促排卵過程中累積促性腺激素使用量對后續(xù)凍融胚胎移植周期妊娠結(jié)局的影響

劉闖，馬媛，海溧，李博，曹澤磊，馬夜肥，康彬，李麗，王曉紅

(空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心，西安 710038)

促排卵(COH)是體外受精-胚胎移植技術(shù)的關(guān)鍵步驟之一，其目的是在一個治療周期內(nèi)獲得多于自然生理過程的卵母細(xì)胞數(shù)，進而提高累計妊娠率。促性腺激素(Gn)用量的增大可以提高獲卵數(shù)，提高累積妊娠率，但是種植率和活產(chǎn)率下降，并且會增加卵巢過度刺激綜合征的發(fā)生風(fēng)險[1-2]。有研究表明，高劑量Gn的使用可能通過影響卵母細(xì)胞及胚胎質(zhì)量和子宮內(nèi)膜容受性[2-5]進而影響新鮮周期的臨床結(jié)局。然而，在凍融胚胎移植(FET)周期中，雖然避免了Gn對子宮內(nèi)膜的影響，但是既往促排過程中高Gn用量對胚胎產(chǎn)生的影響是否對會影響FET臨床結(jié)局，目前尚不明確，因此，本研究回顧性分析我院2016年10月1日至2017年11月30日FET周期的患者臨床資料，探討Gn累積使用量對后續(xù)FET周期臨床結(jié)局影響，以期能為輔助生殖技術(shù)臨床工作提供參考。

資料與方法

一、研究對象與分組

1.研究對象：回顧性分析我院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心2016年10月1日至2017年11月30日行FET周期的患者臨床資料，最終符合研究條件的治療周期共1 923個(1 856名患者)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)取卵次數(shù)≤2次；(2)胚胎移植次數(shù)≤2，且移植胚胎中至少有一個好的或者中等胚胎。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)因各種因素行胚胎種植前遺傳學(xué)診斷/篩查(PGD/PGS)助孕；(2)男方精子畸形率≥99%；(3)移植方式為雙移植；(4)促排卵方案為自然周期或微刺激周期；(5)宮腔粘連或子宮畸形患者；(6)失訪或數(shù)據(jù)缺失。

2.分組：促排卵過程中使用Gn藥物主要有果納芬(75 U/450 U，默克，瑞士)、普利康(100 U/600 U，默沙東，美國)和麗申寶(75 U，麗珠)，為了便于計算，在臨床工作中將使用量統(tǒng)一折合為75 U/支。根據(jù)FET患者人數(shù)以及在促排卵周期累積Gn使用量，將研究對象平均分為3組，A組：低劑量組，共572周期，Gn使用量(14.9±2.9)支(3～19支)；B：中等劑量組，共660周期，Gn使用量(24.5±3.2)(20～30支)；C組：高劑量組，共691周期，Gn使用量(44.7±12.9)(31～97支)。

二、治療過程

1.促排卵：促排卵方案為長方案和拮抗劑方案，所用方法同既往研究[6]。當(dāng)主導(dǎo)卵泡直徑 ≥18 mm時，或至少有3枚卵泡直徑≥17 mm時，根據(jù)雌激素水平選擇肌注人絨毛膜促性腺激素(HCG，珠海麗珠)5 000～10 000 U/艾澤(默克雪蘭諾，意大利)250 μg，34～36 h后B 超引導(dǎo)下行經(jīng)陰道穿刺取卵手術(shù)[7]。

2.體外受精-胚胎培養(yǎng)：根據(jù)病史和檢測結(jié)果，采用IVF/ICSI技術(shù)行體外受精，受精后16～18 h評估受精結(jié)果，并將正常受精的合子在胚胎培養(yǎng)箱(COOK)內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)3～6 d。

3.胚胎評估：D3和D5胚胎評估根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會生殖醫(yī)學(xué)分會實驗室學(xué)組共識[8]和Istanbul共識[9]，根據(jù)胚胎細(xì)胞數(shù)目、碎片、囊胚的內(nèi)細(xì)胞團和外滋養(yǎng)層細(xì)胞將胚胎質(zhì)量分為三個級別，即優(yōu)質(zhì)胚胎、中等質(zhì)量胚胎和差等胚胎。

4.胚胎凍融：采用玻璃化方法將胚胎冷凍保存，所用冷凍及解凍試劑、Crytop栽桿均來自Kitazato(日本)，具體方法如下[10]：(1)胚胎冷凍：將胚胎/囊胚從培養(yǎng)液CM/BM(COOK，美國)中轉(zhuǎn)移至平衡液ES中，室溫下靜置5 min，隨后轉(zhuǎn)入玻璃化冷凍液VS中，60 s以內(nèi)將胚胎轉(zhuǎn)移到做好標(biāo)記的載桿上，迅速投入液氮中并蓋帽保存；(2)胚胎解凍：從液氮中取出栽桿，迅速將裝有胚胎的葉片前端分別置于 TS 液中1 min，DS液3 min，WS1液5 min，WS2液5 min(置于37℃熱板上)，最后轉(zhuǎn)移至BM液中培養(yǎng)。

5.凍融周期胚胎移植：排卵正常者一般選擇自然周期移植；排卵異常者則采用激素替代周期或使小劑量促性腺激素進行內(nèi)膜準(zhǔn)備。胚胎解凍后存活，則在B超引導(dǎo)下行胚胎移植術(shù)，同時進行黃體支持。胚胎移植后15 d檢測血HCG，若HCG陽性，則判斷為生化妊娠，胚胎移植4周后行超聲檢查，可見胎心搏動者為臨床妊娠。

6.變量收集及觀察指標(biāo)：

(1)記錄患者年齡、體重指數(shù)(BMI)、基礎(chǔ)卵泡刺激素(FSH)、基礎(chǔ)抗苗勒氏管激素(AMH)、基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)、不孕年限、不孕類型、不孕因素、新鮮周期所用促排卵方案及受精方式，凍融周期胚胎移植當(dāng)日子宮內(nèi)膜厚度、凍融周期胚胎移植當(dāng)日子宮內(nèi)膜厚度及形態(tài)、凍融周期移植胚胎的形態(tài)及胚胎質(zhì)量。

(2)觀察指標(biāo)：以下指標(biāo)概念參考2009年監(jiān)測輔助生殖技術(shù)國際委員會和世界衛(wèi)生組織修訂輔助生殖技術(shù)術(shù)語詞匯表[11]，著床率=著床胚胎數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠例數(shù)/總移植周期數(shù)×100%；異位妊娠率=異位妊娠例數(shù)/臨床妊娠例數(shù)×100%；流產(chǎn)率=流產(chǎn)例數(shù)/臨床妊娠例數(shù)×100%；持續(xù)妊娠率=目前隨訪中妊娠仍順利進行的患者/臨床妊娠例數(shù)×100%。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、一般資料比較

本研究共納入1 923個FET周期，比較分析3組間患者的一般資料，結(jié)果發(fā)現(xiàn)A組與B組相比，女方年齡、BMI、基礎(chǔ)FSH和AMH水平均存在統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；A組與C組相比，女方年齡、BMI及基礎(chǔ)FSH、AMH、AFC、不孕類型以及不孕因素中的男方因素和雙方因素之間均存在統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；B組和C組相比，女方年齡、BMI、基礎(chǔ)FSH、AMH、不孕年限、不孕類型、不孕因素中的男方因素和雙方因素之間存在統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)(表1)。

表1 患者一般情況比較[(-±s)，n(%)]

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05

二、促排卵周期中基礎(chǔ)臨床數(shù)據(jù)比較

在促排卵過程中，3組間的Gn天數(shù)和獲卵數(shù)相比較，均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，而3組受精方式相比，均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；A組的促排卵方案與B、C兩組比較，均有顯著性差異(P<0.05)；B組與C組相比，短效長方案和長效長方案之間均有顯著性差異(P<0.05)，而兩組間的拮抗劑方案無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(表2)。

表2 促排卵周期中基礎(chǔ)臨床數(shù)據(jù)比較[(-±s)，n(%)]

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05

三、FET周期中基礎(chǔ)臨床數(shù)據(jù)的比較

FET周期中，3組患者的胚胎移植日內(nèi)膜形態(tài)、移植胚胎數(shù)、子宮內(nèi)膜厚度及形態(tài)比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；A組與B組相比，移植胚胎質(zhì)量中的優(yōu)質(zhì)胚胎和中等胚胎差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；A組與C組相比，胚胎類型、移植胚胎質(zhì)量中的優(yōu)質(zhì)胚胎和中等胚胎均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；B組和C組相比，胚胎類型、移植胚胎質(zhì)量均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(表3)。

四、FET周期中Gn用量與妊娠結(jié)局的單因素分析

FET周期中，3組患者的著床率(54.9%、52.1%、47.4%)和臨床妊娠率(69.1%、66.8%、61.4%)隨著Gn用量的增加，均有逐漸下降的趨勢，且3組之間兩兩比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；3組間流產(chǎn)率、異位妊娠率及持續(xù)妊娠率比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(表4)。

表3 FET周期中基礎(chǔ)臨床數(shù)據(jù)的比較[(-±s)，n(%)]

注：與A組比較，*P<0.05

表4 FET周期中Gn用量與妊娠結(jié)局的單因素分析[(-±s)，%]

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05。著床率數(shù)據(jù)分布為非正態(tài)分布，采用Kruskal Wallis秩和檢驗方法分析

五、FET周期中Gn用量與妊娠結(jié)局的多因素logistic分析

因患者基線不齊，組間比較存在混雜因素，故進一步采用多因素logistic分析，調(diào)整表1、表2和表3中具有統(tǒng)計學(xué)差異的混雜因素[10，12-18]，結(jié)果顯示，著床率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率、異位妊娠率及持續(xù)妊娠率在不同的Gn使用量組別之間的統(tǒng)計學(xué)差異消失(P>0.05)(表5)。

六、極高Gn使用劑量組與常規(guī)Gn使用劑量組臨床結(jié)局分析

表5結(jié)果提示，3組間妊娠結(jié)局未見統(tǒng)計學(xué)差異，但是在單因素分析中，C組的著床率和臨床妊娠率下降，那么，更高Gn累積用量是否對FET的妊娠結(jié)局產(chǎn)生影響呢，故本研究進一步利用平滑曲線擬合[19]對Gn用量和妊娠結(jié)局進行多因素分析，結(jié)果顯示各項指標(biāo)均隨Gn用量變化而變化，而當(dāng)Gn用量極高時(≥60支)，妊娠結(jié)局發(fā)生顯著改變，故以Gn用量60支為截點，把臨床資料分為兩組，常規(guī)組(n=1 828)：Gn使用量<60支；極高組(n=95)：Gn使用量≥60支。結(jié)果顯示，極高組著床率和臨床妊娠率(39%、50.5%)均低于常規(guī)組(52%、66.3%)，采用單因素和多因素logistic分析，均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)(表6、7)。

表5 FET周期中Gn用量與妊娠結(jié)局的多因素logistic分析

表6 Gn累積使用量常規(guī)組和極高組著床率比較(-±s)

注：與常規(guī)組比較，*P<0.05

表7 Gn累積使用量常規(guī)組和極高組臨床妊娠率比較[n(%)]

注：與常規(guī)組比較，*P<0.05

討 論

本研究中，共納入1 923個FET周期，既往促排卵過程中，在不同劑量Gn使用組之間，高劑量組患者具有較高的年齡、BMI、基礎(chǔ)FSH，較長的不孕年限，且促排卵天數(shù)增加，獲卵數(shù)減少(表1、2)。主要原因可能與年齡、基礎(chǔ)FSH和卵泡數(shù)與患者的卵巢儲備功能相關(guān)[22]，進一步影響了促排卵方案的選擇以及Gn使用量[23]。因此，單因素分析結(jié)果顯示，高劑量組的著床率和臨床妊娠率降低(P<0.05)，調(diào)整混雜因素后，Gn累積使用量的高低與FET周期的臨床結(jié)局無相關(guān)性(P>0.05)。本研究結(jié)果與Munch 等[2]研究結(jié)果相同。另外，本研究排除了差等質(zhì)量胚胎，避免胚胎凍融過程產(chǎn)生的冰晶損傷(胚胎質(zhì)量越差，冰晶損傷越大[24])，減少了胚胎質(zhì)量對結(jié)局的干擾因素，提高了數(shù)據(jù)分析的可靠性。

在臨床工作中Gn累積用量可以無限放大嗎，是否存在閾值效應(yīng)，目前尚未見相關(guān)報道。本研究進一步采用平滑曲線擬合對Gn用量和妊娠結(jié)局進行分析，結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Gn用量大于60支的時，曲線出現(xiàn)了拐點。根據(jù)平滑曲線的拐點將臨床資料分為常規(guī)組和極高組，通過單因素和多因素logistic分析，結(jié)果提示極高組的著床率和臨床妊娠率(39%，50.5%)與常規(guī)組相比(52%，66.3%)下降，且具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。同時，考慮到年齡，基礎(chǔ)卵巢功能等混雜因素，進行多因素logistic回歸分析，發(fā)現(xiàn)著床率[β=-0.12，95%CI(-0.24，-0.01)]和臨床妊娠[OR=0.52，95%CI(0.30，0.91)]發(fā)生率隨Gn用量的增加而下降，提示臨床工作中要對這部分患者人群高度重視。其原因可能是：(1)在常規(guī)組(卵巢功能正常)，Gn累積使用量不影響胚胎的染色體非整倍性率[25]，但在極高組，高劑量外源Gn的使用，可能增加染色體非整倍性率風(fēng)險(Gn累計用量每增加1 000 U，染色體非整倍性率風(fēng)險增加16.4%[25])；(2)高劑量外源性促性腺激素的使用可能影響卵母細(xì)胞成熟和減數(shù)分裂過程[26]，干擾卵泡的自然生長發(fā)育，從而介導(dǎo)染色體非整倍體和嵌合體的發(fā)生；(3)在促排卵過程中，多個卵泡同時發(fā)育，體內(nèi)雌激素逐漸上升，與卵裂球的多核現(xiàn)象相關(guān)[27]。因此，極高劑量的Gn使用量，可能通過上述機制影響卵母細(xì)胞質(zhì)量以及胚胎非整倍性率，進一步降低FET周期的臨床結(jié)局。然而，本研究為回顧性研究，具有一定的局限性并且結(jié)局指標(biāo)只關(guān)注了著床率和臨床妊娠率，我們需要進一步的隨訪，對后期的活產(chǎn)率及妊娠并發(fā)癥發(fā)生率方面做進一步研究。

綜上所述，促排卵過程中極高劑量Gn(≥4 500 U)的使用，可能導(dǎo)致卵母細(xì)胞或胚胎的染色體異常，降低后期FET周期的胚胎著床率和臨床妊娠率，因此，在新鮮周期促排過程中應(yīng)控制Gn用量在60支之內(nèi)(<4 500 U)，以改善后續(xù)FET周期的妊娠結(jié)局。