兩種抗凝劑保存富血小板血漿的效果研究

梁碧霞，黑飛龍，王 惠，周 純，吉冰洋，于 坤

體外循環(huán)中各種各樣的影響因素會導(dǎo)致血液的質(zhì)量在短期內(nèi)發(fā)生變異從而引起的機體凝血功能發(fā)生變化。其中，血小板的數(shù)量減少和功能損傷被認(rèn)為是體外循環(huán)后凝血功能障礙的重要原因［1－2］。近年來一些研究表明，轉(zhuǎn)機前先行提取富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP）可緩解這種不良后果［3］。常規(guī)的術(shù)中急性血小板分離技術(shù)一般是在肝素化前進(jìn)行，把患者的一部分血液引出體外，這對于血流動力學(xué)不穩(wěn)定的患者是具有一定風(fēng)險的，而且分離的時間長，分離達(dá)到有效治療量需40～60 min，會影響手術(shù)進(jìn)程［4］。

枸櫞酸鈉（sodium citrate，SC）是目前臨床上血小板分離保存期間最常用的抗凝劑，6 mg的枸櫞酸鈉才能抗凝l ml血液，故在分離PRP的過程中，枸櫞酸鹽的用量一般達(dá)到300 ml以上，容易引起低鈣血癥等中毒反應(yīng)［5］。肝素是體外循環(huán)手術(shù)中不可避免的最常用抗凝劑。除了心臟外科，多數(shù)的外科手術(shù)不會使用肝素抗凝，因此臨床上鮮見報道以肝素抗凝的PRP。然而，近年來一些研究表明在24 h內(nèi)，肝素比起枸櫞酸鹽更適合作為血小板保存的抗凝劑［6－7］。本研究擬在離體狀態(tài)下比較肝素與枸櫞酸鈉抗凝的PRP隨著時間延長的質(zhì)量變化，探索肝素抗凝的PRP在體外循環(huán)患者中應(yīng)用的可行性。

1 資料與方法

1．1 研究對象 2017年9月至2018年6月，選擇本院40例擬在體外循環(huán)下行心臟手術(shù)的成年患者作為研究對象。入選標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18～60歲；②術(shù)前血流動力學(xué)穩(wěn)定，美國麻醉醫(yī)師協(xié)會分級為Ⅰ～Ⅲ級；③術(shù)前血常規(guī)及凝血四項檢查結(jié)果在正常范圍，肝腎功能及血脂、血沉指標(biāo)均正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：①急診手術(shù)；②術(shù)前合并嚴(yán)重臟器功能不全患者；③兩周內(nèi)使用過抗凝劑、阿司匹林或其他非甾體類抗炎藥；④以往有血制品和相關(guān)藥物使用史。

1．2 研究方法 將40例患者在同一時間抽取的靜脈血各分為枸櫞酸抗凝（SC－PRP）組和肝素抗凝（H－PRP）組?；颊呷胧衣樽砗螅?jīng)頸內(nèi)靜脈置管，用含3．2%枸櫞酸鈉的1∶9抗凝真空管采血，每管各含2．7 ml血樣，混勻；同時再用含肝素鹽水（肝素12 500 U加入500 ml 0．9%氯化鈉注射液中制成，按1∶9抗凝比例采血樣）抗凝的注射器抽取全血，混勻后注入到塑料試管里。兩組標(biāo)本均以200 g離心力，先離心10 min，靜置后吸取全部上層血漿，移到另一個離心管，再以500 g的離心力，離心20 min，靜置后棄去上清層，吸取血漿下層，制成PRP，分別用離心管存儲。在取樣的即時（0 h），取樣后2 h、4 h、8 h、24 h這幾個時間點進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)的檢測。比較兩組PRP隨著時間延長后各項指標(biāo)的變化。

1．3 檢測指標(biāo) ①用XN全自動血液分析儀（Sys?mex公司，日本），檢測兩組PRP在不同時間的血小板計數(shù)（platelet count，PLT）、血小板體積分布寬度（platelet distribution width，PDW）、平均血小板體積（mean platelet volume，MPV）等參數(shù)。 ②用 pHOx Ultra全自動血氣分析儀檢測pH值、血糖、乳酸、滲透壓及電解質(zhì)等指標(biāo)。③用泰利康信公司的半自動血小板聚集儀LBY－NJ4，以光密度比濁法檢測兩組PRP 在二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）、花生四烯酸（arachidonic acid，AA）和腎上腺素（adrenaline，ADR）三種誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)下血小板的最大聚集率。④低滲休克試驗（hypotonic shock test，HSR）：用上述血小板聚集儀以光密度比濁法來檢測。血小板在低滲的溶液中會因為吸水而腫脹，使溶液的折光率降低，從而增加透光率。血小板體積恢復(fù)階段，折光率增高，透光率降低。通過這種變化，計算出HSR值來評價血小板的體外功能。

1．4 統(tǒng)計分析 所有資料均采用SPSS 24．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間和組內(nèi)比較采用配對樣本的t檢驗，P＜0．05有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 兩組PRP中血小板參數(shù)變化 兩組在各個時刻的PLT無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0．05），PDW、MPV 均有顯著性差異（P＜0．05）。隨著時間的延長，兩組的PLT呈下降趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0．05）。H－PRP組的PDW和MPV隨著時間延長呈逐漸增大趨勢，差異有顯著性（P＜0．05）。 見表1。

2．2 兩組PRP中代謝指標(biāo)的變化 H－PRP組在0 h、2 h、4 h的 pH 值高于 SC－PRP 組；H－PRP 組的鈣離子和乳酸值及滲透壓在各個時刻與SC－PRP組相比均有顯著性差異（P＜0．05）；H－PRP組的血糖在0 h、2 h與 SC－PRP 組相比有顯著性差異（P＜0．05）。SC－PRP組的pH值在各個時刻均有顯著性差異（P＜0．05）；血糖在4 h、8 h和 24 h呈下降趨勢（P＜0．05）；乳酸隨著時間延長呈逐漸升高（P＜0．05）。H－PRP組的鈣離子與組內(nèi)0 h相比在2 h、4 h與8 h有顯著性差異（P＜0．05）；血糖隨保存時間延長下降，有顯著性差異（P＜0．05）；乳酸隨保存時間延長呈逐漸升高（P＜0．05）。但在8 h內(nèi)，以上幾項代謝指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)。見表2。

2．3 兩組PRP的血小板最大聚集率 與 H－PRP相比，SC－PRP組的AA誘導(dǎo)下的最大聚集率在8 h、24 h低于H－PRP 組（P＜0．05），ADP 血小板最大聚集率從2 h開始就低于H－PRP組（P＜0．05），ADR血小板聚集率在0 h和2 h高于H－PRP組

（P＜0．05），其余無統(tǒng)計學(xué)差異。組內(nèi)比較，從4 h開始，兩組PRP的血小板最大聚集率隨著時間延長而下降（P＜0．05），但在8 h以內(nèi)的數(shù)值仍處于正常范圍內(nèi)。見表3。

表1 兩組PRP中血小板參數(shù)隨時間變化的情況（n＝40，±s）

表1 兩組PRP中血小板參數(shù)隨時間變化的情況（n＝40，±s）

注：（）內(nèi)P值為組內(nèi)各時間點與0 h比較的P值。

指標(biāo) 時間點 SC－PRP組（P值） H－PRP組（P值） P值PLT（×109／L） 0 h 510．10±96．78 507．80±102．57 0．058 2 h 507．22±100．26（0．290） 503．10±105．81（0．410） 0．362 4 h 499．26±98．74（0．523） 498．62±103．65（0．059） 0．904 8 h 500．55±99．48（0．229） 492．05±106．45（0．185） 0．451 24 h 487．16±108．72（0．814） 485．83±111．37（0．139） 0．720 PDW（%） 0 h 9．52±1．13 10．08±1．29 0．005 2 h 9．87±1．15（0．243） 10．74±1．22（0．009） ＜0．001 4 h 10．04±1．64（0．028） 10．80±1．53（0．424） 0．001 8 h 9．70±1．34（0．910） 11．65±2．89（0．085） 0．001 24 h 9．61±1．85（0．903） 12．31±2．28（0．015） ＜0．001 MPV（fl） 0 h 9．73±0．65 9．94±0．59 0．007 2 h 9．85±0．56（0．912） 10．31±0．61（0．016） 0．035 4 h 9．96±1．02（0．035） 10．42±0．79（0．039） 0．003 8 h 9．85±0．69（0．750） 10．70±1．14（0．030） ＜0．001 24 h 9．71±0．78（0．223） 11．03±1．01（0．010） ＜0．001

表2 兩組PRP中的代謝指標(biāo)變化（n＝40，±s）

表2 兩組PRP中的代謝指標(biāo)變化（n＝40，±s）

注：（）內(nèi)P值為組內(nèi)各時間點與0 h比較的P值。

指標(biāo) 時間點 SC－PRP組（P值） H－PRP組（P值） P值pH 0 h 7．33±0．04 7．44±0．05 0．032 2 h 7．44±0．05（0．001） 7．53±0．03（0．178） 0．045 4 h 7．48±0．08（0．003） 7．59±0．12（0．064） 0．028 8 h 7．52±0．12（0．001） 7．59±0．13（0．055） 0．056 24 h 7．43±0．07（0．024） 7．42±0．08（0．077） 0．067 Ca2＋（mmol／L） 0 h 0．15±0．02 1．19±0．10 ＜0．001 2 h 0．14±0．02（0．059） 1．16±0．10（0．046） ＜0．001 4 h 0．14±0．02（0．137） 1．13±0．08（0．048） ＜0．001 8 h 0．14±0．02（0．056） 1．10±0．09（0．043） ＜0．001 24 h 0．15±0．02（0．214） 1．10±0．15（0．183） ＜0．001血糖（mmol／L） 0 h 4．65±0．56 5．28±1．02 0．049 2 h 4．52±0．63（0．199） 5．01±1．03（0．241） 0．036 4 h 4．49±0．49（0．034） 4．80±0．96（0．155） 0．084 8 h 4．43±0．49（0．040） 4．65±0．92（0．013） 0．437 24 h 4．20±0．37（0．003） 4．24±0．77（0．001） 0．068乳酸（mmol／L） 0 h 1．21±0．41 1．51±0．43 0．001 2 h 1．42±0．46（0．003） 1．82±0．47（0．046） 0．001 4 h 1．44±0．45（0．012） 1．98±0．57（0．008） 0．001 8 h 1．60±0．53（0．001） 2．5±0．57（0．005） 0．001 24 h 2．57±0．82（＜0．001） 3．81±0．8（＜0．001） 0．001滲透壓（mOsm／L） 0 h 285．62±4．71 274．90±4．26 0．001 2 h 284．61±7．02（0．936） 273．89±4．73（0．674） 0．001 4 h 285．14±5．14（0．247） 273．50±3．37（0．785） 0．001 8 h 283．90±3．75（0．058） 272．71±5．64（0．151） 0．001 24 h 282．86±8．13（0．367） 272．14±3．79（0．590） 0．001

圖1、圖2為ADP誘導(dǎo)的兩組PRP的血小板聚集曲線圖，是根據(jù)血小板聚集試驗時全部血樣在每個時點的聚集率均值作出的曲線，其最高點為最大聚集率。曲線顯示，隨著時間延長，兩組的聚集率均逐漸下降。

圖1 ADP誘導(dǎo)SC－PRP組PRP血小板聚集曲線

圖2 ADP誘導(dǎo)H－PRP組PRP血小板聚集曲線

2．4 HSR結(jié)果 兩組的HSR結(jié)果在各個時刻無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0．05）；組內(nèi)隨時間延長呈下降趨勢，但在8 h內(nèi)組間無顯著性差異（P＞0．05），24 h時兩組與0 h比較均有顯著性差異（P＜0．05）。見表4。

3 討 論

研究顯示，H－PRP組PRP在各個時刻的PDW和MPV大于SC－PRP組。PDW和MPV都是反映血小板體積大小變化的指標(biāo)［8］。H－PRP組與SC－PRP組的這種差異，可能跟兩者的滲透壓差別較大有關(guān)，SC－PRP 組約高出正常值 15～20（mOsm／L），可能會導(dǎo)致血小板的輕微皺縮，H－PRP組的血小板則相對于SC－PRP組體積增大。由于抗凝原理不同，血小板在肝素抗凝環(huán)境中比枸櫞酸鹽抗凝環(huán)境中聚集成團的多一些，并且隨著保存時間延長，游離鈣和葡萄糖會消耗，乳酸濃度會增加，pH值有所下降，這些因素均會引起H－PRP組血小板的MPV和PDW顯著變化，使血小板更容易聚集，其變化與pH值顯著相關(guān)［9］。兩組PRP的pH值在前8 h呈增加趨勢，除了上述因素外，離體實驗時樣品難以在全密閉的容器中進(jìn)行，使二氧化碳易于釋放，可能也是導(dǎo)致pH值變化的原因。兩組的血糖呈下降趨勢，乳酸隨著時間延長呈逐漸增大趨勢。在8 h內(nèi)，H－PRP組這兩項生化指標(biāo)雖然與SC－PRP組有差別，但是均在正常值內(nèi)。

表3 兩組PRP的血小板最大聚集率（n＝40，±s）

表3 兩組PRP的血小板最大聚集率（n＝40，±s）

注：（）內(nèi)P值為組內(nèi)各時間點與0 h比較的P值。

最大聚集率（%） 時間點（h） SC－PRP組（P值） H－PRP組（P值） P值A(chǔ)A 0 63．86±18．54 66．44±14．91 0．074 62．46±17．68（0．167） 63．10±19．50（0．054） 0．379 4 53．26±18．99（＜0．001） 56．26±15．14（0．001） 0．092 8 45．18±12．33（＜0．001） 52．37±14．20（＜0．001） 0．003 24 28．76±7．80（＜0．001） 36．71±9．38（＜0．001） 0．001 ADP 0 63．30±15．25 69．96±14．43 0．056 2 61．45±14．74（0．085） 70．06±20．23（0．871） 0．008 4 54．3±14．27（0．001） 62．55±16．88（0．002） 0．002 8 41．22±16．96（＜0．001） 52．80±16．17（＜0．001） 0．001 24 20．86±8．25（＜0．001） 27．82±11．16（＜0．001） 0．013 ADR 0 52．46±12．25 46．62±12．09 0．001 2 51．81±13．72（0．753） 44．10±12．94（0．342） 0．002 4 41．16±11．54（0．001） 36．72±10．66（0．002） 0．069 8 32．10±10．92（＜0．001） 30．58±11．79（＜0．001） 0．255 24 17．89±6．23（＜0．001） 21．69±11．77（＜0．001） 0．117 2

表4 兩組PRP隨時間變化的HSR值比較（%，n＝40，±s）

表4 兩組PRP隨時間變化的HSR值比較（%，n＝40，±s）

注：（）內(nèi)P值為組內(nèi)各時間點與0 h比較的P值。

時間點（h） SC－PRP組（P值） H－PRP組（P值） P值0 67．8±12．8 71．2±11．4 0．367 2 66．3±9．2（0．672） 69．1±10．1（0．861） 0．471 4 64．7±13．9（0．831） 66．9±14．6（0．327） 0．762 8 63．4±14．3（0．756） 65．7±15．0（0．219） 0．627 24 59．6±13．6（0．012） 58．3±15．9（0．026） 0．189

肝素不能使離體后的血小板完全分散，成為單獨的顆?；蚣?xì)胞，會造成PLT減低，所以在以往的研究中很少用于血小板功能試驗，也極少用于血小板聚集研究［10］。但是近年來有些文章對比了兩者對血小板功能試驗的影響，發(fā)現(xiàn)H－PRP對一些誘導(dǎo)劑的聚集性優(yōu)于 SC－PRP。 Truss的研究發(fā)現(xiàn)［6］，肝素抗凝的血小板，抽血的即時和保存24 h后對于ADP，AA和ADR的聚集反應(yīng)無差異。相反，枸櫞酸保存的血小板對所有激動劑的聚集性在24 h后是顯著降低的，AA、膠原和ADP變化最明顯。這顯示枸櫞酸對AA、ADP和膠原的反應(yīng)比肝素的遲鈍。作者認(rèn)為這可能是由于枸櫞酸抗凝會導(dǎo)致細(xì)胞外周圍50微米內(nèi)鈣濃度的集中，枸櫞酸鈣螯合物會減少血小板中備用的鈣，會減少鈣依賴的應(yīng)答反應(yīng)。而非螯合的抗凝劑，比如肝素，則會保持細(xì)胞外的鈣水平在毫摩爾水平，維持長時間的應(yīng)答水平。文章指出，肝素血對膠原的聚集反應(yīng)是降低的，雖然不如枸櫞酸血降低的程度大，但因為膠原是研究聚集反應(yīng)廣泛使用的血小板誘導(dǎo)劑，一些研究用膠原對血小板反應(yīng)的維持程度，以偏概全混淆了儲存后的血小板活性結(jié)果，認(rèn)為血小板聚集反應(yīng)要在4 h內(nèi)進(jìn)行。Kai?ser［7］的研究則比較了6種抗凝劑對全血聚集測定血小板功能的情況，不同的抗凝劑對ADP和AA誘導(dǎo)的聚集反應(yīng)的應(yīng)答在不同的時間內(nèi)能維持穩(wěn)定，對ADP的應(yīng)答最佳的是肝素，能維持12 h；枸櫞酸鹽只能維持4 h。對AA的應(yīng)答最佳的仍然是肝素，能維持24 h；枸櫞酸鹽能維持6 h。本研究與上述文獻(xiàn)的結(jié)果相似，在8 h以內(nèi)的數(shù)值接近正常水平，H－PRP組對AA、ADP的聚集性要優(yōu)于SC－PRP組。

HSR是反映血小板體外活性和血小板膜是否完整的重要指標(biāo)。HSR恢復(fù)率與其體內(nèi)存活率密切相關(guān)，數(shù)值越高表明血小板的功能維持得越好［11］。隨著保存時間的延長，兩組的HSR均有緩慢降低的趨勢，但8 h內(nèi)無統(tǒng)計學(xué)意義，與文獻(xiàn)相符［12］。

4 結(jié) 論

本研究表明，隨著時間延長，H－PRP組各項指標(biāo)8 h內(nèi)基本都在正常范圍內(nèi)，與SC－PRP組相比各有優(yōu)劣，肝素作為體外循環(huán)手術(shù)中不可避免要使用的抗凝劑，H－PRP保存6～8 h內(nèi)在形態(tài)、代謝和功能方面是安全的。