吳丹,張曼青,殷小平,周君,陳志穎,鮑兵
(1江漢大學(xué)附屬醫(yī)院 武漢市第六醫(yī)院,武漢 430015;2九江學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院;3九江學(xué)院附屬醫(yī)院;4上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院)
腦出血(ICH)是指原發(fā)性非外傷性腦實(shí)質(zhì)出血,臨床表現(xiàn)為頭痛、癲癇及神經(jīng)功能缺損,有較高的發(fā)病率和致死率[1,2]。ICH后繼發(fā)的腦組織損傷是影響患者預(yù)后、轉(zhuǎn)歸的關(guān)鍵因素[3],而炎癥因子及自由基的瀑布式產(chǎn)生對(duì)ICH后繼發(fā)性腦損傷起決定性作用[4,5]?,F(xiàn)有的治療不能很好地控制ICH后繼發(fā)性腦損傷的發(fā)展。研究[6]發(fā)現(xiàn),血紅素加氧酶-1(HO-1)在中樞神經(jīng)細(xì)胞(神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞)中廣泛表達(dá),是核轉(zhuǎn)錄因子2(Nrf2)-抗氧化反應(yīng)元件(ARE)信號(hào)通路下游的重要抗氧化及解毒蛋白,對(duì)ICH后繼發(fā)性腦損傷具有抗炎癥反應(yīng)、減輕氧化應(yīng)激損傷、抑制細(xì)胞凋亡等神經(jīng)保護(hù)作用。本研究運(yùn)用HO-1的選擇性抑制劑鋅原卟啉-9(ZPP-Ⅸ)抑制HO-1表達(dá),觀察用藥后Nrf2-ARE通路上下游蛋白Nrf2、NF-κB、TNF-α等表達(dá)的變化及神經(jīng)功能評(píng)分差異,探討HO-1對(duì)ICH灶周神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制,為ICH后繼發(fā)性腦損傷治療提供新的實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 95只普通級(jí)雄性SD大鼠,購(gòu)買于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[證書編號(hào):SDXK(湘)2009-0004],質(zhì)量250~300 g。按隨機(jī)雙盲原則分成ZPP-Ⅸ組(30只)、ICH組(30只)、DMSO組(30只)、正常組(5只)。
1.2 主要試劑 ZPP-Ⅸ(50 mg ZPP-Ⅸ溶于35%DMSO,終濃度10 mg/mL,給藥劑量10 mg/kg);DMSO一抗:Anti-Nrf2兔來(lái)源多克隆抗體,Anti-HO-1兔來(lái)源多克隆抗體,NF-κB兔來(lái)源單克隆抗體,TNF-α兔來(lái)源單克隆抗體,Anti-CD-11b兔來(lái)源多克隆抗體,β-actin兔抗大鼠單克隆抗體(70-Mab1445);二抗:羊抗小鼠多克隆抗體帶Cy3熒光素,羊抗兔多克隆抗體帶FITC熒光素;Odyessy二抗(1∶15 000);SDS-PAGE凝膠配制試劑盒;DAPI染色試劑;硝酸纖維素膜(NC膜,0.45 μm);BCA試劑盒;蛋白酶抑制劑cocktail;上樣緩沖液。
1.3 ICH模型制備及ZPP-Ⅸ給予方法 參照文獻(xiàn)[7]的方法將ZPP-Ⅸ組、ICH組、DMSO組大鼠于腦立體定位儀上緩慢注射自體股動(dòng)脈血50 μL至基底節(jié)區(qū),制備ICH模型;正常組大鼠于相同部位打孔進(jìn)針,不注血。參照Gareia18分測(cè)評(píng)法[8],將神經(jīng)功能缺陷評(píng)分≥3分及腦切片中有明顯的圓形、橢圓形或不規(guī)則的血腫存在定義為模型制備成功標(biāo)準(zhǔn);血液沿針道反流、流入腦室或死亡者均剔除,剔除后補(bǔ)充相當(dāng)數(shù)量并制模成功的大鼠。ZPP-Ⅸ組在制模后30 min內(nèi)腹腔注射10 mg/kg ZPP-Ⅸ[9],DMSO組給予10 mg/kg的35%DMSO,正常組、ICH組均給予等量生理鹽水。
1.4 大鼠神經(jīng)功能評(píng)價(jià) 采用Gareia18分測(cè)評(píng)法評(píng)價(jià)制模前24 h及制模后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d大鼠神經(jīng)功能,共分為6項(xiàng),即自發(fā)活動(dòng)、輕癱試驗(yàn)、前肢運(yùn)動(dòng)、加強(qiáng)運(yùn)動(dòng)功能、痛覺(jué)、深感覺(jué),神經(jīng)功能缺損最嚴(yán)重計(jì)0分,無(wú)神經(jīng)功能缺損計(jì)18分。
1.5 大鼠腦組織Nrf2、binding-Nrf2、HO-1、NF-κB、TNF-α蛋白檢測(cè) 取各組大鼠,于制模后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d麻醉開胸,迅速暴露心臟,從左心室插管至主動(dòng)脈根部,在右心耳剪開一小口做出口,4 ℃生理鹽水200 mL灌注后至流出液體清亮,換4%多聚甲醛灌注固定至老鼠肢體僵硬;斷頭取腦,腦組織迅速放入液氮(-80 ℃)中速凍,最后用錫紙包好保存于-80 ℃冰箱中備用。將大腦從-80 ℃冰箱中取出,迅速取血腫灶周3 mm腦組織,采用Western blotting法檢測(cè)Nrf2、binding-Nrf2、HO-1、NF-κB、TNF-α蛋白。最后紅外線雙色激光成像分析機(jī)掃描NC膜后得到的圖像,用Odyessy Version3.0軟件分析,計(jì)算目的蛋白與β-actin灰度值比值。
1.6 大鼠腦組織Nrf2、HO-1、NF-κB、TNF-α mRNA檢測(cè) 大鼠處死以及標(biāo)本獲取方法同“1.5”,采用RT-PCR法檢測(cè)制模后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d腦組織Nrf2、HO-1、NF-κB、TNF-α mRNA。
1.7 大鼠腦組織Nrf2、HO-1、NF-κB、TNF-α與小膠質(zhì)細(xì)胞(CD11b標(biāo)記)共染陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù) 大鼠處死以及標(biāo)本獲取方法同“1.5”,大鼠大腦從-80 ℃冰箱取出,在預(yù)冷的多聚甲醛中固定20~30 min,再行切片(5 μm),然后采用免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)Nrf2、HO-1、NF-κB、TNF-α蛋白與小膠質(zhì)細(xì)胞共表達(dá)情況。Optpro成像分析系統(tǒng)掃描、圖像分析。取ICH灶周范圍內(nèi)觀察在200倍視野下計(jì)數(shù)5個(gè)不重復(fù)視野,得出5個(gè)視野的平均數(shù)。
2.1 各組不同時(shí)點(diǎn)神經(jīng)功能評(píng)分比較 結(jié)果見表1。
表1 各組不同時(shí)點(diǎn)神經(jīng)功能評(píng)分比較(分,
注:與正常組比較,*P<0.05;與ICH組比較,△P<0.05;與DMSO組比較,▲P<0.05。
2.2 各組制模后不同時(shí)點(diǎn)binding-Nrf2、Nrf2、HO-1、NF-κB、TNF-α蛋白表達(dá)比較 結(jié)果見表2。
表2 各組制模后不同時(shí)點(diǎn)binding-Nrf2、Nrf2、HO-1、NF-κB、TNF-α蛋白灰度值比較
注:與正常組比較,*P<0.05;與ICH組比較,△P<0.05;與ZPP-Ⅸ組比較,▲P<0.05。
2.3 各組制模后不同時(shí)點(diǎn)Nrf2、HO-1、NF-κB、TNF-α mRNA表達(dá)比較 結(jié)果見見表3。
表3 各組制模后不同時(shí)點(diǎn)Nrf2、HO-1、NF-κB、TNF-α mRNA表達(dá)比較(灰度值,
注:與正常組比較,*P<0.05;與ICH組比較,△P<0.05。
2.4 各組制模后不同時(shí)點(diǎn)Nrf2、HO-1、NF-κB、TNF-α蛋白與CD11b共染陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較 結(jié)果見表4。
表4 各組制模后不同時(shí)點(diǎn)Nrf2、HO-1、NF-κB、TNF-α蛋白與CD11b共染陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較(個(gè),
注:與ZPP-Ⅸ組比較,△P<0.05。
ICH后眾多因素參與了繼發(fā)性腦損傷的形成,其中灶周炎癥反應(yīng)與炎癥因子的釋放被認(rèn)為是造成繼發(fā)性腦損傷的主要原因。Nrf2-ARE信號(hào)通路是內(nèi)生的重要的抗氧化、抗炎癥反應(yīng)的通路[10],HO-1是其下游重要的抗氧化蛋白,調(diào)控其表達(dá)是否會(huì)影響其上游的激活,目前暫沒(méi)有研究報(bào)道。ZPP-Ⅸ作為HO-1選擇性抑制劑,被廣泛用于Nrf2-ARE-HO-1信號(hào)通路的離體、在體研究[11,12]。
本課題小組前期及既往研究[10,13]發(fā)現(xiàn),Nrf2的激活劑萊菔硫烷可抑制炎癥反應(yīng),減輕神經(jīng)功能損傷,提高下游抗氧化蛋白(如HO-1、NQO-1等)的表達(dá),減輕ICH灶周水腫,提高神經(jīng)保護(hù)作用。在體研究[11]發(fā)現(xiàn)ICH后HO-1表達(dá)上調(diào)的時(shí)間點(diǎn)與Nrf2激活的時(shí)間點(diǎn)具有高度一致性,進(jìn)一步說(shuō)明HO-1是Nrf2下游的一重要蛋白[14]?;仡櫻芯拷Y(jié)果[6,15,16],HO-1對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)眾多疾病均具有保護(hù)作用。而其在ICH中的作用存在廣泛爭(zhēng)議。表現(xiàn)出的作用與其表達(dá)的部位及作用的時(shí)間點(diǎn)有關(guān)。在神經(jīng)內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的HO-1具有較明確的神經(jīng)保護(hù)作用,而在膠質(zhì)細(xì)胞中的HO-1可能具有神經(jīng)保護(hù)作用,但目前證據(jù)不足。且HO-1在ICH早期具有神經(jīng)保護(hù)作用,在晚期可能表現(xiàn)出神經(jīng)毒性作用,但并沒(méi)有確切地指出具體時(shí)間點(diǎn)。本研究與研究[17~20]大體方向一致,但更確切地闡述了一些關(guān)鍵問(wèn)題。
本研究顯示,與正常組比較,ICH組、ZPP-Ⅸ組、DMSO組制模后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d神經(jīng)功能評(píng)分減少,證明DMSO作為ZPP-Ⅸ溶劑不會(huì)加重ICH后神經(jīng)功能障礙;與ICH組比較,ZPP-Ⅸ組12 h、24 h、48 h、72 h、7 d的神經(jīng)功能評(píng)分減少,說(shuō)明ZPP-Ⅸ具有神經(jīng)毒性作用,可加重ICH后神經(jīng)功能障礙。本研究還顯示,與正常組比較,ICH組、DMSO組、ZPP-Ⅸ組各時(shí)間點(diǎn)HO-1、Nrf2、NF-κB、TNF-α蛋白表達(dá)均增加,binding-Nrf2蛋白水平減少,證實(shí)ICH后一方面啟動(dòng)抗炎性、抗氧自由基通路的活化,即通過(guò)促進(jìn)Nrf2入核,另一方面也啟動(dòng)了炎癥反應(yīng)的級(jí)聯(lián)放大;與ICH組比較,ZPP-Ⅸ組12 h、24 h、48 h、72 h及7 d HO-1蛋白表達(dá)減少,binding-Nrf2、NF-κB、TNF-α表達(dá)增加,提示ZPP-Ⅸ對(duì)ICH大鼠Nrf2-ARE信號(hào)通路有抑制作用,可能是通過(guò)抑制HO-1的表達(dá)實(shí)現(xiàn)。本文從mRNA表達(dá)水平分析得出的結(jié)果基本與蛋白的結(jié)果基本一致,個(gè)別時(shí)間點(diǎn)有細(xì)微差異。本文研究還發(fā)現(xiàn),與ZPP-Ⅸ組比較,ICH組制模6 h 、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d的HO-1與CD11b共表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞增加,ICH組制模12 h 、24 h、48 h、72 h、7 d的Nrf2與CD11b共表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞增加。說(shuō)明HO-1可促進(jìn)Nrf2通路的激活,雖然可一定程度促進(jìn)下游炎癥因子NF-κB、TNF-α的表達(dá),但Nrf2通路及小膠質(zhì)細(xì)胞激活后可以顯著抑制下游炎癥因子表達(dá)從而起到神經(jīng)保護(hù)作用。
總之,ZPP-Ⅸ可能是通過(guò)抑制HO-1的表達(dá),從而抑制Nrf2的解離、入核及增加下游NF-κB、TNF-α的表達(dá),來(lái)加劇ICH大鼠神經(jīng)功能損傷的作用。