遼寧棉區(qū)黃萎病病菌分離鑒定及致病力分析

朱 鶴， 徐 敏， 王子勝

(遼寧省經濟作物研究所，遼寧遼陽 111000)

棉花黃萎病嚴重影響棉花的產量、棉纖維的長度和強度，是棉花生產中最重要的病害之一，也是我國農業(yè)植物檢疫對象之一。從1891年在美國首次發(fā)現至今，已遍布世界各主要產棉區(qū)。我國于1935年由美國引進斯字棉時傳入，之后在各棉區(qū)蔓延。1993年棉花黃萎病大面積暴發(fā)，當年發(fā)病面積為267萬hm2，2002年發(fā)病面積超過300萬hm2[1]。棉花黃萎病發(fā)病的最適溫度為25～28 ℃，低于25 ℃或高于35 ℃時，癥狀暫時隱蔽。一般在現蕾期進入發(fā)病適宜階段，病情迅速發(fā)展；到7、8月份花鈴期達到發(fā)病高峰，來勢迅猛，往往造成病葉大量枯落，并加重蕾鈴脫落[2]。黃萎病的發(fā)生和發(fā)展，給我國棉花生產帶來了極大的經濟損失。

棉花黃萎病是種子和土壤傳播的維管束病害，病原菌寄主范圍廣，容易受到環(huán)境和寄主變化的影響而產生新的生理型，以微菌核的形式在土壤中長期存活，并且可以在棉花的各個生育期入侵并發(fā)病[3]。為最大限度地減少損失，圍繞棉花黃萎病發(fā)生、發(fā)展及防治的主要機制和技術，國內外科學家開展了大量的研究，并取得了大量可喜的成果。張緒振等通過對我國8個省(市、區(qū))的280個單孢菌系的鑒定，確定我國棉花黃萎病的致病菌為大麗輪枝菌(VerticilliumdahliaeKleb.)[4]。大麗輪枝菌的微菌核在沒有寄主存在的條件下，可以在土壤中存活達14年之久[5]。溫度為20 ℃、pH值為8.0是大麗輪枝菌微菌核萌發(fā)的最佳條件[6]。

姚耀文等根據病菌致病力的強弱，將我國8個省(市、區(qū))10個棉花黃萎病菌系劃分為強、中、弱等3個生理型，即生理型Ⅰ、生理型Ⅱ、生理型Ⅲ[7-13]。棉花黃萎病有落葉型和非落葉型2種，2種類型的菌系在致病性上有明顯的區(qū)別[14]，目前生產上應用的棉花品種對落葉型黃萎病病菌均表現為感病。由于落葉型菌系的致病力明顯高于非落葉型菌系，已成為棉花生產可持續(xù)發(fā)展的潛在威脅[15]。石磊巖等通過對采自北方植棉區(qū)落葉型和非落葉型黃萎病病株的51個菌系致病力分化測定結果進行分析，確定我國北方植棉區(qū)存在落葉類強致病力菌系、混合類中度致病力菌系及非落葉類弱致病力菌系等3個致病類型[16]?；莼鄣韧ㄟ^對不同植棉省32個落葉型黃萎病病菌的致病性進行比較分析，認為來源于不同植棉省菌系的平均致病力有一定差異，且來源于同一植棉省的落葉型菌系可歸屬于不同的致病類型[17]。賈濤等研究表明，同一棉田棉花黃萎病存在落葉型和非落葉型2類病害表現類型，其病原菌存在強、中、弱等3種不同致病類型的生理型，揭示出棉花黃萎病病菌是一個易變異的混合基因型群體，群體中不同個體組成的亞群體具有不同的致病性[18]。

遼寧省經濟作物研究所自1928年開始進行棉花研究，近百年來，在特早熟棉花的育種、栽培及理論基礎方面成績斐然。20世紀50年代，創(chuàng)制了我國第1個棉花黃萎病抗源——遼棉1號，為我國棉花抗病育種工作提供了種質資源，并先后育成了遼棉5號、遼棉10號等一系列集抗病高產于一身的棉花品種。然而，近年來，隨著遼寧棉花面積的大幅度縮減，以及棉花引種和交流的范圍進一步擴大，棉花黃萎病生理小種變異加快，遼棉系列品種在抗黃萎病方面出現了分化，一方面在遼寧棉區(qū)仍然表現高抗病性，另一方面引入新疆后卻表現不抗病。同時，遼寧棉區(qū)落葉型黃萎病、急性枯死型黃萎病的發(fā)生也呈擴大趨勢。因此，有必要對遼寧主要棉花產區(qū)的黃萎病病菌進行分離和鑒定，以期找出棉花黃萎病病菌的變異規(guī)律，用以指導遼寧棉區(qū)的棉花引種和生產。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試的菌株是從遼寧棉花產區(qū)染病的棉花植株上分離得到的菌株，對照菌株為大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)V991菌株，由中國農業(yè)科學院提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種采集 2015年7月下旬，在遼寧省棉花主要種植區(qū)(凌源市、朝陽市喀左縣、葫蘆島市建昌縣、葫蘆島市綏中縣、凌海市、錦州市黑山縣、遼陽市遼陽縣、沈陽市遼中縣、鞍山市臺安縣等地區(qū))采集棉花莖稈。采集時，在離地表約10 cm處開始，向上取約20～30 cm棉花莖稈，同時記錄采集時間和地點、棉花品種、發(fā)病程度、病斑大小(小斑、中斑、大斑)、落葉與否等。病菌分離之前保證通風，防止腐爛。

1.2.2 菌種分離 先將取樣莖稈進行表面消毒，然后用滅菌刀剝去表皮，剪取其中小塊變色的維管束組織，用漂白粉進行表面消毒后，移于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)。菌落形成后，選擇菌落邊緣的菌絲進行純化培養(yǎng)，直到得到沒有任何雜質的菌株。再將樣本反復進行平板劃線分離試驗，直到得到理想的目標菌種。

PDA培養(yǎng)基制備方法：取200 g去皮馬鈴薯，切成小塊，加1 000 mL水煮沸30 min。濾去馬鈴薯塊，將濾液補足至 1 000 mL，加20 g葡萄糖、15 g瓊脂，溶化后分裝，在115 ℃滅菌20 min。

1.2.3 菌落形態(tài)特征及發(fā)育情況試驗

1.2.3.1 產孢特征檢驗 將菌種接種于CM培養(yǎng)基中，待生長后將孢子濃度調至1×106CFU/mL，吸取5 μL孢子溶液滴于PDA培養(yǎng)基中(將孢子溶液滴為圓形)，于25 ℃培養(yǎng)2周。用顯微鏡觀察孢子形態(tài)、分生孢子大小、有無輪枝等，并記錄。

CM培養(yǎng)基制備方法：分別取6 g酵母提取物、6 g酸水解酪蛋白、10 g蔗糖，加蒸餾水加熱溶解，定容至1 000 mL。分裝后在126 ℃滅菌15 min。

1.2.3.2 溫度對菌落生長和產孢特性的影響 將孢子濃度調至1×106CFU/mL，吸取5 μL孢子溶液于PDA培養(yǎng)基中，在不同溫度(15、20、25、30、33 ℃)條件下培養(yǎng)15 d后觀察生長情況，確定各菌株最低、最高、最適生長溫度(衡量標準是培養(yǎng)15 d后的菌落直徑和產孢量)，其中將25 ℃設為對照。

1.2.3.3 pH值對菌落生長和產孢特性的影響 將孢子濃度調至1×106CFU/mL，吸取5 μL孢子溶液于查彼克(C’Zapk)固體培養(yǎng)基中，在不同pH值(3.0、3.6、4.6、5.3、6.4、7.2、8.0、8.6、9.6、10.0)條件下培養(yǎng)15 d后，測定各菌株菌落直徑和產孢量，確定各菌株最低、最高、最適生長pH值。

查彼克(C’zapk)固體培養(yǎng)基制備方法：取2.00 g硝酸鈉、1.00 g磷酸氫二鉀、0.50 g氯化鉀、0.50 g硫酸鎂、0.01 g硫酸鐵、30.00 g蔗糖溶于850 mL蒸餾水中，調節(jié)溶液pH值，在108～115 ℃高壓滅菌15 min；將6 g瓊脂加入到150 mL蒸餾水中，在121 ℃高壓滅菌20 min；在無菌條件下，趁熱將分別滅菌處理的150 mL瓊脂溶液與850 mL查彼克溶液混合均勻；最后通過精密的pH試紙校正培養(yǎng)基的pH值。

1.2.4 遼寧地區(qū)黃萎病病菌致病力鑒定

1.2.4.1 試驗材料 選擇遼寧省經濟作物研究所選育的棉花品種(品系)，其中有感病棉花品系遼8152、品種遼棉9號，耐病棉花品種遼棉14號、品系遼8181，抗病棉花品種遼棉10號、遼棉25號。在溫室條件下，將棉種播種到直徑為5 cm的紙缽中，待棉花出苗后，每個紙缽留苗4～5株。

1.2.4.2 菌液的制備 在500 mL大三角瓶中加入250～300 mL CM培養(yǎng)基，接種測試菌株，于25 ℃培養(yǎng)4～5 d后，用雙層無菌紗布過濾洗脫菌液，并使用血球板計算孢子數，再用無菌水把菌液濃度稀釋到1×107CFU/mL。

1.2.4.3 接菌方法 當棉苗長出第1張真葉時，采用紙缽撕底蘸根法接菌，撕掉紙缽底部，掐掉棉苗的根毛和部分較長的幼根，用注射器吸取10 mL準備好的孢子懸浮液并注入紙缽底部。待孢子懸浮液被吸收后，將紙缽放入準備好的容器中，作好標記，記錄所用的菌種及接種時間。接菌后的棉苗，其發(fā)育溫度白天控制在24～25 ℃，夜晚最低溫度不低于18 ℃，噴水調節(jié)濕度，以營造利于發(fā)病的環(huán)境。

1.2.4.4 調查統(tǒng)計 根據棉花苗期黃萎病的發(fā)病特點，在接菌后的第2周至第5周，每周調查1次，共調查4次，按5級標準記載病情(表1)。綜合調查結果計算出病情指數[病情指數=100×∑(各級病葉數×各級代表值)/(調查總葉數×最高級代表值)]，以病情指數作為劃分抗病、感病的標準，按全國統(tǒng)一標準分為5類(表2)。

表1 黃萎病病情級別及發(fā)病程度

表2 黃萎病抗性分類標準

2 結果與分析

2.1 菌種分離結果

將分離純化得到的目標菌種進行生理生化鑒定，確定分離得到的菌種為所需要的大麗輪枝菌。選擇其中純種化程度高、生長旺盛的菌種分別命名為SY-1、SY-2、SY-3，并進行下一步試驗。

2.2 菌落形態(tài)觀察結果

菌落特征觀察主要觀察其在PDA培養(yǎng)基上的形態(tài)(菌落表面是光滑濕潤還是干燥無光或呈皺紋狀，邊緣是整齊還是不規(guī)則，菌落是隆起還是扁平)、顏色(菌絲的顏色)、有無孢子產生等。

由表3可知，所分離的3個菌株與對照菌株在菌落形態(tài)上表現高度一致，基本可以確定為典型的大麗輪枝菌菌株。

表3 菌落特征觀察結果

2.3 產孢特征試驗結果

產孢特征主要觀察孢子的形態(tài)、大小、有無輪枝產生等。由表4可知，所分離的3個菌株與對照菌株孢子形態(tài)都表現為長卵圓形，且都有輪枝產生。但分生孢子大小不同，對照菌株的分生孢子最大，其次是SY-2菌株，SY-1、SY-3菌株的分生孢子大小十分接近。

表4 產孢特征試驗結果

2.4 不同溫度條件下各菌株生長速度和產孢特性的比較結果

由圖1、圖2可知，在不同溫度下，所分離得到的3個菌株與對照菌株生長趨勢相同，在15～25 ℃之間生長速度較快；在25 ℃時3個供試菌株的菌落直徑均達到最大值，為 3.05～3.14 cm，比對照略大；之后生長速度放緩，在33 ℃時基本停止生長。在15～20 ℃條件下各菌株菌落都能產生孢子，但在較低溫度下菌落生長優(yōu)先于產孢。同樣，在25 ℃時各菌株的產孢量均達到最大值，之后產孢量明顯下降，在33 ℃ 時基本停止產孢。

2.5 不同pH值條件下各菌株的生長速度和產孢特性比較結果

由圖3、圖4可知，所有菌株在pH值為3.0～10.0時均能生長，且表現出相似的生長趨勢。在pH值為5.3～8.0之間生長較為適宜，在pH值低于5.3或高于8.0時生長較緩慢。同時測定了pH值為3.0～10.0之間的產孢曲線，參試的4個菌株在pH值為3.0～10.0之間均可以產孢，在pH值為8.0時產孢量達到最大值，pH值過高或過低時產孢均受到抑制。

2.6 篩選菌株致病力鑒定結果

參試共6個棉花品種，包括感病品種、耐病品種、抗病品種。由表5可知，對照菌株V991可以高度感染感病品種(品系)遼8152、遼棉9號以及耐病品種(品系)遼棉14號、遼8181，中度感染抗病品種遼棉10號和遼棉25號，但病情指數較低。菌株SY-1、SY-2、SY-3均可以高度感染感病品種(品系)遼8152、遼棉9號，中度感染耐病品種(品系)遼棉14號、遼8181，而對遼棉10號和遼棉25號表現為抗病?？傮w來說，對照菌株V991的平均病情指數達到54.1，為強致病力菌種，菌株SY-1、SY-2、SY-3的平均病情指數分別為35.5、36.2、39.6，均明顯低于對照，均為中等致病力菌株。

3 結論與討論

本研究對遼寧棉區(qū)棉花黃萎病病菌進行了分離，并對黃萎病病菌進行了形態(tài)學觀察、生長特性研究、致病力分析等。

3.1 遼寧棉區(qū)黃萎病病菌為典型的大麗輪枝菌

本試驗按照前人的經驗，成功分離出了遼寧棉區(qū)典型的黃萎病病菌。將所分離的菌株與對照菌種一起進行培養(yǎng)觀察，菌落形態(tài)和產孢特征均與對照菌株高度一致，結合生理生化測定結果，可以確定遼寧地區(qū)所分離的黃萎病病菌菌株為典型的大麗輪枝菌。

3.2 環(huán)境條件對黃萎病菌的發(fā)生發(fā)展有直接影響

商文靜等研究發(fā)現，溫度為20 ℃、pH值為8.0是大麗輪枝菌微菌核萌發(fā)的最佳條件[6]。簡桂良總結棉花黃萎病發(fā)病規(guī)律時也認為，棉花黃萎病發(fā)病的最適溫度為25～28 ℃，低于25 ℃或高于35 ℃時，癥狀暫時隱蔽[2]。本試驗中，所分離菌株的菌落直徑和產孢量都在溫度為25 ℃、pH值為8.0時達到最大值，這與前人的研究結果[2，6]相符，也與遼寧棉區(qū)棉花黃萎病一般在5月中旬開始發(fā)生，7—8月發(fā)病最嚴重表現一致。

表5 各菌株致病力分析結果

3.3 菌落發(fā)育情況與致病力關系不明確

試驗結果表明，所分離的菌株與對照菌株在菌落及分生孢子的形態(tài)方面基本一致，區(qū)別主要在于分生孢子的大小，所分離菌株的分生孢子明顯小于對照菌株，其中SY-2菌株的分生孢子較大，SY-1、SY-3菌株的分生孢子大小基本相同。在致病力方面，所分離菌株明顯弱于對照菌株，所分離菌株中SY-2菌株的致病力高于SY-1菌株，低于SY-3菌株。筆者認為，由于菌株SY-1、SY-2、SY-3是從同一地區(qū)分離的，其生理小種接近，因此外觀表現和致病力接近。而對照菌株V991為外來菌株，因此在形態(tài)和致病力方面表現出明顯的區(qū)別。但總體來說，菌株分生孢子大小與其致病性是否有關系還是一個值得探討的問題。

3.4 遼寧棉區(qū)黃萎病病菌致病力分析

相對于強致病力菌株V991，遼寧棉區(qū)分離出的3個菌株致病力較弱，屬中致病力菌株。由于菌株采自遼寧主要棉區(qū)，可以認為遼寧棉區(qū)的黃萎病病菌致病力較弱。這解釋了遼寧棉區(qū)抗病棉花品種在新疆表現抗病性下降的問題，這也是不同棉花產區(qū)相互引種交流過程中的瓶頸問題。

由于棉花黃萎病是由種子和土壤傳播的維管束病害，防治難度較大，到目前為止，尚未有特效的防治藥劑，只能依靠以種植抗病品種為主的綜合防治措施[19-20]。為了選育適于當地生產需要的棉花品種，就必須改變以往閉門造車的傳統(tǒng)，一方面應到相應的棉區(qū)開展工作，尤其是中高代品系的選育工作；另一方面應到相應的棉區(qū)收集典型樣本，分離培養(yǎng)致病菌，在當地建立并不斷改造黃萎病病圃。

目前，我國棉花生產正在向棉花主產區(qū)——新疆及西北內陸棉區(qū)轉移和集中，因此，對于廣大育種工作者來說，針對新疆棉區(qū)的品種特點和生產實際開展工作，才能達到縮短育種進程、提高品種實用性的目的。