈粥樣硬化（athero?scleros，AS）是常見的心血管疾病。研究證實，血管內(nèi)皮功能障礙是AS以及多種心血管疾病發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)［3］。研究表明，氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL）誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥是導(dǎo)致AS發(fā)生的重要環(huán)節(jié)［4］，提示通過抑制ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞炎癥可能是防治AS及其他心血管疾病的重要途徑。

腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophos?phate activated protein kinase，AMPK）不僅是細(xì)胞能量代謝的重要調(diào)節(jié)酶，而且在細(xì)胞炎癥病理反應(yīng)中也具有重要的調(diào)節(jié)作用［5］。AMPK激活后可顯著抑制NF-κB的激活，降低炎癥因子表達(dá)以及降低炎癥細(xì)胞的遷移與粘連，是一種對細(xì)胞炎癥反應(yīng)起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用的靶點(diǎn)［6］。AMPK是由一個催化亞基（α）和2個調(diào)節(jié)亞基（β和γ）組成的三聚體酶復(fù)合物，其中AMPKα的作用最為關(guān)鍵。研究表明，目前臨床廣泛使用的抗AS治療的藥物，如二甲雙胍能通過激活A(yù)MPK發(fā)揮保護(hù)心血管的作用［7］，還可顯著抑制脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的表達(dá)［8］，此外，敲除AMPK可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮功能障礙和炎癥［9］。因此，AMPKα可能是血管內(nèi)皮炎癥導(dǎo)致的心血管疾病特別是AS疾病的一個潛在的關(guān)鍵治療靶點(diǎn)。

苯扎貝特（bezafibrate，BZF）是一種過氧化體增殖物激活型受體α（peroxisome proliferatorsactivated receptor-α，PPAR-α）的激活物，具有改善細(xì)胞線粒體功能和能量代謝的作用［10］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，BZF可以用于抗AS的治療［11］。動物實驗也表明，BZF能明顯改善高脂飲食導(dǎo)致的小鼠的AS癥狀［12］。與此同時，也有研究表明，BZF通過激活PPAR-α蛋白在內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)揮抗炎作用［13］。然而，目前未見關(guān)于細(xì)胞炎癥反應(yīng)關(guān)鍵調(diào)節(jié)靶點(diǎn)AMPKα在BZF抗ox-LDL誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）炎癥反應(yīng)中作用的研究報道。本研究采用ox-LDL誘導(dǎo)HUVEC炎癥模型，探索AMPKα在BZF抑制ox-LDL誘導(dǎo)HUVEC炎癥中的作用，進(jìn)一步明確BZF防治內(nèi)皮細(xì)胞炎癥的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑和主要儀器

EBM-2內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基套裝（貨號：CC-3162）購自瑞士Lonza公司；BZF（貨號：213579，純度＞98%）購自百靈威科技；AMPKα抑制劑Compound C（CC）（貨號：HY-13418A，純度＞98%）購自美國MCE公司；氧化低密度脂蛋白（貨號：YB-002，2 g·L-1）購自廣州奕源生物科技有限公司；總RNA提取試劑盒（貨號：9767）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號：RR047A）和熒光定量PCR（qPCR）試劑盒（貨號：638319）購自日本TAkARa生物技術(shù)有限公司；TNF-α、白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）、細(xì)胞間黏附分子1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）和血管細(xì)胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）的引物由美國Invitrogen公司合成；BCA蛋白定量試劑盒（貨號：A53225）和ECL顯影劑（貨號：32106）購自美國Thermofisher公司；兔抗p-AMPKα（Thr-172，貨號：50081）、AMPKα（貨號：5832）、p-P65（Ser-536，貨號：4886）和P65（貨號：8242）多克隆抗體購自CST公司；兔抗GAPDH單克隆抗體（貨號：ab181603）購自美國Abcam公司；小鼠抗TNF-α單克隆抗體（貨號：BF0170）、兔抗IL-6（貨號：DF6087）、ICAM-1（貨號：AF6088）和VCAM-1（貨號：DF6082）多克隆抗體購自美國Affinity公司。

1.2 HUVEC來源、培養(yǎng)和分組處理

原代HUVEC購自加拿大Cell Applications公司（貨號：S200K-05n），用Lonza公司的EBM-2內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基套裝，在37℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取第3～4代進(jìn)行實驗。藥效實驗分組為細(xì)胞對照組、ox-LDL 50 mg·L-1組、BZF 25，50 和100 μmol·L-1組。藥物實驗分組：細(xì)胞對照組，BZF 25，50 和 100 μmol·L-1組。驗證實驗分組：細(xì)胞對照組、ox-LDL 組、BZF 100 μmol·L-1組和 BZF 100 μmol·L-1+CC 5 μmol·L-1組。以上分組藥物均為同時加入并作用24 h。

1.3 熒光定量PCR檢測 TNF- α，IL-6，ICAM-1和VCAM-1 mRNA的表達(dá)水平

采用MiniBEST Universal RNA Extraction試劑盒提取細(xì)胞總RNA。采用PrimeScript?RT Master Mix進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。采用Integrated DNA Technologies公司的在線工具設(shè)計引物，退火溫度（Tm）值均為60℃，引物序列見表1。采用SYBR?Fast qPCR Mix進(jìn)行qPCR，反應(yīng)在Roch480型實時qPCR系統(tǒng)中進(jìn)行，每組實驗重復(fù)3次。以GAPDH作為內(nèi)參，反應(yīng)結(jié)束后通過分析Ct值，采用 2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達(dá)水平。

Tab.1 Sequence of primers

1.4 Western蛋白印跡法檢測TNF- α，IL-6，ICAM-1，VCAM-1，p-P65，P65，p-AMPK 和 AMPK α 表達(dá)水平

分組處理細(xì)胞24 h后，PBS洗1次，加入適量的RIPA裂解液裂解，提取總蛋白用BCA蛋白定量試劑盒定量，樣品加入緩沖液，100℃，5 min變性，總蛋白上樣量為20 μg，用10%的SDS-PAGE電泳分離，半干電轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉于37℃封閉1 h后，分別用相應(yīng)的一抗（TNF-α，1∶1000；IL-6，1∶1000；ICAM-1，1∶1000；VCAM-1，1∶1000；p-P65，1∶1000；P65，1∶1000；p-AMPKα，1∶1000；AMPKα，1∶1000；GAPDH，1∶10000）在4℃過夜，TBST洗膜3次后用二抗（1∶5000稀釋）在室溫孵育1 h，TBST洗膜3次后用ECL化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白質(zhì)條帶，用GAPDH蛋白條帶作為內(nèi)參，以目的條帶和內(nèi)參條帶的積分吸光值比值表示蛋白的相對表達(dá)水平。

1.5 分子對接技術(shù)預(yù)測AMPK和BZF的相互關(guān)系

從PDB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫下載AMPK與AMPK激動劑A769662的蛋白三維結(jié)構(gòu)（PDB ID：4QFR）用于當(dāng)前的對接研究。從ZINC數(shù)據(jù)庫中獲取配體BZF的三維結(jié)構(gòu)（ZINC ID：3956919）的結(jié)構(gòu)。利用Autodock tools工具去除AMPK三維結(jié)構(gòu)中的溶劑水分子和配體，根據(jù)已知的AMPK激動劑A769662結(jié)構(gòu)特性找到AMPKα激動劑與AMPKα的結(jié)合部位。將BZF與AMPK進(jìn)行柔性對接，采用結(jié)合力評估結(jié)合能力的大小。在每一個對接后，移動小分子的位置，使之最匹配，采用Pymol 1.3軟件進(jìn)行3D作圖。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗結(jié)果數(shù)據(jù)以表示，采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。One-way ANOVA用于多重比較，方差齊性采用LSD進(jìn)行兩兩比較，方差不齊性采用DunnettsT3進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BZF對ox-LDL誘導(dǎo)HUVEC炎癥因子mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響

與細(xì)胞對照組相比，ox-LDL顯著增加HUVEC細(xì)胞中TNF-α，IL-6，ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)（P＜0.01）（圖1A-D）。與ox-LDL組相比，BZF 25，50和100 μmol·L-1顯著抑制ox-LDL誘導(dǎo)的TNF-α，IL-6，ICAM-1和VCAM-1 mRNA水平升高，其量效關(guān)系呈負(fù)相關(guān)（r＝-0.978，P＜0.05；r＝-0.944，P＜0.05；r＝-0.929，P＜0.05；r＝-0.926，P＜0.05）。

Fig.1 Bezafibrate（BFZ）inhibited mRNA expression of tumor necrosis factor- α（TNF- α）（A），IL-6（B），intercel?lular adhesion molecule-1（ICAM-1）（C）and vascular cell adhesion molecule-1（VCAM-1）（D）in oxidized low-density lipoprotein（ox-LDL）-induced human umbilical vein endothelial cells（HUVECs）by quantitative PCR（qPCR）.HUVECs were incubated with ox-LDL 50 mg·L-1with or without BZF（25-100 μmol·L-1）for 24 h.，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；##P＜0.01，compared with ox-LDL group.

與細(xì)胞對照組比較，ox-LDL顯著升高HUVEC細(xì)胞中TNF-α，IL-6，ICAM-1，VCAM-1和p-P65蛋白的表達(dá)（P＜0.01）（圖2）。與 ox-LDL組相比，BZF 25，50和100 μmol·L-1顯著抑制ox-LDL誘導(dǎo)的TNF-α表達(dá)升高（P＜0.01），其量效關(guān)系呈負(fù)相關(guān)（r＝-0.885，P＜0.05）；各濃度組的BZF顯著抑制IL-6，其量效關(guān)系呈負(fù)相關(guān)（r＝-0.997，P＜0.05）；各濃度組的BZF顯著抑制ICAM-1，其量效關(guān)系呈負(fù)相關(guān)（r＝-0.985，P＜0.05）；各濃度組的BZF顯著抑制VCAM-1，其量效關(guān)系呈負(fù)相關(guān)（r＝-0.875，P＜0.05）；各濃度組的BZF顯著抑制p-P65，其量效關(guān)系呈負(fù)相關(guān)（r=-0.997，P＜0.05）。

Fig.2 Effect of BFZ on protein expression levels of TNF- α（A，B），IL-6（A，C），ICAM-1（A，D），VCAM-1（A，E）and p-P65（A，F(xiàn)）in ox-LDL-induced HUVECs by Western blotting.See Fig.1 for the cell treatment.B-F were the semiquantitative results of A，respectively.，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；##P＜0.01，compared with ox-LDL group.

2.2 BFZ與AMPK相互作用的分子對接

分子對接模擬顯示AMPK與BZF的結(jié)合力為-8.66 kcal·mol-1。AMPK與BFZ結(jié)合構(gòu)象表面模擬模型，BZF位于AMPK結(jié)合口袋之中，BZF與AMPK的氨基酸殘基LYS-51形成氫鍵連接，氫鍵的長度為2.3 ?，與氨基酸殘基ILE-46，ARG-83，ASN-48，LYS-31，LEU-18，GLY-19，VAL-11，THR-106，ASP108和VAL-113通過范德華力連接（圖3）。

2.3 BZF對AMPK α磷酸化水平的影響

與細(xì)胞對照組相比較，BZF25，50和100μmol·L-1能顯著升高HUVEC中p-AMPKα的含量（均P＜0.01），其量效關(guān)系呈正相關(guān)（r＝0.994，P＜0.05）（圖4）。

Fig.3 3D conformation of AMPK α-BFZ complex.ILE：isoleucine；ARG：arginine；ASN：asparagine；LYS：lysine；LEU：leucine；GLY：glycine；VAL：valine；THR：threonine；ASP：aspartic acid.

2.4 抑制AMPK α對BZF抗炎作用的影響

Fig.4 Effect of BZF on phosphorylation level of AMPK α by Western blotting.HUVECs were treated for 24 h.B was the semi-quantitative result of A.，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

Fig.5 Inhibition of AMPK α partly abolished inhibitory effect of BZF on mRNA expression levels of TNF- α（A），IL-6（B），ICAM-1（C）and VCAM-1（D）in ox-LDL-induced HUVECs by qPCR.HUVECs were separately treated with ox-LDL （50 mg·L-1），ox-LDL （50 mg·L-1）+BZF （100 μmol·L-1）and ox-LDL （50 mg·L-1）+BZF （100 μmol·L-1）+CC （5 μmol·L-1）for 24 h.，n=3.＊＊P＜0.01，compared with ox-LDL group；##P＜0.01，compared with ox-LDL+BZF group.

BZF100 μmol·L-1顯著抑制 ox-LDL 誘導(dǎo)的TNF-α，IL-6，ICAM-1和VCAM-1的mRNA表達(dá)水平升高（P＜0.01）（圖5）。AMPK抑制劑CC與BZF共孵育HUVEC后，BZF對TNF-α的抑制率由72.3%降低至44.4%（P＜0.01），對IL-6的抑制率由78.0%降低至29.8%（P＜0.01），對ICAM-1的抑制率由77.8%降低至55.0%（P＜0.01），對VCAM-1的抑制率由68.1%降低至40.6%（P＜0.01）。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，BZF具有抑制ox-LDL誘導(dǎo)的炎癥因子TNF-α，IL-6，ICAM-1和VCAM-1表達(dá)的作用，提示BZF可能通過抑制ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮炎癥起到防治AS的作用。NF-κB是調(diào)控細(xì)胞炎癥的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其P65亞基的磷酸化是NF-κB激活的標(biāo)志［15］。Western蛋白印跡實驗結(jié)果顯示，BZF能顯著抑制ox-LDL誘導(dǎo)的P65磷酸化水平的升高，提示BZF的抗炎作用與抑制NF-κB激活有關(guān)。

既往研究證實，AMPK具有抗炎作用，其激活后通過直接降低NF-κB活性進(jìn)一步抑制炎癥因子表達(dá)［16］。本研究采用分子對接技術(shù)預(yù)測AMPK與BZF是否能發(fā)生空間結(jié)合，發(fā)現(xiàn)AMPK與BZF的結(jié)合力是-8.66 kcal·mol-1，提示AMPK可能與BZF發(fā)生空間結(jié)合。因此，進(jìn)一步采用Western蛋白印跡法檢測BZF對AMPKα磷酸化的影響。結(jié)果顯示，BZF能顯著升高AMPKα Thy-172位點(diǎn)的磷酸化水平。Thy-172位點(diǎn)的磷酸化是AMPK激活的標(biāo)志。本研究表明，BZF可能是潛在的AMPK激動劑。目前研發(fā)出的AMPK小分子激動劑類藥物，由于生物利用度低、非特異性作用等原因未能進(jìn)入臨床，如A-769662等［17］。因此，從上市藥物中探索具有AMPK激動劑作用并用于防治AS及相關(guān)心血管疾病的有效藥物，具有重要的臨床意義。BZF是已上市藥物，有較好的成藥性，本研究結(jié)果為臨床運(yùn)用BZF激活A(yù)MPK提供了實驗證據(jù)。

上述結(jié)果表明，BZF具有激活內(nèi)皮細(xì)胞AMPK的作用。既往研究表明，BZF是核受體超家族成員PPAR受體的激動劑，PPAR被激活后可抑制多種炎癥因子的表達(dá)［18］。為進(jìn)一步探索激活A(yù)MPK在BZF抗炎中的作用，本研究采用AMPKα抑制劑CC特異性抑制AMPKα活性后，觀察BZF的抗炎作用。當(dāng)AMPKα活性被抑制后，BZF的對炎癥因子及黏附分子表達(dá)的抑制作用顯著降低。由此提示，AMPKα的激活在增強(qiáng)BZF抑制ox-LDL誘導(dǎo)HUVEC炎癥反應(yīng)中具有重要作用。

綜上所述，BZF能抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC炎癥反應(yīng)，BZF可能是一個潛在的AMPKα激動劑，其抗炎作用與AMPKα激活密切相關(guān)，提示激活A(yù)MPKα可能是BZF類藥物防治AS以及其他心血管疾病的新靶點(diǎn)。