高效液相色譜法研究小青龍顆粒的組方特點(diǎn)

邵 瓊 張 瑩 王艷梅 嚴(yán)敢意

(1 湖北省鄂州市中心醫(yī)院中草藥房,鄂州,436000; 2 湖北省鄂州市中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科,鄂州,436000)

小青龍顆粒是由出自《傷寒論》的經(jīng)典方小青龍湯制成顆粒劑而來,近年來顆粒劑逐漸在各大醫(yī)院流行,以滿足想服用中藥而沒時(shí)間煎藥的患者。小青龍顆粒的藥物組成和原方小青龍湯一樣,由麻黃、芍藥、桂枝、炙甘草、細(xì)辛、半夏、生姜和五味子組成,主要用于治療太陽傷寒兼里停水飲證,原文中記載“傷寒表不解,心下有水氣,干嘔,發(fā)熱而咳,或渴,或利,或噎,或小便不利、少腹?jié)M,或喘者,小青龍湯主之”,而現(xiàn)代研究中發(fā)現(xiàn)小青龍湯/小青龍顆粒對(duì)具有改善肺通氣功能,緩解氣道平滑肌的痙攣而降低其高反應(yīng)作用,對(duì)支氣管哮喘急性發(fā)作期[1-2]、急慢性支氣管炎發(fā)作期[3-5]和慢性阻塞性肺疾病發(fā)作期[6]等有顯著療效。小青龍湯的組方配伍特點(diǎn)可以看出,麻黃、桂枝均為性溫之藥,溫能走表,溫能散寒,除外感之風(fēng)寒;干姜、半夏、五味子也均屬于性溫之藥,然其溫能走里,化里之寒邪,其中干姜溫中回陽以固本,溫肺化飲以祛肺寒之邪;半夏性溫而化寒痰,使邪出有道而不滯于內(nèi);細(xì)辛性溫而入表里;全方以溫藥為主配以炙甘草調(diào)和諸藥[7-8]。而小青龍顆粒經(jīng)過制備后是否具有良好的中藥質(zhì)量水平,其質(zhì)量水平是否能通過小青龍顆粒的組方特點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè),基于上述疑問展開本課題研究,在中藥單味藥物及復(fù)方研究中高效液相色譜是目前比較公認(rèn)的研究手段,本研究結(jié)果顯示,可通過高效液相色譜檢測(cè)方法對(duì)單位藥物指紋圖譜的分析預(yù)測(cè)小青龍顆粒制劑質(zhì)量水平的組方特點(diǎn)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 購買于Agilent科技有限公司的高效液相色譜儀(Agilent 100,應(yīng)用ChenmStation工作站),購買于北京賽多利斯天平有限公司的0.1 mg分析天平(型號(hào):Sarturius BS110S)。

1.2 試劑 甲醇(色譜純)、無水乙醇(色譜純)、乙腈(色譜純)、磷酸(色譜純)和去離子水均購于天津市康科德技術(shù)有限公司。

1.3 分析樣品 22個(gè)不同批次小青龍顆粒(四川泰樂制藥有限公司,國藥準(zhǔn)字Z10983085);麻黃、芍藥、桂枝、甘草均本院藥房提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 進(jìn)樣量為2 μL,研究中選用250 mm×4.6 mm的C18色譜柱(型號(hào):Arcus EP),柱溫為35 ℃,而流動(dòng)相A為0.1%磷酸水+0.02%庚烷磺酸鈉;流動(dòng)相B為82乙腈:10無水乙醇:8(水+0.24%磷酸),檢測(cè)波長為220 nm。

表1 梯度洗脫表(流速1.0 mL/min)

2.2 供試品溶液的制備

2.2.1小 青龍顆粒供試品溶液制備 小青龍顆粒適量加入25 mL甲醇,采用回流提取的方式提取小青龍顆粒1 h,取第1次過濾液,殘?jiān)欣^續(xù)加入等量甲醇提取30 min,取第2次過濾液,混合兩次過濾液并以甲醇定容50 mL,制取小青龍顆粒供試品溶液[9-10]。

2.2.2 4種組方藥材供試品溶液制備

2.2.2.1 組方量制備法 根據(jù)小青龍顆粒組方量(即配方中單味藥材的含量)配制法取麻黃(約1.5 g)、芍藥(1.5 g)、桂枝(1.5 g)、炙甘草(1.5 g)機(jī)械粉碎后,過篩于燒瓶中回流提取,同1.2.1的方法經(jīng)兩次過濾混合定容后,獲得組方量藥材供試品溶液。

2.2.2.2 單位質(zhì)量制備法 單位質(zhì)量即1 g,麻黃、芍藥、桂枝和炙甘草均分別精密稱取1 g,同2.2.2.1方法,機(jī)械粉碎和回流提取,獲得單位質(zhì)量藥材供試品溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn) 通過專屬性試驗(yàn)檢測(cè)小青龍顆粒各味藥物的專屬性,相互間是否存在干擾因素,結(jié)果顯示在相對(duì)保留時(shí)間內(nèi)各個(gè)峰之間不存在雜質(zhì)峰,具有良好的專屬性。

2.4 中間精密度試驗(yàn) 精密稱取同一小青龍顆粒供試品溶液,連續(xù)進(jìn)樣6次,結(jié)果顯示共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.08%,表明高效液相色譜儀具有良好的精密度。

2.5 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 將小青龍顆粒供試品溶液室溫放置0、2、4、12、24 h分別常規(guī)進(jìn)樣測(cè)定HPLC色譜圖,結(jié)果顯示共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.4%,表明小青龍顆粒供試品溶液在24 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 以同一批小青龍顆粒,根據(jù)1.2.1配制6份小青龍顆粒供試品溶液,常規(guī)進(jìn)樣測(cè)定HPLC色譜圖,結(jié)果顯示共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.3%,表明高效液相色譜儀具有良好的重復(fù)性。

2.7 回收率試驗(yàn) 精密稱取6份已知含量的同一批小青龍顆粒樣品各約6 g,分別精密加入10 mL混合對(duì)照品甲醇溶液,采用加樣回收法測(cè)定,計(jì)算結(jié)果顯示平均回收率的范圍是96.52%～104.73%,RSD的范圍是為0.67%～2.14%,表明高效液相色譜方法具有良好的準(zhǔn)確度。

2.8 樣品測(cè)定結(jié)果

2.8.1 小青龍顆粒指紋圖譜的建立 根據(jù)1.3色譜條件檢測(cè)22批小青龍顆粒供試品溶液,檢測(cè)波長為220 nm,以15號(hào)峰甘草苷作為參照峰,共有40個(gè)共有峰的出現(xiàn)率均達(dá)到100%。根據(jù)系統(tǒng)指紋定量評(píng)價(jià)法[11-12],以宏定性相似度(Sm)、宏定量相似度(Pm)和指紋均化性變動(dòng)誤差控制系數(shù)α三者相結(jié)合來評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量,22批小青龍顆粒供試品溶液經(jīng)系統(tǒng)指紋定量法鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中S13、S14、S19和S21等4個(gè)批次的小青龍顆粒質(zhì)量相對(duì)較次;因此由S1-S12和S15-S18及S20、S22共18批小青龍顆粒供試品溶液重新用“中藥色譜指紋圖譜定量相似度數(shù)字化評(píng)價(jià)體統(tǒng)3.0”分析生成對(duì)照指紋圖譜,記作RFP。具體詳細(xì)見圖1和表2、表3。

圖1 22批小青龍顆粒指紋圖譜(波長220 nm)

2.8.2 組方色譜 根據(jù)1.2.2.1配制的組方量藥材供試品溶液進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè),檢測(cè)波長220 m,將檢測(cè)所得的指紋圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜定量相似度數(shù)字化評(píng)價(jià)體統(tǒng)3.0”分析軟件中,設(shè)置0.1 min為時(shí)間漂移窗,根據(jù)全相加模式,將輸入某一范圍的時(shí)間域值,采用全相累加的方式將各單味藥色譜法累加,獲得組方指紋圖譜對(duì)應(yīng)的峰,從而形成組方指紋圖譜,記作CSF1;根據(jù)最大化模式,將將輸入某一范圍的時(shí)間域值,將各單味藥色譜峰取最大峰作為組方指紋圖譜,記作CSF2。組方藥物燒瓶化學(xué)混合記作CMF,組方藥物直接物理混合記作PMF。具體詳細(xì)見圖2。

2.8.3 單位質(zhì)量藥物色譜 根據(jù)1.2.2.2配制的單位質(zhì)量藥材供試品溶液進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè),檢測(cè)波長220 m,將檢測(cè)所得的指紋圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜定量相似度數(shù)字化評(píng)價(jià)體統(tǒng)3.0”分析軟件中,設(shè)置0.1 min為時(shí)間漂移窗,根據(jù)全相加模式,將輸入某一范圍的時(shí)間域值,采用全相累加的方式將各單味藥色譜法累加,獲得組方指紋圖譜對(duì)應(yīng)的峰,從而形成組方指紋圖譜,記作CSF3;根據(jù)最大化模式,將將輸入某一范圍的時(shí)間域值,將各單味藥色譜峰取最大峰作為組方指紋圖譜,記作CSF4。具體詳細(xì)見圖2。

圖2 4種組方融合預(yù)測(cè)模式的指紋圖譜

2.8.4 組方模式預(yù)測(cè)小青龍顆粒質(zhì)量結(jié)果 從表4可得,在組方模式預(yù)測(cè)小青龍顆粒質(zhì)量結(jié)果中可以看出,組方色譜中組方全相加模式比組方最大化模式質(zhì)量較低;單位質(zhì)量藥物色譜中全相加模式比最大化模式質(zhì)量等級(jí)低;而比較平均值1和平均值3發(fā)現(xiàn)組方色譜預(yù)測(cè)能力和單位質(zhì)量藥物色譜的預(yù)測(cè)能力相當(dāng),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),進(jìn)而從CMF和PMF的平均值2與RFP比較發(fā)現(xiàn),2組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),綜合研究結(jié)果顯示,可通過高效液相色譜檢測(cè)方法對(duì)單位藥物指紋圖譜的分析預(yù)測(cè)小青龍顆粒制劑質(zhì)量水平的組方特點(diǎn)。團(tuán)隊(duì)在此次小青龍顆粒組方特點(diǎn)的研究中未對(duì)半夏、生姜、細(xì)辛和五味子進(jìn)行分析,主要由于在此色譜條件及檢測(cè)波長下未檢測(cè)出這4味藥物的特征峰,因此未對(duì)這4味藥物進(jìn)行展開研究。

表2 22批小青龍顆粒系統(tǒng)指紋定量法評(píng)價(jià)質(zhì)量結(jié)果

表3 22批小青龍顆粒系統(tǒng)指紋定量法評(píng)價(jià)質(zhì)量結(jié)果

表4 組方模式預(yù)測(cè)小青龍顆粒質(zhì)量結(jié)果

3 討論

3.1 麻黃-桂枝組方 麻黃與桂枝組方的作用會(huì)隨著組方的比例不同而不同,如《傷寒論》中麻黃湯,麻黃用藥比例比桂枝大,其作用即以發(fā)汗解表為主;而在桂枝去芍藥加麻黃細(xì)辛附子湯中,麻黃用藥比例比桂枝小,即呈現(xiàn)溫胃化飲之效;而在本研究中的小青龍湯組方中,麻黃與桂枝用藥比例相同,表里同治,即解表以治太陽傷寒證,又溫里以化寒飲郁肺證。高效液相色譜研究表明[13-14],在小青龍湯研究中,取單味桂枝水煎液、麻黃-桂枝多比例組方水煎液以及小青龍湯水煎液的供試品溶液計(jì)算香豆素、桂皮醇和桂皮醛的含量,研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著桂枝的比例增加,麻黃桂枝多比例組方水煎液中的5種麻黃生物堿的含量也隨之增加,而在桂枝單煎液中,5種麻黃生物堿的含量、香豆素、桂皮醇和桂皮醛的含量均出現(xiàn)不同程度的降低,此研究與《傷寒雜病論》中麻黃與桂枝的比例不同、作用不同這一理論遙相呼應(yīng)。

3.2 麻黃-甘草組方 麻黃-甘草組方在《傷寒論》及《金匱要略》各經(jīng)典方劑中出現(xiàn)的頻次最多,本研究中的小青龍湯僅是其中一個(gè)出現(xiàn)麻黃-甘草組方的經(jīng)典方。麻黃-甘草組方,以水煎法制備麻黃甘草組方供試品溶液的HPLC研究中發(fā)現(xiàn),隨著甘草配比量的增加5種麻黃類生物堿的含量出現(xiàn)不同程度地降低,研究中發(fā)現(xiàn)中當(dāng)4倍麻黃:1倍甘草時(shí),5種麻黃類生物堿的含量含量最高;當(dāng)2倍麻黃:1倍甘草時(shí),5種麻黃類生物堿的含量含量適中;當(dāng)1倍麻黃:1倍甘草時(shí),5種麻黃類生物堿的含量最低;這一研究結(jié)果與“甘草調(diào)和諸藥”的藥理相吻合。此時(shí)當(dāng)我們反觀麻黃-甘草組方后甘草苷、甘草酸的含量隨著配伍比例的改變情況,發(fā)現(xiàn)麻黃甘草水煎液中當(dāng)麻黃配伍的比例逐漸減少時(shí),甘草中的甘草苷、甘草酸的含量也逐漸降低。而本研究中的小青龍湯原方是1倍麻黃:1倍甘草,體現(xiàn)其解表而不傷氣的組方特點(diǎn)。

3.3 白芍-桂枝組方 《傷寒論》中桂枝、白芍組方多有調(diào)和營衛(wèi)、溫陽止汗之功。在指紋圖譜研究中當(dāng)桂枝、白芍組方的配比不同時(shí)指紋圖譜上出現(xiàn)的特征峰也會(huì)不同。白芍-桂枝組方主要的化學(xué)成分包括沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、肉桂酸、香豆素等隨著比例的不同而出現(xiàn)不同的峰高。研究發(fā)現(xiàn)[15]小青龍湯芍藥-桂枝組方配比為1∶1時(shí),肉桂酸和芍藥苷在指紋圖譜中的特征峰高比為7。

3.4 白芍-甘草組方 白芍-甘草組方有一個(gè)著名的緩急止痛代表方劑,即芍藥甘草湯,方中白芍與炙甘草配伍比例為1∶1,HPLC指紋圖譜研究芍藥甘草湯發(fā)現(xiàn),白芍中的芍藥苷和苯甲酰芍藥苷起到藥效作用,而甘草中的甘草苷和甘草酸含量最高[16]。小青龍湯中白芍與炙甘草組方配比同芍藥甘草湯,為1∶1,有研究表明0.6∶1、1∶1、3∶1等3個(gè)不同配比的白芍-炙甘草組方,以3∶1配比中的芍藥苷、甘草苷和甘草酸的溶出率最高,其次為1:1配比的白芍-炙甘草組方,0.6∶1配比的白芍-炙甘草組方最低[17]。