水蘇堿對四氯化碳致小鼠急性肝損傷的保護作用*

郭書凱 周艷麗 呂茂盛 吳曉凡 陳美華

(泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院， 山東 泰安 271016)

水蘇堿(Stachydrine)是中藥益母草的最主要活性成分之一，對心臟、腎臟、子宮、血管等多臟器具有明顯的藥理活性[1]。四氯化碳肝損傷是經(jīng)典的肝損傷模型[2-3]，四氯化碳(CCl4)是一種很強的親肝毒物，可導(dǎo)致肝細胞變性、壞死和肝臟纖維化，肝細胞凋亡和過氧化損傷機制是其肝毒性的重要機理。研究表明水蘇堿具有抗氧化、抗凋亡及抗炎等多種藥理作用[4-5]，本試驗通過四氯化碳誘導(dǎo)小鼠肝損傷，探討水蘇堿對肝損傷的保護作用，為中藥活性成分防治化學(xué)性肝損傷提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1動物

健康清潔昆明種小鼠50只，體質(zhì)量18～22 g，泰山醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。

1.2藥品與試劑

鹽酸水蘇堿(南京澤郎醫(yī)藥有限公司，純度98%)；四氯化碳(天津市天大化工實驗公司)；谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT) 、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST) 、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)均購自南京建成生物工程研究所。

1.3儀器

BP211D 型分析天平；Infinite M200 pro TECAN 多功能酶標(biāo)儀 (美國伯樂公司)； 3K30低溫離心機(美國Sigama公司)；RM2145石蠟切片機(德國LEICA公司)；Nikon ECLIPSE 80i共聚焦熒光顯微鏡。

1.4方法

1.4.1分組及模型制備 50只昆明小鼠隨機分為5組，分別分為正常組、模型組、水蘇堿高、中、低劑量組。水蘇堿高、中、低劑量組分別腹腔注射水蘇堿(20 mg/kg、10 mg/kg、5 mg/kg)，正常組和模型組腹腔注射生理鹽水，連續(xù)7天，末次給藥1 h后，模型組、水蘇堿高、中、低劑量組腹腔注射0.2%四氯化碳橄欖油溶液(20 mg/kg)，正常組腹腔注射等體積橄欖油。

1.4.2生化指標(biāo)檢測 小鼠造模后16 h摘眼球取血，離心(3000 r/min，10 min)，取上清液測定ALT及AST活性。取肝組織，冰浴勻漿后離心(3000 r/min，10 min),取上清液測定SOD活性及MDA含量，考馬斯亮藍測定肝臟蛋白質(zhì)濃度。

1.4.3肝組織形態(tài)學(xué)觀察 取肝組織，10%中性甲醛固定，常規(guī)梯度酒精脫水，石蠟包埋，切片，進行HE染色，觀察各組肝組織形態(tài)學(xué)變化。

2 結(jié) 果

2.1水蘇堿對小鼠血清ALT和AST活性的影響

模型組小鼠血清中ALT、AST活性較正常組均極顯著升高(P<0.01)；低劑量組與中劑量組小鼠血清中ALT、AST活性較模型組均顯著降低(P<0.05)；高劑量組小鼠血清中ALT、AST活性較模型組均極顯著降低(P<0.01)，表明水蘇堿能夠降低四氯化碳引起的小鼠血清中轉(zhuǎn)氨酶活性的升高，并呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系。

表1 水蘇堿對小鼠血清ALT、 AST活性的影響

注：與正常組比較，#表示P<0.05，##表示P<0.01；與模型組比較，*表示P<0.05，**表示P<0.01。

2.2水蘇堿對小鼠肝臟SOD活性、MDA含量的影響

模型組SOD活性較正常組極顯著降低，其MDA含量較正常組極顯著升高(P<0.01)；低劑量組SOD活性較模型組升高,其MDA含量較模型組降低(P<0.05)；中劑量組與高劑量組SOD活性較模型組均極顯著升高(P<0.01), MDA含量較模型組極顯著降低(P<0.01)，說明水蘇堿能夠升高小鼠肝臟SOD活性和降低MDA含量，呈劑量效應(yīng)關(guān)系。

表2 水蘇堿對小鼠肝臟SOD活性、 MDA含量的影響

注：與正常組比較，#表示P<0.05，##表示P<0.01；與模型組比較，*表示P<0.05，**表示P<0.01。

2.3心肌病理組織學(xué)觀察

正常組肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝細胞排列有序，肝細胞無水腫，未見病變區(qū)域；模型組肝組織大面積病變，肝細胞出現(xiàn)水腫，部分細胞膜破裂，伴少量炎細胞浸潤,水蘇堿各劑量組與模型組相比，肝細胞壞死、水腫和炎細胞浸潤程度上均有明顯改善，且程度隨劑量加大而減輕。

正常組

模型組

高劑量組

中劑量組

低劑量組圖1 各組小鼠肝臟HE染色×200

3 討 論

肝臟是最主要的藥物代謝器官，化學(xué)性肝損傷已成為繼病毒性肝損傷之后的第二大肝病誘因，目前臨床應(yīng)用的眾多化學(xué)藥品，可引起不同程度的肝損傷，因此，加強化學(xué)性肝臟損傷保護研究具有重要意義。小鼠急性肝損傷模型在形態(tài)學(xué)及病理學(xué)方面均與人類肝損傷極為相似，是經(jīng)典的篩選和研究肝炎治療藥物的病理模型[6]，CCl4在肝內(nèi)經(jīng)微粒體細胞色素P450代謝激活，生成三氯甲基氧自由基及氯自由基，氧化體系過度活化，導(dǎo)致氧化生物膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，改變細胞的流動性及通透性，破壞肝細胞結(jié)構(gòu)及功能，導(dǎo)致肝損傷發(fā)生，血清轉(zhuǎn)氨酶是肝細胞受到損傷的敏感指標(biāo)[7]，MDA與SOD可以作為脂質(zhì)過氧化反應(yīng)水平以及過氧化程度的指標(biāo)，轉(zhuǎn)氨酶(ALT、AST)的升高在一定程度上反映了肝細胞受到損傷的程度[8]。研究表明水蘇堿可減少大鼠急性心肌缺血再灌注損傷時丙二醛(MDA)含量，升高超氧化物歧化酶(SOD)活性，具有抗氧化作用[9]。水蘇堿通過上調(diào) Bcl-2 蛋白表達保護過氧化氫所致腎小管上皮細胞損傷，減少腎小管上皮細胞凋亡，具有抗凋亡作用[10]。本研究結(jié)果顯示，水蘇堿可顯著降低由肝損傷造成的ALT、AST活性的增高，提高SOD活力，降低MDA含量，減輕肝細胞水腫壞死，對于四氯化碳引起的肝損傷具有顯著的保護作用。

綜上所述，水蘇堿可以通過抗氧化作用對小鼠四氯化碳肝損傷產(chǎn)生良好的保護作用，其保肝作用的機制有待于進一步深入研究。