MARK2在肝癌中的表達(dá)及其對(duì)肝癌細(xì)胞遷移的影響

李會(huì)琴，吳欣愛(ài)，董文杰，湯光冉

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，河南 鄭州450052

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是原發(fā)性肝癌最常見(jiàn)的類型，在全世界常見(jiàn)惡性腫瘤中發(fā)病率為第5位，死亡率居第3位［1］。肝細(xì)胞癌惡性程度高，發(fā)展隱匿，進(jìn)展速度快，大多數(shù)患者確診時(shí)已進(jìn)入中晚期，同時(shí)肝細(xì)胞癌具有侵襲和轉(zhuǎn)移的能力，預(yù)后往往不佳［2］。目前，腫瘤切除及肝臟移植是最有效的治療手段，射頻消融及化學(xué)治療等可改善癌癥患者的預(yù)后，盡管這些治療可減少患者的病死率，但肝癌患者術(shù)后的復(fù)發(fā)及化學(xué)治療的耐藥仍是需要解決的問(wèn)題［3］。微管親和性調(diào)節(jié)激酶2（microtubule affinity-regulating kinase 2，MARK2）是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與微管相關(guān)蛋白的磷酸化，如Tau蛋白、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的磷酸酶（CDC25），以及Ⅱa類組蛋白去乙?；福ㄈ鏗DAC7）。在哺乳動(dòng)物中，MARK家族由四個(gè)成員（MARK1-MARK4）組成。Matenia揭示了MARK2具有多種功能，包括在神經(jīng)分化、神經(jīng)退行性、細(xì)胞極性、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞遷移中的作用，其中一些功能通常在癌細(xì)胞中被解除管制［4］。有研究發(fā)現(xiàn)MARK2在肺癌細(xì)胞系中顯示高度頻繁的DNA和RNA水平破壞，這些改變導(dǎo)致獲得細(xì)胞系中的致癌性質(zhì)，如增加的生存力和不依賴錨定的生長(zhǎng)［5］。另有研究表明在腫瘤抑制因子LKB1缺陷的人宮頸癌細(xì)胞系HeLa中高表達(dá)MARK2，可以通過(guò)AMPK抑制HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)，逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化［6］。但MARK2在肝癌中的表達(dá)及其作用尚未完全清楚。基于上述背景，本研究分析MARK2在肝癌中的表達(dá)，旨在為HCC的臨床治療提供新的靶點(diǎn)和思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

胎牛血清和DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自美國(guó)Milipore公司，Transwell遷移小室購(gòu)自美國(guó)Becton Dickinson Labware公司。MARK2基因的真核表達(dá)載體及其空載體、EndoFectinTM-Max轉(zhuǎn)染試劑均購(gòu)自廣州復(fù)能基因有限公司。兔抗人MARK2單克隆抗體及兔抗人β-actin抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.1.2 組織芯片

組織芯片（HLivH030PG03-M-250）購(gòu)自上海芯超生物科技有限公司，包含65例肝癌組織及其對(duì)應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本，其中肝癌患者男性55例，女性10例，年齡32～73歲。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)分析

組織標(biāo)本經(jīng)常規(guī)脫水、石蠟包埋，制作切片，經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精水化后，96 ℃微波檸檬酸鹽抗原熱修復(fù)15 min，采用3%H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶10 min；用5%山羊血清封閉，兔抗人MARK2（1∶1 000）4 ℃溫育過(guò)夜；洗滌后加生物素標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1∶1 000），于37 ℃溫育60 min，洗滌后，加過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素（1∶500），37 ℃溫育30 min，DAB顯色，復(fù)染，脫水，透明，封片。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。由2位以上病理科醫(yī)師觀察，在高倍鏡（×400）下隨機(jī)選取5個(gè)視野，陽(yáng)性細(xì)胞的百分率為“0”（0%）、“1”（1%～25%）、“2”（26%～50%）、“3”（51%～75%）、“4”（76%～100%）。強(qiáng)度評(píng)分0分為陰性；1分為弱陽(yáng)性；2分為中度陽(yáng)性；3分為強(qiáng)陽(yáng)性。每視野評(píng)分=染色強(qiáng)度評(píng)分×陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分，取平均分作為切片終評(píng)分。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

人肝癌HepG2細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)。在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d換液1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞融合率達(dá)80%，按EndoFectinTM-Max轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)配置轉(zhuǎn)染混懸液，質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑比例為2.5 μg∶7.5 μL，分別用250 μL不含血清的培養(yǎng)液稀釋質(zhì)粒及轉(zhuǎn)染試劑，將MARK2真核表達(dá)質(zhì)粒（MARK2-exp）及空載體（mock）、只加轉(zhuǎn)染試劑的空白對(duì)照轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞中，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，倒置像差熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）在細(xì)胞中的表達(dá)。轉(zhuǎn)染48 h后將細(xì)胞傳代至新鮮培養(yǎng)基中，加入G418進(jìn)行抗性篩選，4～6 d后熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行稀釋，再給予G418篩選后，擴(kuò)大培養(yǎng)獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)

收集蛋白樣品后，在10%的凝膠中制備并分離蛋白質(zhì)樣品，10%SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加MARK2和β-actin抗體4 ℃溫育過(guò)夜。TBST洗膜3次×5 min，山羊抗兔二抗室溫溫育2 h，TBST洗膜3次×5 min，ECL化學(xué)發(fā)光劑暗室顯影。

1.2.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

以濃度為20 nmol/L和30 nmol/L MARK2及其陰性對(duì)照組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞分別接種于24孔板上，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%，使用移液器吸嘴對(duì)準(zhǔn)24孔板下端中央部位向上輕推形成劃痕。磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）沖洗2～3次，充分洗去所刮擦下來(lái)的細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，0 h作為對(duì)照，之后放入在CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后取出，用熒光顯微鏡拍照。

1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)期細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，以無(wú)血清DMEM重懸細(xì)胞。向Transwell小室上部培養(yǎng)嵌室內(nèi)加入100 μL細(xì)胞懸液，向底部培養(yǎng)室加入600 μL含10%FBS的DMEM，每組設(shè)3個(gè)副孔，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的環(huán)境下培養(yǎng)48 h。吸去嵌室內(nèi)液體，用棉棒擦去嵌室底部?jī)?nèi)表面的細(xì)胞，以多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，PBS漂洗，于光鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

1.2.6 生物信息學(xué)分析

運(yùn)用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.oncomine.org）分析MARK2在肝癌與正常肝組織表達(dá)的差異性；運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)在線生存期分析軟件Kaplan-Meier plotter（KM plotter,http: //kmplot.com）對(duì)364例肝癌患者M(jìn)ARK2的表達(dá)及其總生存期的關(guān)系進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料用例數(shù)表示，采用χ2檢驗(yàn)分析MARK2表達(dá)和肝癌臨床病理特征之間的關(guān)系，用Kaplan-Meier分析MARK2表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MARK2在肝癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況

免疫組織化學(xué)分析MARK2蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MARK2在肝癌中的表達(dá)明顯高于癌旁組織（圖1）。分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中MARK2在肝癌組織（371例）和正常肝組織（50例）表達(dá)的差異，結(jié)果顯示MARK2在肝癌中表達(dá)顯著高于正常肝組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，圖2）。

2.2 MARK2表達(dá)與肝細(xì)胞癌臨床病理特征的相關(guān)性

通過(guò)組織芯片檢測(cè)MARK2在肝癌中的表達(dá)結(jié)果見(jiàn)表1，MARK2的表達(dá)在不同年齡、性別、腫瘤數(shù)目、是否有HBV感染、是否有肝硬化、不同TNM分期、腫瘤大小患者中的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）?？紤]樣本量較少，因此我們分析了TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)肝癌中MARK2的表達(dá)和臨床TNM分期（圖3）、病理分級(jí)（圖4）相關(guān)。結(jié)果顯示，MARK2表達(dá)量隨肝癌腫瘤分級(jí)升高而升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。另外MARK2在TNM分期為Ⅳ期（6例）的患者中的表達(dá)較Ⅰ期（168例）、Ⅱ期（84例）、Ⅲ期（82例）升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

圖 1 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)MARK2在肝癌組織及癌旁組織中的表達(dá)Fig. 1 Immunohistochemical detection of MARK2 expression in HCC and adjacent tissues

圖 2 肝癌與正常肝組織中MARK2差異性表達(dá)的比較Fig. 2 Comparison of MARK2 differential expression in HCC and normal liver tissues

表 1 MARK2表達(dá)和肝癌臨床病理特征的關(guān)系Tab. 1 The correlation between clincal parameters and MARK2 expression in HCC tissues

圖 3 MARK2表達(dá)和肝癌臨床TNM分期的相關(guān)性Fig. 3 Correlation between MARK2 expression and clinical TNM staging of HCC

圖 4 MARK2表達(dá)與肝癌病理分級(jí)的相關(guān)性Fig. 4 Correlation between MARK2 expression and histological grade of HCC

2.3 MARK2的表達(dá)與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系

運(yùn)用Kaplan-Meier plotter分析364例肝癌患者M(jìn)ARK2表達(dá)與患者總生存期的關(guān)系。結(jié)果顯示，MARK2高表達(dá)的肝癌患者比低表達(dá)患者總生存期短（P＜0.01），即MARK2高表達(dá)者預(yù)后不佳（圖5）。

2.4 MARK2-exp質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞的效率

將MARK2-exp質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞，通過(guò)熒光顯微鏡觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑比例為2.5 μg∶7.5 μL稀釋感染HepG2細(xì)胞，細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率達(dá)到90%（圖6）。

2.5 轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞中MARK2的表達(dá)變化

MARK2-exp穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后，提取蛋白，通過(guò)Western blot法檢測(cè)MARK2蛋白水平的變化，與轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染MARK2真核表達(dá)質(zhì)粒蛋白水平明顯上調(diào)（圖7）。

圖 5 不同MARK2表達(dá)水平肝癌患者的生存曲線Fig. 5 Survival curves of HCC patients with different MARK2 expression levels

圖 6 MARK2-exp質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞Fig. 6 Transfection of HepG2 cells with MARK2-exp plasmid

圖 7 Western blot法檢測(cè)MARK2蛋白的表達(dá)水平Fig. 7 MARK2 protein expression levels detected by Western blot

2.6 MARK2過(guò)表達(dá)對(duì)HepG2細(xì)胞遷移能力的影響

Transwell結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染空載體對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)MARK2后，通過(guò)濾膜遷移至下室的細(xì)胞明顯增多，表明MARK2能夠促進(jìn)HepG2細(xì)胞的遷移（226.330±10.017 vs 98.000±10.536，t=15.290，P＜0.05，圖8）。

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果：過(guò)表達(dá)MARK2的HepG2細(xì)胞48 h劃痕愈合率為53.8%，而轉(zhuǎn)染空載體對(duì)照組48 h劃痕愈合率為32.3%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明過(guò)表達(dá)MARK2后，HepG2細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)（圖9）。

圖 8 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MARK2對(duì)HepG2細(xì)胞遷移能力的影響Fig. 8 Effect of MARK2 on the migration of HepG2 cells detected by transwell assay

圖 9 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MARK2對(duì)HepG2細(xì)胞遷移能力的影響Fig. 9 Effect of MARK2 on migration of HepG2 cells detected by cell scratch test

3 討 論

我國(guó)是肝癌的高發(fā)區(qū)，2015年約有466 100人發(fā)病，422 100例患者因肝癌死亡［7］。因此研究肝癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制并尋找新的特異性HCC分子標(biāo)志物對(duì)我國(guó)HCC診斷和治療可望提供新的線索［8-10］。

在人類癌癥中改變的許多分子機(jī)制中，涉及細(xì)胞分裂周期控制的那些被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生的基礎(chǔ)［11］。在哺乳動(dòng)物中，MARK2定位于細(xì)胞膜并通過(guò)磷酸化微管相關(guān)蛋白來(lái)控制微管的穩(wěn)定性［12］。這種蛋白最初與一類基因產(chǎn)物相關(guān)，調(diào)節(jié)線蟲(chóng)的細(xì)胞極性［13］。Hubaux等［14］揭示了MARK2在非小細(xì)胞肺癌中過(guò)表達(dá)并參與細(xì)胞活力和錨定非依賴性生長(zhǎng)，它的過(guò)表達(dá)是由DNA改變介導(dǎo)的，特別是DNA低甲基化和在較低程度上的DNA復(fù)制增益，確定了MARK2在細(xì)胞周期活化和DNA修復(fù)中的潛在作用，并提供了其與DNA損傷和順鉑敏感性相關(guān)的證據(jù)。此外，通過(guò)熒光素酶測(cè)定鑒定了MARK2與E2F、Myc/Max和NF-κB通路之間的關(guān)聯(lián)，并且對(duì)NF-κB通路的深入評(píng)估表明由于非經(jīng)典活化的激活，MARK2敲低后NF-κB活化增加，后者顯著降低了肺癌細(xì)胞活力，NF-κB可通過(guò)上調(diào)或抑制其靶基因發(fā)揮促凋亡或抗凋亡作用［15-16］。然而，有研究表明，利用可誘導(dǎo)的慢病毒表達(dá)系統(tǒng)，在LKB1基因缺陷的HeLa細(xì)胞中過(guò)表達(dá)MARK2，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)減少，抑制集落形成和在G1期細(xì)胞周期停滯，AMPK作為下游效應(yīng)器上調(diào)p21和p16的表達(dá)。另外發(fā)現(xiàn)MARK2在F-肌動(dòng)蛋白重組中發(fā)揮作用，并有助于逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT），如HeLa細(xì)胞出現(xiàn)表型改變、細(xì)胞遷移和侵襲能力下降。

本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)法發(fā)現(xiàn)MARK2在肝癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織，并且分析了TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中MARK2在肝癌和正常肝組織表達(dá)的差異性，發(fā)現(xiàn)MARK2在肝癌中的表達(dá)水平顯著高于正常肝組織，這與前期組織標(biāo)本中的結(jié)果一致。應(yīng)用組織芯片檢測(cè)MARK2在肝癌中的表達(dá)，但是通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MARK2的表達(dá)在不同年齡、性別、腫瘤數(shù)目、是否有HBV感染、是否有肝硬化、不同TNM分期、腫瘤大小患者中的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），考慮樣本量較少，因此我們分析了TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中MARK2在不同病理分級(jí)及TNM分期的肝癌患者中表達(dá)的差異性，結(jié)果顯示，MARK2在低分化（Ⅲ/Ⅳ級(jí)）患者中的表達(dá)高于高分化（Ⅰ/Ⅱ級(jí)）的患者，另外，MARK2在TNM分期為Ⅳ期的患者中的表達(dá)較Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期升高。運(yùn)用Kaplan-Meier plotter分析了364例肝癌患者的總生存期發(fā)現(xiàn)，MARK2高表達(dá)的患者總生存期較短，預(yù)后不良。通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，我們發(fā)現(xiàn)MARK2過(guò)表達(dá)可增強(qiáng)HepG2細(xì)胞的遷移能力。我們推測(cè)，由于腫瘤的組織特異性及腫瘤細(xì)胞所在微環(huán)境不同，可能導(dǎo)致MARK2在不同腫瘤中發(fā)揮作用的途徑不同。

綜上所述，本研究首次報(bào)道了MARK2在肝癌中的表達(dá)顯著高于正常肝組織，并且高表達(dá)MARK2預(yù)示患者預(yù)后不良。體外研究表明，MARK2促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移能力，可能為HCC的臨床治療提供一個(gè)新的靶點(diǎn)，但是MARK2在HCC中的作用機(jī)制尚需深入研究。