四倍體鴨茅產(chǎn)量及其構(gòu)成因素的QTL定位

唐露，黃琳凱，趙欣欣，張旭，聶剛，張新全，馬嘯

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，四川 成都611130)

牧草育種工作一直致力于提高產(chǎn)量和改良品質(zhì)，大多數(shù)牧草以收獲地上營養(yǎng)體為主要目的，因此育種家們常把與產(chǎn)量性狀密切相關(guān)的一些表型特征，如株高、分蘗數(shù)、葉片長度等作為主要的育種目標(biāo)[1]。由于產(chǎn)量性狀是由微效多基因控制的數(shù)量性狀，表現(xiàn)為連續(xù)變異，受環(huán)境的影響較大, 僅僅依靠常規(guī)育種方法在現(xiàn)有基礎(chǔ)上難有大突破。近年來，分子生物技術(shù)的發(fā)展為作物育種帶來了新鮮活力，分子標(biāo)記的開發(fā)、分子遺傳圖譜的構(gòu)建及QTL定位技術(shù)的發(fā)展為探究多基因控制的數(shù)量性狀提供了有力的研究手段[2-4]。鴨茅(Dactylisglomerata)又名雞腳草或果園草，隸屬于禾本科(Gramineae)鴨茅屬(Dactylis)，全屬僅一個種，即鴨茅，其基本染色體數(shù)目為2n=14，有二倍體、四倍體和六倍體，其中用作飼草的多為四倍體[5]。鴨茅作為一種優(yōu)良的冷季型牧草，具有葉多高產(chǎn)、耐陰、再生性強、適口性好、營養(yǎng)價值高等優(yōu)點，可用于青飼、調(diào)制干草或青貯，是世界溫帶地區(qū)四大廣泛分布的禾本科牧草之一[6-7]。早有研究表明，鴨茅的干物質(zhì)產(chǎn)量與株高、葉長和分蘗數(shù)呈顯著正相關(guān)[8]。鴨茅的單株產(chǎn)量及其構(gòu)成因素是復(fù)雜的數(shù)量性狀，通過對產(chǎn)量及其構(gòu)成因子的QTL(quantitative trait locus)定位研究與分析，確定其在染色體上的位置及其遺傳效應(yīng)，可提高對產(chǎn)量性狀優(yōu)良基因型選擇的預(yù)見性、準(zhǔn)確性。

分子標(biāo)記技術(shù)和QTL定位分析已大量應(yīng)用于主要牧草，如紫花苜蓿(Medicagosativa)、多花黑麥草(Loliummultiflorum)、高丹草(Sorghumbicolor×S.sudanense)、冰草(Agropyroncristatum)等的重要農(nóng)藝性狀基因定位研究，包括產(chǎn)量和品質(zhì)、抗病性、耐受性及繁殖性狀等，并利用取得的部分成果對品種進行了遺傳改良[9-12]。相比之下，鴨茅分子生物學(xué)方面的報道，多為種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、遺傳距離估算及指紋圖譜構(gòu)建等方面，有關(guān)分子遺傳圖譜構(gòu)建特別是產(chǎn)量等重要農(nóng)藝性狀的QTL定位研究報道極少[13-14]。目前世界上已報道4張鴨茅分子遺傳圖譜，但基因定位研究卻僅限于繁殖相關(guān)性狀。Xie等[15]利用SSR和AFLP標(biāo)記共檢測到7個與鴨茅抽穗期相關(guān)的QTL，解釋的表型變異范圍為7.85%～24.19%。Zhao等[16]則采用SLAF標(biāo)簽及SSR標(biāo)記鑒定到與抽穗及開花顯著相關(guān)的11個QTL，并通過功能注釋篩選到兩個候選基因hd1及VRN1。此外，育種家們較為關(guān)注的產(chǎn)量、品質(zhì)及生長相關(guān)的農(nóng)藝性狀QTL研究尚未見報道。本試驗在已構(gòu)建的四倍體鴨茅分子遺傳圖譜基礎(chǔ)上，擬對株高、旗葉長、旗葉寬、倒二葉長、倒二葉寬、莖粗、花序長、分蘗數(shù)、單株干重等9個產(chǎn)量相關(guān)性狀進行了QTL分析，旨在確定控制這些性狀顯著相關(guān)的QTL數(shù)目及其遺傳效應(yīng)，為鴨茅遺傳改良、功能基因挖掘、基因克隆及分子標(biāo)記輔助育種等提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料及試驗地概況

試驗材料包括母本“楷模”(高稈、多分蘗、寬葉、早熟)和父本“01436”(矮稈、少分蘗、細(xì)葉、晚熟)及其雜交而成的214株作圖群體。2012年將母本楷模和父本01436材料雜交，獲得F1種子，并于溫室發(fā)芽，2個月后提取材料DNA，利用SSR分子標(biāo)記進行雜交種真實性鑒定，將F1代群體材料移栽至四川農(nóng)業(yè)大學(xué)雅安(38°8′ N, 103°14′ E，海拔600～620 m，年均溫16.0 ℃，年均降水量1015.2 mm，年平均日照時數(shù)1161.5 h，年平均無霜期283 d)試驗基地中。2013年選取長勢良好且存在差異的F1單株雜交獲得包含214個單株的作圖群體。試驗點分別為四川省雅安市寶興縣及眉山市洪雅縣。雅安寶興地處東經(jīng)120°51′-120°53′，北緯30°12′-30°18′，海拔750～1000 m，屬四川盆地亞熱帶季風(fēng)氣候，年均溫16.0 ℃，年均降水量993.7 mm，年平均日照時數(shù)789.4 h，年平均無霜期319 d。洪雅地處東經(jīng)102°49′-103°32′，北緯29°24′-30°00′，年降水量1435.5 mm，屬中亞熱帶濕潤氣候，年平均日照時數(shù)1006.1 h，年平均無霜期307 d。

1.2 農(nóng)藝性狀觀測

采用分株克隆的方式將種于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)草學(xué)基地資源圃的群體材料取樣均分后，于2014年10月分別種植于洪雅和寶興兩地，行距和株距均為50 cm，兩地管理方式一致，當(dāng)年成苗，但不抽穗。翌年春季開始逐步抽穗，并于盛花期觀測株高(plant height,PH)、旗葉長(flag leaf length,FLL)、旗葉寬(flag leaf width,FLW)、倒二葉長(second leaf length,SLL)、倒二葉寬(second leaf width,SLW)、莖粗(stem diameter,SD)、花序長(inflorescence length,IL)、分蘗數(shù)(tiller number,TN)、單株干重(dry weight per plant,DW)共9個性狀。親本及每個群體單株隨機選取3個分蘗，進行相關(guān)性狀測定。由于這些表型性狀的調(diào)查易受主觀因素和環(huán)境的影響，因此在調(diào)查農(nóng)藝性狀時應(yīng)統(tǒng)一調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)，具體方法詳見表1。且同一性狀盡量一個人一次性調(diào)查完畢，以此來減少主客觀因素造成的誤差。

表1 農(nóng)藝性狀的觀測Table 1 Observation of agronomic traits

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2010對所有表型值進行匯總統(tǒng)計。用SPSS 19.0軟件對鴨茅雙親進行差異顯著性分析，對群體9個農(nóng)藝性狀表型值進行表型變異分析、正態(tài)分布檢驗、各性狀相關(guān)性及主成分分析。

利用前期構(gòu)建的四倍體鴨茅高密度分子遺傳連鎖圖譜，采用MapQTL 5.0軟件進行產(chǎn)量及其相關(guān)性狀QTL分析。通過區(qū)間作圖法(IM)定位性狀，用PT檢驗1000次設(shè)定閾值，首先考慮0.99置信度對應(yīng)的LOD(likelihood of odd)閾值，若沒有定位區(qū)間則考慮0.95置信度對應(yīng)的LOD閾值,若沒有定位區(qū)間則考慮0.90置信度對應(yīng)的LOD閾值。對PT檢驗未關(guān)聯(lián)到區(qū)域的性狀則手動降低閾值到3.0；若3.0沒有區(qū)間則降到2.5，2.0。QTL命名參照McCouch等[17]的方法，即：q+目標(biāo)性狀(大寫英文字母)+所在染色體號數(shù)或連鎖群代號+QTL個數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 各性狀在雙親間的差異及在群體中分離

表2對雙親和214個群體材料在兩個試驗點的性狀表型進行了匯總?？梢钥闯觯饲o粗在洪雅試驗點表現(xiàn)無差異外，其余8個性狀在兩個親本間均差異顯著(P<0.05)，故可用該作圖群體獲得控制這些性狀的QTL?？傮w而言，母本“楷?！备鳟a(chǎn)量相關(guān)性狀表現(xiàn)優(yōu)于父本“01436”，但洪雅試驗點旗葉寬的表型值“01436”略優(yōu)于“楷模”。

從9個性狀在群體中的變異幅度看，都存在明顯的超親分離，其分布范圍均在雙親差異的范圍之外。由于洪雅試驗點當(dāng)年蟲害原因，整體長勢較寶興差。各性狀表型值在兩地略有不同，其中，洪雅試驗點旗葉寬、倒二葉寬、莖粗和寶興試驗點旗葉寬、倒二葉寬的群體平均值低于“01436”，表現(xiàn)出負(fù)向超親優(yōu)勢；而寶興試驗點花序長、莖粗的群體平均值高于“01436”，表現(xiàn)出明顯的超親優(yōu)勢；株高、旗葉長、倒二葉長、花序長、干重和分蘗數(shù)其群體均值在兩地均介于雙親之間。

除洪雅試驗點花序長和寶興試驗點倒二葉寬偏差較大外，其余性狀在群體中分布的峰度和偏度絕對值均小于1，這是由多基因控制的數(shù)量性狀遺傳的典型分布，正態(tài)分布檢驗也表明9個農(nóng)藝性狀在群體中基本呈連續(xù)的正態(tài)分布，能夠進行QTL定位分析。

表2 鴨茅親本及群體產(chǎn)量及其相關(guān)性狀表型值Table 2 Phenotypic values of parents and populations for yield relative traits of orchardgrass

2.2 群體材料中各性狀間的相關(guān)性

相關(guān)性分析表明，兩地單株干重與株高、旗葉長、倒二葉長、花序長、分蘗均極顯著正相關(guān)(P<0.01，表3)?？傮w來看，與單株干重相關(guān)性較高的是株高和分蘗，相關(guān)系數(shù)分別為0.599、0.459(株高)和0.424、0.431(分蘗)。其次，與單株干重密切相關(guān)的依次為旗葉長和倒二葉長，表明分蘗、株高和葉長是鴨茅最為重要的產(chǎn)量構(gòu)成因素，在育種工作中應(yīng)加以重視。單株產(chǎn)量相關(guān)性最高的株高同其他性狀的相關(guān)性在兩地表現(xiàn)略有差異，與倒二葉長、莖粗和花序長都表現(xiàn)出顯著的正相關(guān)關(guān)系，與旗葉寬、倒二葉寬表現(xiàn)出一定程度的負(fù)相關(guān)，并在寶興試驗點達到極顯著水平；在寶興試驗點與其達到極顯著正相關(guān)的旗葉長在洪雅試驗點卻并未表現(xiàn)出明顯相關(guān)性。值得注意的是，同樣與產(chǎn)量密切相關(guān)的分蘗與株高卻在寶興試驗點達到極顯著負(fù)相關(guān)。此外，分蘗除了在寶興試驗點與旗葉長、倒二葉長、旗葉寬表現(xiàn)出極顯著正相關(guān)外，與其他性狀的相關(guān)性都不高。

2.3 產(chǎn)量性狀的主成分分析

以單株干重為因變量，其他性狀為自變量，進行了產(chǎn)量相關(guān)性狀的主成分分析。首先對兩地的F2群體表型值進行KMO及Bartlett檢驗，洪雅、寶興試驗點的KMO統(tǒng)計量分別為0.665、0.677(KMO>0.5即可做主成分分析)，相應(yīng)的概率Sig均為0.000，表明測試因子適合做主成分分析。在測試的8個因子中，兩地的分析結(jié)果較為一致，特征值大于1的為前3個主成分，在洪雅、寶興試驗點的累積貢獻率分別達到73.67%和79.71%，反映了總體數(shù)據(jù)的大部分信息。其中，第1主成分分別占比41.23%、39.45%(表 4)，分析結(jié)果較為一致，其中旗葉長、倒二葉長、花序長在第1成分矩陣中的值都較高，達到0.7以上(表5)，主要集合了鴨茅的葉部形態(tài)的部分因素，而且矩陣中特征值都較高，由于葉長、花序長與單株產(chǎn)量極顯著相關(guān)，該成分有可能反映控制鴨茅產(chǎn)量的主要因素，此外矩陣中大多數(shù)特征值相差都不大，同時也反映了單株產(chǎn)量作為數(shù)量性狀受多個性狀影響的遺傳特點；第2主成分在兩地的代表變量差異較大，洪雅試驗點為株高，而寶興則為旗葉寬、倒二葉寬；第3主成分在兩地的代表變量為株高和分蘗。

表3 鴨茅群體產(chǎn)量及其相關(guān)性的相關(guān)系數(shù)Table 3 The correlation coefficients for yield relative traits in population of orchardgrass

注： “*” 和“**”分別表示0.05和0.01顯著水平。

Note：“*”and“**”represent significance levels of probability at 0.05 and 0.01, respectively.

2.4 鴨茅9個產(chǎn)量相關(guān)性狀QTL定位

對兩個不同環(huán)境下鴨茅9個產(chǎn)量相關(guān)性狀QTL分析發(fā)現(xiàn)，控制這9個農(nóng)藝性狀的QTL總共60個，其中洪雅38個，寶興22個(表6)，這些QTL分別定位于分子連鎖圖譜的1、2、3、4、5共5個連鎖群中，單個QTL的貢獻率為5.7%～24.7%，貢獻率大于10%的QTL16個，單個性狀QTL個數(shù)為2～15個。

2.4.1洪雅產(chǎn)量相關(guān)性狀QTL定位 洪雅試驗地共檢測到9個性狀的38個QTL，分布于除2、6、7以外的其余4個連鎖群，LOD值介于3.03～8.58，解釋的表型變異貢獻率為6.9%～20.9%，其中表型貢獻率大于10%的QTL有6個。第1、4連鎖群上共檢測到8個影響株高的QTL，其中1個位于第1連鎖群，其余7個位于第4連鎖群。檢測到位于第1、5連鎖群控制旗葉長的QTL共11個，8個位于第1連鎖群，3個位于第5連鎖群，其中qFLL-1-6 LOD值為4.52，貢獻率較高為10.1%?？刂频苟~長的QTL共3個，同樣位于1和5連鎖群。與旗葉寬、倒二葉寬相關(guān)QTL都只有一個，皆位于第3染色體上的重復(fù)標(biāo)記區(qū)間35.727～40.157 cM內(nèi)，且兩個QTL的貢獻率都較高，其中qFLW-3-1為16.5%，qSLW-3-1為20.9%，表明該區(qū)間內(nèi)極有可能存在控制葉寬的主效QTL?？刂魄o粗的QTL有2個，位于第3連鎖群上的不同區(qū)間，貢獻率分別為8.8%和11.0%。 檢測到7個影響花序長的QTL，位于第1、3、5連鎖群，其中貢獻率大于10%的有2個。與分蘗相關(guān)的QTL檢測到1個，位于第5連鎖群，LOD值為3.03，貢獻率較低6.7%。檢測到位于第4連鎖群上控制單株干重的QTL共4個。

表4 鴨茅群體材料產(chǎn)量相關(guān)性狀的特征值、貢獻率和累積貢獻率Table 4 Eigenvalue and accumulative contribution rate for yield relative traits in population of orchardgrass

表5 鴨茅產(chǎn)量相關(guān)性狀前3個主成分的因子負(fù)荷矩陣Table 5 Matrix among for yield relative traits in F2 population of orchardgrass

2.4.2寶興產(chǎn)量相關(guān)性狀QTL定位 寶興試驗地檢測到的22個QTL中，表型貢獻率大于10%的有10個，其中第1連鎖群上與倒二葉寬相關(guān)的QTL貢獻率最高為24.7%。在第2、4連鎖群上分別檢測到2個與株高相關(guān)的QTL，并且檢測到兩個重復(fù)的QTL，qPH-4-4和qPH-4-5?？刂破烊~長的QTL共有4個，都位于第1連鎖群上，且4個QTL的貢獻率都較高，介于11.3%～12.3%。與倒二葉長、旗葉寬、倒二葉寬相關(guān)的QTL都只檢測到一個，分別位于1、3連鎖群，其中qSLL-1-3貢獻率較高為12.1%，而qSLW-3-2貢獻率高達24.7%。影響莖粗的2個QTL位于第3連鎖群的0 cM及5.006 cM處，該兩處位置分別含有5和3個標(biāo)記。寶興試驗地與花序長相關(guān)的QTL共檢測到5個，第1連鎖群3個、第5連鎖群2個，其中有3個QTL貢獻率大于10%，qIL-1-4為17.9%，qIL-1-5為13.7%，qIL-5-3為11.1%。影響分蘗的QTL共檢測到2個，位于第1連鎖群。與單株干重相關(guān)的QTL共2個，分別位于第2、5連鎖群。

注：“HY”和“BX”分別表示洪雅和寶興基地。

Note: “HY” and “BX” represent the experimental site of Hongya and Baoxing, respectively.

3 討論

3.1 產(chǎn)量及其構(gòu)成性狀的相關(guān)性分析

Sagsoz等[18]研究表明，鴨茅的干物質(zhì)產(chǎn)量與株高、葉長和分蘗數(shù)呈顯著正相關(guān)，這些性狀對牧草產(chǎn)量貢獻最大。其他禾本科牧草相關(guān)研究也得出了相似結(jié)論，Lemus等[19]研究發(fā)現(xiàn)，柳枝稷(Panicumvirgatum)的干物質(zhì)量與株高呈極顯著正相關(guān)，而逯曉萍等[20]則得出了不同生境下高丹草與株高、分蘗、莖粗、葉長、葉寬均呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)的結(jié)論。本研究利用兩個四倍體鴨茅基因型“楷模”ד01436”組合而成的作圖群體，對在兩個不同生境下的產(chǎn)量及其相關(guān)性狀的相關(guān)性進行了探討。相關(guān)性分析表明，在兩個不同的生境下，大多數(shù)農(nóng)藝性狀都與單株產(chǎn)量呈極顯著正相關(guān)，與前人研究結(jié)果相一致。因此，從理論上講，提高株高、分蘗數(shù)、增加花序長度和葉片長度，以及增大莖粗，可以提高單株產(chǎn)量。但由于性狀之間相互聯(lián)系并非彼此獨立，因此在實際育種中，尤其是在有限的自然資源條件下，過于追求某些性狀優(yōu)良表現(xiàn)可能會增加育成品種的種植風(fēng)險。例如與單株產(chǎn)量相關(guān)性最高的株高和分蘗，有相關(guān)研究表明[12]，兩者呈負(fù)相關(guān)，本研究中在寶興試驗點得出了同樣的結(jié)論，甚至達到了極顯著負(fù)相關(guān)水平。且株高與葉寬也呈負(fù)相關(guān)，所以，不可過于追求植株高度的提高，要考慮性狀之間的相互聯(lián)系，選育植株高大，同時分蘗多、葉片寬大、葉量豐富表現(xiàn)良好的綜合品種。

3.2 QTL的穩(wěn)定性

大量研究表明，微效多基因控制的數(shù)量性狀極易受外界環(huán)境的影響，通?？刂仆恍誀頠TL的數(shù)目、位置、效應(yīng)及穩(wěn)定性在不同遺傳背景群體中表現(xiàn)不同，同一群體在不同年際、不同生境下的定位效果也不盡相同[21-22]。本研究中，同一群體在不同環(huán)境下檢測到的QTL差異很明顯。9個農(nóng)藝性狀在兩地間共檢測到60個QTL，遺憾的是重復(fù)檢測到的僅有控制株高的qPH-4-4和qPH-4-5，兩地的貢獻率分別為7.8%、8.1%，表明該QTL在不同環(huán)境和條件下表現(xiàn)較為穩(wěn)定，這些對環(huán)境不敏感且效應(yīng)較大的QTL對分子標(biāo)記輔助育種有較大利用價值。但從實際應(yīng)用角度來講，貢獻率都較低，該位點對鴨茅高產(chǎn)育種應(yīng)用價值有待進一步研究。其余8個性狀在兩地都沒檢測到相同的QTL，表明這些性狀遺傳穩(wěn)定性不高，受環(huán)境影響較大，也可能是由于控制這些性狀的QTL分布較廣，數(shù)量較多，在不同環(huán)境條件下起作用的QTL不同。想要找到穩(wěn)定控制性狀的主效QTL，還需設(shè)計多年多點試驗，或者構(gòu)建不同遺傳背景的群體材料加以驗證分析。

3.3 QTL的多效性和QTL簇

QTL的多效性指同一區(qū)間檢測到的QTL同時調(diào)控幾個性狀的表達，這種情況在動植物中都普遍存在[23-25]。本研究的結(jié)果證實了多效性QTL的存在。如第3連鎖群上qFLW-3-2、qSD-3-4和qIL-3-2均在5.006 cM處，表明Marker33554很有可能存在一個同時控制旗葉寬、莖粗、花序長的QTL；第3連鎖群上的qFLW-3-1和qSLW-3-1都分布在區(qū)間35.727～40.157 cM處，且兩者的貢獻率都較高，分別是16.5%和20.9%，表明該位點可能存在一個效應(yīng)值較大的多效性主效QTL；第3連鎖群上的控制莖粗與花序長的qSD-3-1、qIL-3-4也存在同樣的效應(yīng)。此外，從本研究的結(jié)果來看，洪雅基地所檢測到的38個QTL中，有21個分布于第1、3連鎖群，占所檢測到QTL的55.3%；同樣，寶興試驗點檢測到的22個QTL中，有14個主要集中在第1、3連鎖群，占所檢測到QTL的63.7%，其余8個QTL分散在其他3個連鎖群上。本研究中，這些成簇分布的多效QTL同時調(diào)控的幾個性狀都存在著顯著正相關(guān)，恰好也為性狀間的相關(guān)性提供了一定解釋。相關(guān)性狀的QTL通常定位于同一連鎖群上相同或者相近區(qū)域，這可能是一因多效或由于基因緊密連鎖于同一區(qū)間或基因重疊造成[26]。近年來，QTL的成功克隆與功能研究也驗證了QTL的一因多效性，例如水稻(Oryzasativa)中QTL-Ghd7同時調(diào)控抽穗期、株高和每穗粒數(shù)；小麥(Triticumaestivum)中QTL-Gpc-B1等對小麥蛋白質(zhì)、鋅、鐵含量均有影響；調(diào)控玉米(Zeamays)株型相關(guān)性狀的QTL-ZmGA3ox2[27-29]。這些與產(chǎn)量相關(guān)性狀的QTL富集區(qū)域的發(fā)現(xiàn)，對鴨茅分子育種有重要作用，尤其是本研究檢測到的第1連鎖群上控制旗葉長和第4連鎖群上控制株高的QTL富集區(qū)域，數(shù)量多，且貢獻率較高，如果對這些遺傳區(qū)域進行深入研究，挖掘與主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記，就可以直接用于鴨茅產(chǎn)量相關(guān)性狀的分子標(biāo)記輔助選擇。