基于指紋圖譜評(píng)價(jià)葛根芩連湯中藥物的成分分析研究

李 紅 田 潔 李 妍 王 艷 張 穎

(河北省唐山市中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部,唐山,063000)

葛根芩連湯是出自張仲景的代表作《傷寒論》中的表里雙解的代表方,該方全方共4味藥物,分別為葛根、黃連、黃芩、甘草;《傷寒論》中原文描述“太陽(yáng)病,桂枝證,醫(yī)反下之,利述不止,脈促者,表未解也,喘而汗出者,葛根黃連黃芩湯主之”。說(shuō)明患者表證未除,邪陷入里,腸熱下利,而葛根芩連湯治之以解表清里、升清止利[1]。葛根芩連湯現(xiàn)代應(yīng)用主要為熱性傳染病、以腹瀉為主訴的疾病等[2-3],而在現(xiàn)代藥物分析中有關(guān)該方物質(zhì)基礎(chǔ)和質(zhì)量控制等方面的研究報(bào)道質(zhì)量參差不齊,目前中藥分析多采用中藥指紋圖譜這一研究手段,對(duì)中藥(復(fù)方)成分進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)體系分析;然目前的多數(shù)研究大多數(shù)以個(gè)別幾個(gè)成分入手進(jìn)行研究[4],因此所獲得的指紋圖譜僅有色譜峰的圖譜信息,或特征性色譜峰與復(fù)方藥物成分的相關(guān)性信息研究有限[5]?；诖?本課題組從整體角度采用HPLC指紋圖譜的方法分析葛根芩連湯10種以上多種藥物成分的深入研究,為葛根芩連湯中含有的藥物成分等物質(zhì)基礎(chǔ)、藥理相關(guān)性研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 購(gòu)于安捷倫科技(中國(guó))有限公司的HPLC(高效液相色譜儀,型號(hào):Agilent-1100)和DAD(二極管陣列檢測(cè)器,型號(hào):G1315DAD)。

1.2 試劑 購(gòu)于上海展云化工有限公司色譜HPLC乙腈和色譜HPLC甲醇;中國(guó)食品藥品檢定研究院提供的超純水和葛根素對(duì)照品(110752-200410)、大豆苷對(duì)照品(111738-200501)、大豆苷元對(duì)照品(486-66-8)、黃芩苷對(duì)照品(110715-200514)、漢黃芩苷對(duì)照品(51059-44-0)、黃芩素對(duì)照品(111514-200403)、漢黃芩素對(duì)照品(111514-200403)、小檗堿對(duì)照品(110713 200208)、鹽酸巴馬汀對(duì)照品(0732 200005)、鹽酸藥根堿對(duì)照品(0733 200005)、甘草酸銨對(duì)照品(110731-200614)、甘草次酸對(duì)照品(110723-200612)、甘草苷對(duì)照品(111610-200604)、染料木素對(duì)照品(111704-200501)。

1.3 分析樣品 葛根芩連湯:葛根、黃連、黃芩、甘草。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 HPLC指紋圖譜試驗(yàn)進(jìn)樣量為20 μL,色譜柱選擇直徑5 μm的Ultimate AQ C18柱(青島君道生物技術(shù)有限公司),柱溫30 ℃,流動(dòng)相A是0.02 mol/L醋酸銨+0.3%三乙胺+1%冰醋酸混合而成,最終PH值為4.3;流動(dòng)相B是乙腈,流速統(tǒng)一為0.7 mL/min,具體洗脫程序見(jiàn)表1。檢測(cè)波長(zhǎng)通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)不斷調(diào)整,最終葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木素、甘草酸銨和甘草次酸的檢查波長(zhǎng)為250 nm;黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素和甘草苷檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm;余下對(duì)照品檢測(cè)波長(zhǎng)為346 nm。本研究中HPLC方法考察和指紋圖譜等均采用此色譜條件。

表1 梯度洗脫表

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱量各個(gè)對(duì)照品,分別加入60%的甲醇制作對(duì)照品溶液,將1.029 g/L葛根素對(duì)照品、0.201 g/L大豆苷對(duì)照品、0.049 g/L大豆苷元對(duì)照品、0.384 g/L黃芩苷對(duì)照品、0.062 g/L漢黃芩苷對(duì)照品、0.106 g/L黃芩素對(duì)照品、0.036 g/L漢黃芩素對(duì)照品、0.059 g/L小檗堿對(duì)照品、0.043 g/L鹽酸巴馬汀對(duì)照品、0.060 g/L鹽酸藥根堿對(duì)照品、0.392 g/L甘草酸銨對(duì)照品、0.038 g/L甘草次酸對(duì)照品、0.303 g/L甘草苷對(duì)照品和0.0132染料木素對(duì)照品等不同質(zhì)量濃度的單一對(duì)照品混合均勻,過(guò)濾得混合對(duì)照品溶液。

2.3供試品溶液的制備:葛根芩連湯的藥物飲片分析樣品為葛根30 g、黃芩20 g、炙甘草6 g、黃連6 g,均由河北伊康藥業(yè)有限公司提供。單一藥物的供試品溶液均分別以400 mL水浸泡20 min后煎煮30 min,以0.45 μm過(guò)濾膜過(guò)濾后獲得葛根、黃芩、黃連、甘草供試品溶液;葛根芩連湯的供試品溶液,同上法浸泡藥物,葛根先煎20 min后納入余下幾味藥物繼續(xù)煎30 min,以0.45 μm過(guò)濾膜過(guò)濾后獲得葛根芩連湯供試品溶液。

2.4 專屬性試驗(yàn) 通過(guò)專屬性試驗(yàn)檢測(cè)葛根芩連湯各味藥物的專屬性,相互間是否存在干擾因素,結(jié)果顯示在相對(duì)保留時(shí)間內(nèi)各個(gè)峰之間不存在雜質(zhì)峰,專屬性良好。

2.5 線性關(guān)系考察 精密量取混合對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.6 mL,分別置2 mL量瓶中,加60%甲醇稀釋至刻度,搖勻后制得不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液,采用HPLC色譜法,記錄峰面積;以對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X,峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果顯示14個(gè)對(duì)照品線性關(guān)系均良好。

2.6 中間精密度試驗(yàn) 精密稱取同一葛根芩連湯供試品溶液,連續(xù)進(jìn)樣6次,結(jié)果顯示共有峰的平均相對(duì)峰面積RSD為0.38%,表面高效液相色譜儀的精密度良好。

2.7 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 將葛根芩連湯室溫放置0、2、4、12、24 h分別常規(guī)進(jìn)樣測(cè)定HPLC色譜圖,結(jié)果顯示平均相對(duì)峰面積RSD為1.03%,表明葛根芩連湯供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 以同一批藥材,根據(jù)2.2配制6份葛根芩連湯供試品溶液,常規(guī)進(jìn)樣測(cè)定HPLC色譜圖,結(jié)果顯示平均相對(duì)峰面積RSD為1.14%,表明供試品溶液提取方法具有良好重復(fù)性,且高效液相色譜儀重復(fù)性良好。

2.9 回收率試驗(yàn) 精密稱取6份已知含量的同一批葛根芩連湯樣品各約4.75 g,分別精密加入10 mL混合對(duì)照品甲醇溶液,采用加樣回收法測(cè)定,計(jì)算結(jié)果顯示平均回收率的范圍是96.45%～104.69%,RSD的范圍是為0.65%～2.11%,表明HPLC方法的準(zhǔn)確度良好。見(jiàn)表2。

2.10 樣品測(cè)定結(jié)果

2.10.1 混合對(duì)照品溶液的指紋圖譜 本研究根據(jù)不同的檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm、280 nm和346 nm,將混合對(duì)照品指紋圖譜分為3張圖,便于后續(xù)分析,同時(shí)標(biāo)注14個(gè)對(duì)照品成分的峰號(hào)。見(jiàn)圖1。

圖1 混合對(duì)照品溶液的指紋圖譜

注:1葛根素,2大豆苷,3甘草苷,4黃芩苷,5鹽酸藥根堿,6漢黃芩苷,7大豆苷元,8鹽酸巴馬汀,9小檗堿,10甘草酸胺,11黃芩素,12漢黃芩素,13染料木苷,14甘草次酸

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.10.2 單一藥物供試品溶液的指紋圖譜 在檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm時(shí),葛根指紋圖譜有11個(gè)特征峰,而甘草有2個(gè)特征峰;在檢測(cè)波長(zhǎng)280時(shí),黃芩有6個(gè)特征峰,而在檢測(cè)波長(zhǎng)346 nm時(shí),黃連有4個(gè)特征峰。見(jiàn)圖2。

圖2 葛根、黃芩、黃連、甘草單一藥物的指紋圖譜

2.10.3 葛根芩連湯藥物成分分析 在葛根芩連湯的指紋圖譜中顯示波長(zhǎng)250 nm時(shí)有12個(gè)特征峰,其中1～11主要體現(xiàn)葛根的藥物成分特征,而12主要體現(xiàn)甘草的藥物成分特征;波長(zhǎng)280 nm時(shí)有7個(gè)特征峰,主要體現(xiàn)甘草和黃芩的藥物成分特征;波長(zhǎng)346 nm時(shí)有4個(gè)特征峰,主要體現(xiàn)黃連的藥物成分特征,在與混合對(duì)照品指紋圖譜比較分析后,由圖3及其注解中可見(jiàn)葛根芩連湯指紋圖譜各個(gè)峰號(hào)對(duì)應(yīng)的藥物成分,我們發(fā)現(xiàn)葛根芩連湯未檢測(cè)出甘草次酸和染料木苷成分色譜峰。

圖3 葛根芩連湯不同檢測(cè)波長(zhǎng)的指紋圖譜

注:3.葛根素,5大豆苷,11大豆苷元,12甘草酸胺,13甘草苷,15黃芩苷,17漢黃芩苷,18黃芩素,19漢黃芩素,20鹽酸藥根堿,22鹽酸巴馬汀,23小檗堿

3 討論

3.1 指紋圖譜的建立 中藥指紋圖譜研究目前多采用HPLC的研究手段,以作為一種多指標(biāo)的質(zhì)量控制模式,通過(guò)指紋圖譜結(jié)合多成分分析,相對(duì)全面體現(xiàn)復(fù)方中所含化學(xué)成分,這一中藥指紋圖譜研究已成為廣泛被國(guó)內(nèi)外研究人員認(rèn)可的中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)模式[6-7]。本研究在3個(gè)不同波長(zhǎng)里(250、280、346 nm)考察了葛根芩連湯供試品溶液、葛根芩連湯單一藥物供試品溶液和14種混合對(duì)照品溶液,因?yàn)楦鸶诉B湯中的藥物成分較多較復(fù)雜,若只選擇一個(gè)波長(zhǎng)來(lái)檢測(cè),可能或漏掉很大一部分的藥物成分,而對(duì)結(jié)果造成一定的誤差,因此本研究選擇3個(gè)不同波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè),并為了方便不同波長(zhǎng)間指紋圖譜的比較分析,在結(jié)果呈現(xiàn)時(shí)將指紋圖譜根據(jù)波長(zhǎng)切成3張圖片。葛根芩連湯供試品溶液指紋圖譜經(jīng)多點(diǎn)校正法標(biāo)定了23個(gè)共有峰,通過(guò)比較混合對(duì)照品指紋圖譜、單味藥材指紋圖譜和葛根芩連湯供試品指紋圖譜出峰位置,23個(gè)共有峰得到歸屬,12個(gè)共有峰確定了化學(xué)成分,其中染料木苷和甘草次酸未檢測(cè)出來(lái),可能與這2個(gè)藥物成分的含量比較低有關(guān),需要后續(xù)進(jìn)一步研究探討。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明,葛根芩連湯提取方法穩(wěn)定且藥物成分較多。

3.2 指標(biāo)成分的選擇 中藥復(fù)方藥效的發(fā)揮與其中的化學(xué)成分密不可分,而其中具體的化學(xué)成分,以及各藥物成分間含量的高低、藥物成分的穩(wěn)定性等都與藥效的強(qiáng)弱有至關(guān)重要的關(guān)系[8-11]。通過(guò)與多指標(biāo)成分定量相結(jié)合,中藥指紋圖譜能夠相對(duì)全面且有效的控制中藥質(zhì)量,這一研究通經(jīng)被大量研究運(yùn)用。大量文獻(xiàn)報(bào)道顯示[12-13],葛根中的葛根素、大豆苷、大豆苷元是被普遍認(rèn)可的植物類雌激素,葛根素具有抗炎和改善血液流變等作用;大豆苷、大豆苷元具有鎮(zhèn)痛、松弛肌肉等作用緩解腹瀉引起的腹痛。黃芩中的黃芩苷和漢黃芩苷具有抗炎活性,黃芩素和漢黃芩素可增加血流,改善血液循環(huán)。黃連中的鹽酸藥根堿、小檗堿和鹽酸巴馬汀具有抗氧化、抗炎活性。甘草中的甘草苷、甘草酸銨具有抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)等作用。本研究所選取的14個(gè)成分,均與腹瀉為主的疾病的發(fā)病環(huán)節(jié)有著密切的關(guān)系,從有效成分角度將其作為質(zhì)量控制的指標(biāo)成分,對(duì)葛根芩連湯的內(nèi)在質(zhì)量作出了更為科學(xué)的評(píng)價(jià)。