肝郁證元素在建立多囊卵巢大鼠模型中的干預作用*

牛艷艷，賈力莉，宋美卿，馮瑪莉，楊 鈐

(山西省中醫(yī)藥研究院，太原 030012)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)是婦科內分泌疾病中最為常見的一種疾病，是一種生殖功能障礙與代謝異常并存的內分泌紊亂綜合征[1]。大量臨床研究發(fā)現，該病多起病于圍初潮期，從青春期開始發(fā)病至20～30歲呈現發(fā)病高峰，約占總數的85.3%。青春期PCOS患者代謝紊亂，尤其是脂質代謝紊亂，發(fā)生率高達 48.3%，是動脈硬化癥和冠心病的高危人群，早期對其生活方式調整和代謝紊亂的糾正，能預測和發(fā)現青春期PCOS，為早期阻斷和糾正其內分泌紊亂奠定基礎[2]。近10年，PCOS治療范圍的擴大，不僅限于對高雄激素和月經紊亂的治療，而且通過糾正血脂異常，預防發(fā)生遠期心血管疾病，并成為治療 PCOS 的遠期目標之一。更有學者提出，與PCOS相關的心血管疾病危險因素即胰島素抵抗、高血壓和血脂異常，應納入PCOS的日常健康治療方案中[3]。

大鼠PCOS模型制備多停留在激素給藥的階段，旨在模擬人類PCOS病理特征和激素改變，檢測指標多為影響生殖的激素類指標，但尚未見關注情志在青春期PCOS致病中的作用，與之相關聯的PCOS的代謝指標也少有研究。根據中醫(yī)對PCOS的辨證分型以肝郁證最多，結合中醫(yī)“肝郁”對青春期多囊卵巢綜合征的臨床研究資料，本研究選擇更接近臨床表現的肝郁型青春期多囊卵巢綜合征的實驗動物模型，采用慢性不可預知性應激反應[4]和雄激素致多囊卵巢綜合征相結合的方法，通過檢測本模型中脂質代謝指標的相應變化規(guī)律，探討其對代謝紊亂的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠雌性，24 d齡(許可證號SCXK(京)2014-0013,合格證號11400500011999)。飼養(yǎng)環(huán)境：屏障環(huán)境，溫度22±1 ℃，濕度(50±5)%RH，動物自由飲水、攝食，大小鼠維持飼料，中國食品藥品檢定研究院。

1.1.2 藥物、試劑和儀器 甘油三酯測定試劑盒(TG，GPO-PAP法，批號157231)、膽固醇測定試劑盒(TC，CHOD-PAP法，批號151851)、低密度脂蛋白測定試劑盒(LDL,直接法-表面活性劑清除法，批號140451)、高密度脂蛋白測定試劑盒(HDL，直接法-過氧化氫酶清除法，批號140481)，以上4種試劑盒均為中生北控生物科技股份有限公司生產。脫氫表雄酮(DHEA)，武漢欣欣佳麗生物科技有限公司(批號20140603)；胰島素(INS)，武漢優(yōu)爾生科技有限公司(Uscn Life Science Inc)；CCA448Ra,Lot:L160323685, Exp:Sept.2016。瘦素(LP)，E0084 r,Lot:6D055c, Exp:Oct.2016；脂聯素(ADP)，E0605 r；Lot:6D055c； Exp:Oct.2016，以上2種試劑盒均為伊艾博生物科技有限公司生產(WUHAN EIAAB SCIENCE CO.,LTD.)。電子天平(BP310P，德國賽多利斯)；萬能顯微鏡熒光成像系統(tǒng)(BX51+DP72+IPE)；全自動生化分析儀(chemray 360)，深圳雷杜生命科學股份有限公司(意大利)；多功能微孔讀板機(Synergy H1)，美國BioTek；培養(yǎng)箱(LRH-150)，廣東省醫(yī)療器械廠；光熱尾痛儀(SW-200)，成都泰盟科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 造模與分組 取雌性24 d齡大鼠40只，按隨機數字表法分為空白對照組、肝郁組、雄激素組、肝郁加雄激素組4組各10只，除空白對照組外其余各組分別造模。肝郁組按照文獻方法[5]采用8種刺激法(禁食禁水24 h，4 ℃冰水游泳2 min，孤養(yǎng)且鼠籠傾斜45°放置24 h,破壞生活環(huán)境,耳部電擊(36.5v),晝夜顛倒,烘箱(45 ℃)烘烤5 min)，每天1種，且相鄰2 d不得重復同一種刺激，使大鼠不能預料刺激的發(fā)生；雄激素組將脫氫表雄酮(DHEA)溶于80%甘油中，大鼠皮下注射DHEA 60 mg/(kg·d)，每只每日注射0.2ml[6]；肝郁加雄激素組同時進行肝郁法和雄激素法造模，各組動物造模時間均為21 d。

1.2.2 指標觀察 動物動情周期的觀察:造模結束后，各組連續(xù)4 d同一時間進行陰道涂片，并行巴氏染色觀察陰道脫落細胞形態(tài)變化，檢測大鼠動情周期變化；殺檢取材及指標觀察:造模結束后，各組大鼠殺檢后取雙側卵巢10%甲醛固定，石蠟包埋常規(guī)切片，HE染色鏡檢觀察卵巢組織病理變化；檢測指標:造模結束后，禁食12 h后各組大鼠10%水合氯醛麻醉，下腔靜脈取血放置2000 r/min離心分離血清。自動生化分析儀檢測甘油三脂(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL),化學發(fā)光法檢測胰島素(FINS),酶聯免疫法檢測瘦素(LEP)和脂聯素(ADP)。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 造模情況觀察結果

2.1.1 動物動情周期的觀察 圖1顯示，成熟大鼠有較穩(wěn)定的動情周期，持續(xù)時間4～5 d。造模21 d結束后陰道涂片結果顯示，空白對照組大鼠陰道涂片可見有規(guī)律的動情周期，造模組大鼠陰道涂片則均持續(xù)出現大量角化無核的上皮細胞。3個造模組比較，肝郁組出現不規(guī)則動情周期的比例小于其余2組造模組。

圖1 各組陰道涂片觀察比較

2.1.2 動物組織病理學觀察 圖2顯示，鏡下空白對照組見多個黃體及不同發(fā)育階段的卵泡、卵泡膜細胞層、顆粒細胞層，卵細胞各層次解剖結構清晰；肝郁組鏡下可觀察到有的動物出現較多閉鎖卵泡，有些則未出現；雄激素組和肝郁聯合雄激素組全部出現較多空泡，卵母細胞或放射冠消失，黃體數目明顯減少。

2.1.3 造模結束后各組動物檢測指標結果 (1)對各組動物血脂的影響：表1顯示，全自動分光光度法檢測大鼠造模完成后肝郁組、雄激素組和肝郁加雄激素組與空白對照組比較，甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)均有升高趨勢，其中雄激素組和肝郁加雄激素組甘油三脂(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)與空白對照組比較有顯著升高 (P<0.05，P<0.01，P<0.001)；與雄激素組比較，甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白(LDL)有顯著升高 (P<0.05)。(2)對胰島素、脂聯素和瘦素的影響：表2顯示，化學發(fā)光免疫吸附法測定模型各組與空白對照組比較胰島素(INS)有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義；酶聯免疫吸附法檢測與空白對照組比較，激素組和肝郁加激素組瘦素(LP)明顯升高(P<0.05)，肝郁加激素組脂聯素(ADP)明顯降低(P<0.001)；與激素組比較，肝郁加激素組顯著降低(P<0.05)。

圖2 各組HE染色病理結果比較

3 討論

中醫(yī)臨床對多囊卵巢綜合征辨證多從脾腎著手，病因病機也多因脾腎陽虛、痰濕凝聚所致。從中醫(yī)肝對生殖系統(tǒng)影響來看,《素問病機氣宜保命集·婦人胎產論》曰：“婦人天癸既行，皆從厥陰論之?！比~天士《臨證指南醫(yī)案》云：“女子以肝為先天。”婦人經帶胎孕發(fā)端于天癸，憑借于沖任，植根于胞宮皆賴肝血旺盛。肝氣疏暢則任通沖盛，月經以時下，胎孕乃成。肝之疏泄失司易致肝郁氣滯，氣滯則血滯成瘀，瘀阻胞脈胞絡，卵子無法正常排出。肝之藏血失司，陰血下注胞宮失去正常月節(jié)律，月經潮止無常，經血不調，變生他證，日久甚則發(fā)為癓瘕積聚，最終形成多囊卵巢。“從肝論治”多囊卵巢綜合征取得的療效，亦佐證了肝在多囊卵巢綜合征辨證中不可動搖的地位[7]。中醫(yī)對PCOS的辨證分型以肝郁證、痰濕證所占比例最大，分別為37.5%、36.4%，其次是腎虛證、血瘀證較少，說明肝郁是PCOS的重要病機之一[8]?，F代醫(yī)學研究提示，慢性不可預知性應激反應(CUS)是指當機體感受應激源時，下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA)興奮性提高，腎上腺分泌應激激素糖皮質類固醇升高，從而動員儲能適應應激反應，有利于機體度過短期惡劣環(huán)境。但若機體長期處于應激狀態(tài)，HPA軸功能持續(xù)亢進，將嚴重影響人體的身心健康，使機體出現抑郁癥狀。應激模型能較真實地模擬抑郁病人的某些病因和癥狀，故可用于抑郁癥的病理生理機制，是目前應用和研究較多的郁證模型。

表1 對血脂的影響

注：與空白對照組比較:1)P<0.05，2)P<0.01，3)P<0.001；與雄激素組比較：4)P<0.05

表2 對胰島素、瘦素、脂聯素的影響比較

注：與空白對照組比較：1)P<0.05，3)P<0.001；與雄激素組比較：4)P<0.05

動物陰道涂片結果顯示，空白對照組大鼠陰道涂片可見有規(guī)律的動情周期，造模組大鼠陰道涂片則均持續(xù)出現大量角化無核的上皮細胞。此外病理結果顯示，空白對照組見多個黃體及不同發(fā)育階段的卵泡、卵泡膜細胞層、顆粒細胞層，卵細胞各層次解剖結構清晰，造模組出現較多空泡，卵母細胞或放射冠消失，黃體數目明顯減少，以上結果均提示造模成功。實驗結果顯示，單純連續(xù)使用“肝郁”刺激，使雌性大鼠的動情周期發(fā)生明顯變化，病理結果提示出現了一定程度的病理組織形態(tài)學改變，其對脂質代謝的影響逐漸顯現，但這些變化呈現出一定的趨勢性，并未全部出現。由于“肝郁”因素的加入，肝郁聯合雄激素組大鼠的TG、TC、HDL、LDL檢測指標均有升高趨勢，且使LDL和TG值攀升幅度加大，提示“肝郁”對這兩項指標均有較大的潛在危害；瘦素和脂聯素都是脂肪細胞分泌的活性物質[9]，是機體脂質代謝調控網絡中的重要調控因子，“肝郁”對瘦素和脂聯素均有顯著影響，以對脂聯素的影響更為明顯。有報道稱，血漿脂聯素水平與甘油三脂和低密度脂蛋白成負相關關系，在本實驗中亦得到證實。提示“肝郁”因素使大鼠脂質代謝紊亂程度進一步加深。另外，瘦素和脂聯素對胰島素有增敏作用。本實驗檢測顯示，胰島素的變化雖然還不甚明顯，但推測隨著脂質代謝紊亂程度的積累，其遠期效應會大大增強2型糖尿病、心功能低下及動脈粥樣硬化的發(fā)生率，還需作進一步的研究探討。綜上所述，肝郁對青春期大鼠生理功能的影響不可小覷。提示青春期多囊卵巢綜合癥這個群體，在臨床辨證施治時，因其在現代社會中的眾多角色，導致其心理負荷過重、心理壓力過大等情志變化，會直接影響到各項生理指標和臨床癥狀，這就是為什么臨床治療時加入疏肝思路常常收到意想不到的療效，因此多關注青春期多囊卵巢綜合癥女性情志的變化，重視早期診斷，因勢利導，切斷疾病可能發(fā)生潛在的諸多病因，遏制其代謝的“聯動效應”，真正貫穿中醫(yī)“整體觀念、辨證論治”的理論思想，是臨床治療青春期多囊卵巢綜合癥疾病時需要加入的新思路。