正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化明黨參中氯化膽堿的提取工藝

杜清 秦民堅(jiān) 吳剛

【摘要】?jī)?yōu)化中藥材明黨參中氯化膽堿的提取工藝。采用酸水的濃度、提取時(shí)間、提取所用酸水的體積、提取次數(shù)設(shè)計(jì)四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)，以氯化膽堿的含量為考察指標(biāo)優(yōu)化明黨參藥材中氯化膽堿的提取工藝。優(yōu)化后的工藝條件為明黨參60℃干燥粉碎后用0.5%，20倍的硝酸溶液加熱回流分解提取1次，每次5小時(shí)，濾液用40%NaOH溶液調(diào)節(jié)PH至9～10，加入過量甲醇，冰箱放置過夜，抽濾后得濾液，濃縮加入雷氏銨鹽甲醇溶液，生成粉紅色片狀結(jié)晶，將結(jié)晶溶解定容后應(yīng)用紫外分光光度測(cè)定氯化膽堿的含量。經(jīng)過三批樣品工藝驗(yàn)證，明黨參藥材中氯化膽堿的平均含量為37.02%，RSD值為2.8%，說明該工藝穩(wěn)定可行。

【關(guān)鍵詞】明黨參；氯化膽堿；提取工藝；含量測(cè)定

【中圖分類號(hào)】R284.2 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B 【文章編號(hào)】ISSN.2095.6681.2018.29..02

明黨參（Radix Changii）為傘形科明黨參屬單種植物明黨參（Changium smyrnioides Wolff）的干燥根[1]，是國(guó)家二級(jí)瀕危保護(hù)植物[2]，主產(chǎn)于江蘇、安徽、浙江等地[3]，陳建偉等[4]從明黨參中首次分得膽堿。氯化膽堿（choline chloride）與正常脂肪代謝和運(yùn)轉(zhuǎn)有關(guān)，是一種抗脂肪肝因子的有效成分，用于肝炎、早期肝硬化、脂肪肝等的輔助治療劑[5]，氯化膽堿60%水劑、50%可濕性粉劑可用作蛋雞生產(chǎn)等的飼料添加劑[6]，氯化膽堿有諸多的功效和實(shí)際作用，故借鑒GB/T17481-1998中的方法并應(yīng)用正交實(shí)驗(yàn)法篩選和優(yōu)化膽堿類功效成分[7，8]，為今后更好地應(yīng)用明黨參藥材中的膽堿成分提供切實(shí)可行的依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

明黨參藥材采購于安徽亳州藥材市場(chǎng)，經(jīng)中國(guó)藥科大學(xué)秦民堅(jiān)教授鑒定為傘形科明黨參Changium smyrnioides Wolff.的干燥根，粉碎過篩60目備用。

1.2 試劑和儀器

氯化膽堿標(biāo)準(zhǔn)品購于中國(guó)藥品生物制品鑒定所：雷氏鹽：Sigma Aldrich of D-89552/Fluka chemie；硝酸（南京化學(xué)試劑一廠），甲醇（江蘇漢邦科技有限公司）；正丙醇（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司），氫氧化鈉（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；丙酮（天津市博迪化工有限公司），水浴鍋（國(guó)華電器有限公司），循環(huán)水式真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；UV-2501可見分光光度計(jì)（日本島津公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 5%雷氏銨鹽甲醇溶液的配制

將雷氏鹽5 g溶解在100 mL甲醇中超聲即得，放于冰箱中保存。

1.3.2 氯化膽堿標(biāo)準(zhǔn)液的配制

精密稱取105℃干燥至恒重的氯化膽堿標(biāo)準(zhǔn)品200 mg，置于200 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度（即濃度為

1 mg/mL）。

1.3.3 比色及最大吸收波長(zhǎng)的確定

取氯化膽堿對(duì)照品溶液加入適量5%雷氏銨鹽甲醇溶液，靜置析晶，濾取結(jié)晶，丙酮溶解，UV-2501分光光度計(jì)作全波長(zhǎng)掃描，確定最大吸收峰及波長(zhǎng)。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

分別取氯化膽堿標(biāo)準(zhǔn)液2，4，6，8，10，12，14，16，18 mL，分別加水至20 mL，再加入5%雷氏銨鹽甲醇夜各5 mL，冰箱放置生成膽堿雷氏鹽結(jié)晶。濾取結(jié)晶，用正丙醇洗三次，丙酮溶出，定容至25 mL，在520 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以含量（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 樣品溶液中膽堿的測(cè)定

稱取60℃干燥的小樣10 g，硝酸加熱回流分解提取，濾液用40%的氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH至9～10，加入過量甲醇，冰箱放置1夜，濾液濃縮加入雷氏銨鹽甲醇溶液，生成粉紅色片狀結(jié)晶，用正丙醇清洗，丙酮溶解結(jié)晶后定容至25ml容量瓶中，吸取5 mL用丙酮定容至25 mL容量瓶，在520 nm處測(cè)定吸光度，由氯化膽堿標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算氯化膽堿的濃度C，并計(jì)算樣品中膽堿的百分含量：膽堿含量

（mg/100 g）=C*0.746*稀釋倍數(shù)/稱樣量*100；

式中：0.746為膽堿系數(shù)。

1.4 提取工藝的初步設(shè)想

將工藝提取條件考慮設(shè)計(jì)如下：

（1）提取時(shí)所用酸水的濃度：常用0.1～1.0%的酸水液提取，因此選擇0.1%，0.5%，1.0%的硝酸溶液；（2）提取時(shí)間：文獻(xiàn)中會(huì)用7小時(shí)，故選擇3小時(shí)，5小時(shí)和7小時(shí)；（3）提取所用酸水的體積：5倍，10倍和20倍；（4）提取次數(shù)：1次，2次和3次。

1.5 提取工藝的正交設(shè)計(jì)

對(duì)2.6中的條件采用四因素三水平的正交表L9（34），見表1，考察使用紫外分光光度法測(cè)得氯化膽堿的含量來篩選最佳條件。

2 結(jié) 果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

以濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，回歸方程式為：A=0.0098+1.2393C，r=0.9986，說明氯化膽堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液在0.08～0.72 mg/mL與其吸光度成線性相關(guān)。

2.2 提取工藝正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

按照2.7的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法測(cè)定明黨參藥材中氯化膽堿的含量，結(jié)果詳見表2。

2.3 提取工藝正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析

根據(jù)3.2的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表3選擇方差最小的B作為空白對(duì)照，從方差分析結(jié)果可看出各個(gè)因素對(duì)明黨參中氯化膽堿的提取工藝影響的大小分別為A>C>D>B而且最優(yōu)化的方案為A2B2C3D1。

2.4 提取工藝正交實(shí)驗(yàn)的直觀分析圖

2.4.1 酸濃度對(duì)明黨參中膽堿提取的影響

根據(jù)提取工藝結(jié)果，從圖2中可看出，酸濃度最合適為0.5%時(shí)提取出的明黨參膽堿得率最高。

2.4.2 提取時(shí)間對(duì)明黨參中膽堿提取的影響

根據(jù)提取工藝結(jié)果，從圖3中可看出，提取時(shí)間最合適為2小時(shí)，提取出的明黨參膽堿得率最高。

2.4.3 所用酸濃度對(duì)對(duì)明黨參中膽堿提取的影響

根據(jù)提取工藝結(jié)果，從圖4中可看出，所用酸體積20倍時(shí)，提取出的明黨參膽堿得率最高。

2.4.4 提取次數(shù)對(duì)明黨參中膽堿提取的影響

根據(jù)提取工藝結(jié)果，從圖5中可看出，提取1次提取出的明黨參膽堿得率最高。

2.4.5 明黨參中氯化膽堿提取的優(yōu)化工藝條件

根據(jù)明黨參中氯化膽堿提取的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果和方差分析，可得其最優(yōu)化工藝條件為：明黨參粉末于60℃干燥粉碎后用0.5%，20倍的硝酸溶液加熱回流分解提取1次，每次5小時(shí)，濾液用40%NaOH溶液調(diào)節(jié)PH至9～10，加入過量甲醇，冰箱放置過夜，抽濾后得濾液，濃縮加入雷氏銨鹽甲醇溶液，生成粉紅色片狀結(jié)晶，將此結(jié)晶溶解后定容，紫外分光光度測(cè)定即可得到氯化膽堿的含量。

2.5 明黨參中氯化膽堿提取優(yōu)化工藝條件的驗(yàn)證試驗(yàn)

按照3.5的優(yōu)化工藝條件提取三批明黨參藥材樣品并測(cè)定其中氯化膽堿的含量，見表4。

由表4中的工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得明黨參藥材中氯化膽堿的平均得率為（37.02±2.8）%，RSD偏差<3.0%，說明該工藝穩(wěn)定可行。

3 討 論

對(duì)明黨參中膽堿的提取工藝進(jìn)行摸索，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得出A2B2C3D1為最合適的提取分離條件；從四個(gè)因素水平（酸水液的濃度、提取時(shí)間、提取所用酸水的體積、提取次數(shù)）的直觀分析圖也佐證了明黨參的最佳提取工藝條件如3.5中所總結(jié)出的結(jié)論，由優(yōu)化后的工藝進(jìn)行樣品驗(yàn)證，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較小，說明該工藝穩(wěn)定可行，可適用于明黨參中氯化膽堿的提取分離。

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本文編輯：趙小龍