具廣譜抗菌活性桔青霉PA-33的誘變育種

倪 賽， 劉銀春， 李 健， 李肖鶴， 朱向東

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西南昌 330045)

微生物產(chǎn)品被廣泛應(yīng)用在醫(yī)藥生產(chǎn)、環(huán)境修復(fù)、日常用品等各方面。為滿足人類大量需求，研究新的微生物品種已成為微生物應(yīng)用的關(guān)鍵[1]。由微生物產(chǎn)生的抗生素類藥物是微生物誘變育種技術(shù)在制藥領(lǐng)域中的重要應(yīng)用[2]。面對抗生素的產(chǎn)生很難通過單個(gè)編碼基因或表達(dá)調(diào)控因子的改變而達(dá)到理想的效果這一現(xiàn)狀，傳統(tǒng)的誘變育種技術(shù)可以通過簡便快速的誘變及適當(dāng)?shù)暮Y選手段而獲得生產(chǎn)性能優(yōu)良的工業(yè)菌株。因此，傳統(tǒng)的誘變育種技術(shù)在目前抗生素產(chǎn)生菌的選育過程中具有不可取代的地位[3]。除此之外，誘變育種技術(shù)對產(chǎn)抗生素微生物而言具有提高產(chǎn)量、提高純度、改進(jìn)發(fā)酵工藝和產(chǎn)生新抗生素等優(yōu)點(diǎn)[4]。直接從自然界中分離得到的野生型菌株性狀不穩(wěn)定，容易退化，無法滿足實(shí)際需求，這就須要利用育種方法對它們進(jìn)行改造[5]。微生物誘變育種通過改變微生物的遺傳結(jié)構(gòu)和功能，篩選出優(yōu)良的突變型微生物。這種育種方式使微生物變異速度快、效率高，是食品加工和醫(yī)藥生產(chǎn)等工業(yè)的首選[6]。目前，微生物誘變技術(shù)在制藥中的研究主要以獲得高產(chǎn)突變株為目的，通過誘變使酶活性極大提高，被廣泛應(yīng)用于臨床診斷、生物農(nóng)藥及食品化妝品等方面[2]。在霉菌中，因其種類繁多、分布廣泛，又有菌絲和孢子等獨(dú)有特性，故誘變育種具有比較獨(dú)特的特點(diǎn)[7]。除此之外，多種物理誘變和化學(xué)誘變方法的結(jié)合使用，在霉菌中產(chǎn)生了很好的效果，特別是物理誘變方法中的紫外線誘變和化學(xué)誘變方法中的氯化鋰誘變相結(jié)合的運(yùn)用較多[2]。如張建勇等分別采用紫外線單因子誘變、紫外線-LiCl復(fù)合誘變處理藤黃灰鏈霉菌，致使其新型抗生素藤黃灰鏈霉菌素產(chǎn)量提高1.2倍[8]。此外，曹燕妮等以豌豆根瘤菌為出發(fā)菌株，利用紫外-LiCl-超聲波復(fù)合誘變，以期獲得高產(chǎn)輔酶Q10菌株[9]。

目前，人工誘變的育種方式主要包括物理誘變、化學(xué)誘變和生物誘變[7]，在微生物育種中較常見的為物理誘變和化學(xué)誘變。此外應(yīng)用較多的還有復(fù)合誘變，通常僅采用一種方法進(jìn)行誘變，會(huì)使微生物產(chǎn)生抗性，從而降低突變率，復(fù)合誘變具有補(bǔ)充不同誘變方法之間缺陷的優(yōu)勢[6]。本研究主要運(yùn)用紫外誘變、紫外-LiCl復(fù)合誘變、紫外-亞硝酸復(fù)合誘變、微波誘變以及微波-超聲波-3%硫酸二乙酯(diethyl sulfate，簡稱DES)復(fù)合誘變等技術(shù)對桔青霉(Penicilliumcitrinum)PA-33菌株孢子進(jìn)行誘變育種，由此獲得高產(chǎn)抗生素突變菌株，以期為桔青霉PA-33菌株工業(yè)化應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

桔青霉PA-33；病原菌：大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)。以上菌株保存于江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室。

1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯200 g/L、葡萄糖 20 g/L、水1 L、瓊脂15～20 g/L，pH值自然。

馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB)：馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、水1 L，pH值自然。

1.3 菌株桔青霉PA-33誘變育種

1.3.1 孢子懸液的制備 將菌株P(guān)A-33活化后加入適量無菌生理鹽水，洗下孢子，用無菌脫脂棉過濾除去菌絲體和培養(yǎng)基殘?jiān)?，裝入帶有玻璃珠的100 mL錐形瓶中，并置于搖床上振蕩30 min，使孢子充分分散，調(diào)整孢子懸液濃度為 106個(gè)/mL，備用。

1.3.2 紫外誘變處理 (1)在9個(gè)放置有無菌磁棒的培養(yǎng)皿中分別加入8 mL孢子懸液；(2)將培養(yǎng)皿放置在事先預(yù)熱20 min的15 W紫外燈下，照射距離為24 cm；(3)在磁力攪拌器上打開皿蓋，分別照射0 s、30 s、60 s、90 s、2 min、4 min、6 min、9 min、15 min；(4)吸取處理后的孢子懸液1 mL依次進(jìn)行10倍稀釋，吸取10-2、10-3、10-4等3個(gè)梯度孢子懸液 0.2 mL 涂平板，重復(fù)3次，28 ℃恒溫培養(yǎng)3～5 d，根據(jù)菌落數(shù)計(jì)算致死率，選擇致死率為90%左右的條件作為紫外誘變的最適條件；(5)誘變菌株初篩：采用致死率為90%的條件誘變，挑取菌落生長速度快且菌落直徑大的單菌落，進(jìn)行復(fù)篩；(6)將初篩的菌株分別接種至PDB培養(yǎng)基中，置于28 ℃、150 r/min 的搖床上培養(yǎng)7 d，以大腸桿菌為指示菌，以原始菌株P(guān)A-33為對照，采用管碟法測定各突變菌株發(fā)酵液的抑菌圈直徑，根據(jù)抑菌圈直徑增加的大小確定最佳突變菌株。

1.3.3 紫外-LiCl復(fù)合誘變處理 將紫外誘變致死率為90%的孢子懸液依次稀釋10倍，選取10-2、10-3、10-4稀釋度的孢子懸液200 μL涂布于含LiCl濃度為0、0.3%、0.6%、1.0%、1.5%、2.0%的PDA平板中，每組重復(fù)3次，參照“1.3.2”節(jié)方法確定最佳突變菌株。

1.3.4 紫外-亞硝酸復(fù)合誘變處理 (1)將菌株P(guān)A-33參照紫外誘變致死率為90%的條件處理；(2)在每個(gè)試管中分別加入1 mL 0.2 mol/L NaNO2溶液、2 mL孢子懸液、1 mL pH值為4.5的醋酸緩沖液，充分混勻后，置于27 ℃水浴鍋中分別處理0、5、10、15、20、30、45、60 min，并加入2 mL 0.07 mol/L pH值為8.6的Na2HPO4溶液，每組重復(fù)3次。參照“1.3.2”節(jié)方法確定最佳突變菌株。

1.3.5 微波誘變處理 (1)火力強(qiáng)度的確定：分別吸取8 mL菌株P(guān)A-33孢子懸液于3個(gè)培養(yǎng)皿中，在不加蓋條件下，分別用額定功率700 W、頻率22 kHz的低火、中火、高火處理 20 s，吸取處理后的孢子懸液1 mL進(jìn)行10倍稀釋，吸取10-2、10-3、10-43個(gè)稀釋度的孢子懸液200 μL涂布于盛有PDA的平板中，重復(fù)3次，28 ℃恒溫培養(yǎng)3～5 d，記錄菌落數(shù)確定微波誘變火力強(qiáng)度。(2)致死率試驗(yàn)：使用最合適的火力強(qiáng)度進(jìn)行微波誘變試驗(yàn)，分別吸取8 mL孢子懸液至平板中，微波爐中分別低火處理0、5、10、15、20、25、30、40、60 s，每組重復(fù)3次。參照“1.3.2”節(jié)方法確定最佳突變菌株。

1.3.6 微波-超聲波-3%硫酸二乙酯(diethyl sulfate，簡稱DES)復(fù)合誘變處理 (1)在50 mL錐形瓶中分別加入16 mL pH值為7的磷酸緩沖液、4 mL 突變菌株WB-6孢子懸液和0.6 mL DES(DES終濃度為3%)，并在200 W、22 kHz超聲波冰水浴條件下分別處理0、3、6、9、15、25、40、60 min，每組重復(fù)3次。參照“1.3.2”節(jié)方法確定最佳突變菌株。

1.3.7 突變菌株遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn) 將各突變菌株連續(xù)傳代6代，測定其發(fā)酵液的抗菌活性。

1.3.8 突變菌株抗菌活性測試 利用管碟法，以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌為指示菌，測定突變菌株發(fā)酵液的抗菌活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株桔青霉PA-33紫外誘變

2.1.1 紫外誘變致死率試驗(yàn) 由圖1可知，在紫外燈功率15 W、照射距離24 cm條件下，隨著誘變時(shí)間的增加，紫外誘變致死率逐漸增大，在1.5 min時(shí)，致死率為76.92%，在 2 min 時(shí)，致死率為96.70%，誘變時(shí)間超過9 min時(shí)，致死率超過99.00%。因此，選擇紫外誘變條件為紫外燈功率15 W、照射距離24 cm、照射時(shí)間2 min。

2.1.2 紫外誘變突變菌株篩選 從平板上挑取44個(gè)菌落進(jìn)行復(fù)篩，結(jié)果顯示，紫外線對菌株P(guān)A-33誘變效果較差，僅有8個(gè)突變菌株的抑菌圈直徑增大，正向突變率僅為18.18%，其中突變菌株UV-22抑菌圈直徑最大，活性提高率卻僅為12.55%(表1)。

2.2 菌株桔青霉PA-33紫外-LiCl復(fù)合誘變

2.2.1 菌株P(guān)A-33紫外-LiCl復(fù)合誘變致死率試驗(yàn) 由圖2可知，菌株P(guān)A-33在紫外燈功率15 W、照射距離24 cm、照射時(shí)間2 min的誘變條件下，隨著LiCl濃度的增加，其致死率整體增大，在LiCl濃度為0.6%時(shí)，致死率為88.12%，LiCl濃度繼續(xù)增加到1.5%時(shí)，致死率達(dá)100%。因此，確定紫外-LiCl復(fù)合誘變條件為紫外燈功率15 W、照射距離24 cm、照射時(shí)間2 min、LiCl濃度為0.6%。

表1 紫外誘變復(fù)篩菌株及其抗菌活性

2.2.2 紫外-LiCl復(fù)合誘變突變菌株篩選 從平板上挑取28個(gè)菌株進(jìn)行復(fù)篩，6個(gè)突變菌株抗菌活性增強(qiáng)，正向突變率為21.43%。由表2可知，突變菌株Li-1的抑菌圈直徑最大，為26.13 mm；活性提高率最大，為39.51%。突變菌株 Li-13、Li-17、Li-19、Li-27、Li-28活性提高率分別為7.47%、3.58%、6.03%、11.05%、9.08%，其中突變菌株 Li-17 活性提高率最低，僅為3.58%。

表2 紫外-LiCl復(fù)合誘變復(fù)篩菌株及其抗菌活性

2.3 菌株桔青霉PA-33紫外-亞硝酸復(fù)合誘變

2.3.1 菌株P(guān)A-33紫外-亞硝酸復(fù)合誘變致死率試驗(yàn) 由圖3可知，菌株P(guān)A-33在紫外燈功率15 W、照射距離 24 cm、照射時(shí)間2 min誘變的基礎(chǔ)上，進(jìn)行亞硝酸誘變，亞硝酸濃度為0.2 mol/L條件下，隨著誘變時(shí)間的增加，其孢子致死率逐漸增大，當(dāng)誘變時(shí)間為30、45、60 min時(shí)，孢子致死率分別為76.47%、91.18%、94.12%。因此，確定紫外-亞硝酸復(fù)合誘變條件為紫外燈功率15 W、照射距離24 cm、照射時(shí)間 2 min、0.2 mol/L亞硝酸作用時(shí)間45 min。

2.3.2 紫外-亞硝酸復(fù)合誘變突變菌株篩選 從平板上挑取41個(gè)突變菌株進(jìn)行復(fù)篩，其中11個(gè)突變菌株抗菌活性增強(qiáng)，正向突變率為26.83%。由表3可知，突變菌株H-14和 N-25抑菌圈直徑最大，分別為26.27、26.07 mm，活性提高率分別為40.26%、39.19%。

2.4 菌株桔青霉PA-33微波誘變

2.4.1 微波誘變火力強(qiáng)度確定 將菌株P(guān)A-33孢子懸液分別經(jīng)微波低火、中火和高火處理20s，結(jié)果(表4)顯示，低火處理組存活的菌落數(shù)為6.5×104個(gè)/mL，而中火和高火處理組無存活菌落數(shù)，因此選用低火作為微波誘變的火力強(qiáng)度。

表3 紫外-亞硝酸復(fù)合誘變復(fù)篩菌株及其抗菌活性

表4 微波火力強(qiáng)度對菌株P(guān)A-33孢子存活能力的影響

2.4.2 菌株P(guān)A-33微波誘變致死率試驗(yàn) 由圖4可知，菌株P(guān)A-33的孢子懸液經(jīng)功率為700 W、頻率22 kHz的微波低火處理時(shí)，隨著處理時(shí)間的延長，其孢子致死率逐漸增加，處理時(shí)間為25 s時(shí)，致死率為85.88%，處理時(shí)間為30 s時(shí)，致死率已達(dá)到90.40%，處理60 s時(shí)，致死率已接近97%。因此，確定微波誘變菌株P(guān)A-33的條件為微波爐功率700 W，頻率22 kHz，低火處理30 s。

2.4.3 菌株P(guān)A-33微波誘變突變菌株篩選 從平板上挑取39株突變菌株進(jìn)行發(fā)酵，抑菌活性測試結(jié)果見表5。共有24株突變菌株發(fā)酵液抑菌圈直徑增強(qiáng)，正向突變率為 61.54%，其中突變菌株WB-6抑菌圈直徑為25.40 mm，抗菌活性提高率最高，為32.29%。

表5 微波誘變復(fù)篩菌株及其抑菌活性

2.5 菌株桔青霉PA-33微波-超聲波-3%DES復(fù)合誘變

2.5.1 微波-超聲波-DES復(fù)合誘變致死率試驗(yàn) 微波誘變突變菌株WB-6孢子懸液經(jīng)超聲波聯(lián)合3%DES誘變處理不同時(shí)間。由圖5可知，隨著誘變時(shí)間的延長，其孢子懸液致死率不斷增加。當(dāng)處理時(shí)間為15 min時(shí)，致死率已達(dá)到88.89%；當(dāng)處理時(shí)間為60 min時(shí)，致死率達(dá)到98.77%。因此，確定超聲波-3%DES誘變條件為200 W、22 kHz超聲波強(qiáng)度、3%DES處理15 min。

2.5.2 微波-超聲波-3% DES復(fù)合誘變突變菌株篩選 挑取29株突變菌株用于抗菌活性測試，由表6可知，共有18株突變菌株發(fā)酵液抗菌活性增強(qiáng)，正向突變率為62.07%，其中突變菌株D-11抑菌圈直徑為23.20 mm，抗菌活性提高率最大，達(dá)到20.83%。

2.6 突變菌株傳代穩(wěn)定性測試

由圖6可知，突變菌株Li-1、H-14、N-25的傳代穩(wěn)定性較好，傳代至6代抗菌活性基本穩(wěn)定。突變菌株WB-6、D-11的傳代穩(wěn)定性較差， 發(fā)酵液抑菌圈直徑總體呈下降趨勢，突變菌株WB-6抗菌活性提高率維持在30.97%～32.29%，突變菌株D-11的抗菌活性提高率變化區(qū)間為 23.17%～28.51%。綜上，突變菌株Li-1、H-14、N-25是傳代穩(wěn)定性較好的菌株，突變菌株WB-6、D-11傳代穩(wěn)定性較差。

表6 微波-超聲波-3% DES復(fù)合誘變復(fù)篩菌株及其抑菌活性

2.7 突變菌株抗菌活性測試

與原始菌株P(guān)A-33發(fā)酵液抗菌活性相比，突變菌株 Li-1對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、大腸桿菌的抑菌圈直徑分別增加5.53、9.80、6.53、7.40 mm；突變菌株H-14對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、大腸桿菌的抑菌圈直徑分別增加4.66、7.54、5.20、7.54 mm；突變菌株N-25對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、大腸桿菌的抑菌圈直徑分別增加4.33、9.07、5.73、7.34 mm；突變菌株WB-6對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、大腸桿菌的抑菌圈直徑分別增加4.13、6.27、6.06、6.67 mm；突變菌株D-11對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、大腸桿菌的抑菌圈直徑分別增加3.23、4.67、3.33、5.34 mm。其中突變菌株Li-1抗菌活性最大，突變菌株H-14、N-25、WB-6次之，D-11抗菌活性最小(表7)。

表7 突變菌株抗菌活性測試

3 結(jié)論與討論

分別采用紫外誘變、紫外-LiCl復(fù)合誘變、紫外-亞硝酸復(fù)合誘變、微波誘變以及微波-超聲波和3%DES復(fù)合誘變菌株P(guān)A-33，分別篩選得到抗菌活性提高最大的突變菌株 Li-1、N-25、H-14、WB-6、D-11，它們對大腸桿菌的抗菌活性分別提高39.51%、39.19%、40.26%、32.29%、20.83%。通過傳代穩(wěn)定性測試，突變菌株Li-1、H-14、N-25是傳代穩(wěn)定性較好的菌株，突變菌株WB-6、D-11傳代穩(wěn)定性較差。紫外單因子誘變突變菌株的活性提高率最高僅為12.55%，而在紫外誘變基礎(chǔ)上，進(jìn)行LiCl誘變后，抗菌活性明顯增強(qiáng)，最高活性提高率增至 39.51%；同時(shí)在紫外誘變基礎(chǔ)上進(jìn)行亞硝酸誘變后，得到突變菌株N-25、H-14的抗菌活性明顯增強(qiáng)，活性提高率分別增至39.19%、40.26%。紫外誘變對菌株P(guān)A-33的誘變效果較差，可能是因?yàn)樽贤饩€主要阻礙堿基間的正常配對和妨礙雙鏈的解開而使菌株發(fā)生變異，其引起的突變單一[10]，形成的突變體類型較少。而在紫外誘變基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行LiCl和亞硝酸誘變使得菌株P(guān)A-33產(chǎn)生高比例點(diǎn)突變和低比例的染色體畸變，從而使誘變效果增強(qiáng)。朱峰等分別使用3種復(fù)合誘變方法處理Snea253-GL 8菌株，篩選出高殺蟲活性和穩(wěn)定高產(chǎn)的突變株[11]。韓娜應(yīng)用亞硝酸結(jié)合消泡劑誘變選育得到的9S-189菌株，該菌株能顯著提高對消泡劑的耐性并能夠更適應(yīng)高消泡劑的環(huán)境[12]。Xu等將StreptomycespristinaespiralisCGMCC 0957菌株經(jīng)紫外線誘變結(jié)合耐自身產(chǎn)物抗性篩選，獲得普納霉素高產(chǎn)菌株[13]。劉明志等以產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌葡萄座腔菌菌株J11為出發(fā)菌，經(jīng)甲基磺酸乙酯和制霉菌素復(fù)合誘變，得到誘變菌株J11-8，產(chǎn)紫杉醇量提高66.5%[14]。胡丹東等以產(chǎn)核酸酶P1桔青霉050421為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外線誘變處理，其突變菌株050421-A產(chǎn)酶活性比出發(fā)菌株提高了約68.1%，同時(shí)將此菌株再經(jīng)過化學(xué)試劑LiCl處理，得到遺傳穩(wěn)定性較好的菌株050421-A-AB，其產(chǎn)酶活性在紫外誘變基礎(chǔ)上提高了40.05%，比原始出發(fā)菌株050421提高了約138.88%[15]。

微波誘變以及微波-超聲波-3% DES復(fù)合誘變效果相對較好，其中微波-超聲波-3% DES復(fù)合誘變效果明顯低于微波單因子誘變效果，突變菌株D-11的抗菌活性提高率明顯低于突變菌株WB-6，微波單因子誘變效果明顯，原因可能是以下3個(gè)方面[16]：(1)微波是一種電磁波，可使單孢子內(nèi)DNA分子氫鍵和堿基對及化學(xué)力受損，最終引起分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致遺傳變異；(2)微波極強(qiáng)的穿透效應(yīng)，使細(xì)胞壁內(nèi)外的水分子產(chǎn)生劇烈運(yùn)動(dòng)，從而改變細(xì)胞壁通透性，使胞內(nèi)物質(zhì)被釋放出來；(3)微波所產(chǎn)生的瞬時(shí)熱效應(yīng)，易引起酶失活，從而造成細(xì)胞的生理、生化變異和微生物的動(dòng)態(tài)代謝平衡發(fā)生紊亂，從而改變其代謝途徑。鮑勇陽等采用微波-DES復(fù)合誘變，以產(chǎn)淀粉酶黑曲霉為出發(fā)菌株，得到的突變株再經(jīng)發(fā)酵優(yōu)化后，其α-淀粉酶的酶活性最高達(dá)到 6 011 U/g[17]。蘇龍等以產(chǎn)核酸酶P1桔青霉為出發(fā)菌株，通過微波誘變，得到1株產(chǎn)核酸酶較高的生產(chǎn)菌SL5，其產(chǎn)生的核酸酶P1酶活性提高了84.00%[18]。田利飛等以YC34菌株為出發(fā)菌株，通過紫外誘變、微波誘變、LiCl誘變3種方式依次進(jìn)行復(fù)合誘變處理后，獲得突變株YC34-1，其初發(fā)酵液的酶活性增加了183.3%[19]。