激活腺苷酸活化蛋白激酶改善離體小鼠心臟缺血再灌注后心肌胰島素抵抗

王志法，殷 強(qiáng)，顧春虎

體外循環(huán)（cardiopulmonary bypass，CPB）的發(fā)明使心臟直視手術(shù)成為可能，為手術(shù)者提供更加清晰的視野，使多種復(fù)雜先天性心臟病的治療成為可能，但心臟長時(shí)間的缺血和缺血后的再灌注損傷也極易誘發(fā)心臟手術(shù)患者發(fā)生嚴(yán)重的急性糖代謝紊亂，導(dǎo)致心肌細(xì)胞攝取和利用葡萄糖障礙，是CPB致機(jī)體損傷的核心機(jī)制之一，顯著影響預(yù)后，但具體分子機(jī)制不明。在以前的研究中發(fā)現(xiàn)生理狀態(tài)下胰島素調(diào)節(jié)細(xì)胞糖代謝主要通路磷脂酰肌醇－3－羥激酶（phosphatidyl inositol 3－kinase，PI3K）通路顯著受抑，而對(duì)細(xì)胞能量調(diào)節(jié)也發(fā)揮重要作用的腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated pro?tein kinase，AMPK）通路未受抑制，并且在胰島素強(qiáng)化治療后其表達(dá)、活性增加，同時(shí)糖代謝紊亂得以改善。因此，假設(shè)在CPB致PI3K通路受抑時(shí)，AMPK通路在細(xì)胞糖代謝調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用，調(diào)控AMPK表達(dá)可以有效控制CPB糖代謝紊亂。本研究在CPB動(dòng)物離體模型干預(yù)AMPK通路，結(jié)合心肌特異性AMPK基因敲除小鼠，觀察心肌葡萄糖利用等指標(biāo)，在器官水平明確AMPK通路是CPB后機(jī)體調(diào)控糖代謝及胰島素強(qiáng)化治療中的關(guān)鍵機(jī)制之一。本研究將為防治CPB引發(fā)的糖代謝紊亂，降低CPB所致機(jī)體損傷，提供新的治療靶點(diǎn)和思路。

1 材料與方法

1．1 材料 雄性 C57BL／6 小鼠，4 月齡，平均（26．0±1．4）g，正常飲食，購自空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；AMPKα2－／－小鼠，4 月齡，平均（25．4±1．3）g，正常飲食，購于美國JAX公司。Langendorff離體心臟灌注系統(tǒng)（美國Radnoti公司）；MP150壓力換能器（美國Biopac Systems公司）；AcqKnowledge生物信息采集系統(tǒng)（美國Biopac Systems公司）；恒溫水浴鍋（中國華利達(dá)公司）；顯微手術(shù)器械；外科實(shí)體雙目顯微鏡；Cannon相機(jī)（日本 Cannon公司）；AE－100電子分析天平（瑞士Mettler公司）；三苯基氯化四氮唑（美國 Sigma公司）；Krebs－Henseleit碳酸緩沖液（KHB）；肝素（比利時(shí) 輝瑞比利時(shí)公司）。

1．2 方法

1．2．1 實(shí)驗(yàn)分組 C57BL／6 小鼠和 AMPKα2－／－小鼠各18只，隨機(jī)分為 3組（n＝6）；①對(duì)照（Control）組；②缺血／再灌注（ischemia reperfusion，I／R）組；③AICAR（AMPK 激活劑）加 I／R（AICAR＋I(xiàn)／R）組。Control組以K－H緩沖液持續(xù)恒壓灌注120 min；I／R組在平衡30 min后，全心缺血30 min，再灌注60 min；AICAR＋I(xiàn)／R 組在缺血前10 min給予含 AICAR的 K－H 緩沖液（0．1 mmol／L）灌流 10 min 后，全心缺血30 min，再灌注60 min。

1．2．2 Langendorff離體心臟灌流模型的制備 取小鼠稱重后，給小鼠腹腔注射肝素鈉（500 U／kg）使其肝素化后，脫頸處死，迅速摘取心臟，置于4℃預(yù)冷KH 灌流液（NaCl 118 mmol／L，KCl 4．7 mmol／L，Mg?SO41．2 mmol／L，KH2PO41．2 mmol／L，CaCl22．5 mmol／L，NaHCO325 mmol／L，Na－EDTA 0．5 mmol／L，葡萄糖 11 mmol／L，以 95%O2及 5%CO2混合氣體飽和，pH 為 7．35～7．40）中，經(jīng)主動(dòng)脈插管懸掛于Langendorff灌流裝置上，以K－H緩沖液進(jìn)行恒溫（37℃）、恒壓（80 mm Hg）、恒流（4 ml／min）灌注灌流。通過左心房切口向左心室插入一個(gè)與傳感器相連的球囊，通過微量注射器向球囊內(nèi)注水以調(diào)節(jié)左室舒張末壓保持在 5～10 mm Hg（1 mm Hg＝0．133 kPa）。壓力傳感器連接至計(jì)算機(jī)，采用 Acq Knowl?edge 3．8．1信號(hào)采集系統(tǒng)記錄左室壓力變化。實(shí)驗(yàn)開始前，用正常KH液平衡灌注15 min，在此期間如果心臟的冠脈流出液高于15 ml／min或出現(xiàn)心律失常，將從實(shí)驗(yàn)中去除。

1．2．3 葡萄糖濃度檢測(cè) 收集各組在I／R灌注開始前后2 min的冠脈流出液，通過氧化酶法檢測(cè)心臟I／R前后的冠脈流出液中葡萄糖含量。通過檢測(cè)葡萄糖濃度來反映心肌葡萄糖攝取能力，以評(píng)價(jià)心肌組織對(duì)胰島素的敏感性。

1．2．4 TTC染色法測(cè)定心肌梗死面積 在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將20 g／L的伊文思藍(lán)顏料經(jīng)主動(dòng)脈逆行灌注左心室腔，藍(lán)染區(qū)為正常灌注區(qū)。摘取心臟，沖洗染料，制備左心室切片（2 mm）。切片用含10 g／L 2，3，5－氯化三苯基四氮唑（2，3，5－triphenyltetrazoliumchloride，TTC）的磷酸鹽緩沖液染色 20 min。將染色切片的前后均拍照片，使用Image－Pro Plus圖像軟件計(jì)算伊文思藍(lán)染色區(qū)（藍(lán)色區(qū)域，非缺血區(qū)）、TTC染色［紅色區(qū)域，危險(xiǎn)區(qū)面積（area at risk，AAR）］和梗死區(qū)［白色區(qū)域，梗死面積（infarct area，INF）］面積。心肌梗死面積用INF和AAR的百分比表示（INF／AAR×100%）。

1．2．5 胱天蛋白酶－3（caspase－3）活性檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，稱取各組小鼠心肌組織10 mg勻漿，Brad?ford法檢測(cè)蛋白濃度。按Chemicon公司caspase－3活性檢測(cè)試劑盒操作，通過pNA標(biāo)準(zhǔn)曲線和Brad?ford蛋白定量結(jié)果計(jì)算心肌組織單位重量蛋白的caspase－3活性。

1．2．6 乳酸脫氫酶及心肌肌鈣蛋白 I（cardiac tropo?nin I，cTnI）釋放的測(cè)定 肌酸激酶（creatine kinase，CK）及cTnI是細(xì)胞壞死的一個(gè)重要指標(biāo)。收集各組在I／R灌注開始前后2 min的冠脈流出液，按照Abnova公司提供的ELISA試劑盒的操作步驟依次加入檢測(cè)液，在450 nm處讀取吸光值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用國際單位IU／g來表示。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 15．0統(tǒng)計(jì)軟件處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD－t檢驗(yàn)，以P＜0．05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 I／R降低離體心肌葡萄糖攝取，預(yù)給予AICAR改善I／R后心肌葡萄糖攝取 與對(duì)照組相比，I／R后心肌葡萄糖攝取量下降（P＜0．05），但是預(yù)給予AMPK的激活劑AICAR，可以改善I／R后心肌對(duì)葡萄糖的攝?。≒＜0．05）。 與C57BL／6小鼠對(duì)照組相比，AMPKα2－／－小鼠在基礎(chǔ)狀態(tài)下心肌葡萄糖攝取下降，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。但是在AMPKα2－／－小鼠，給予AMPK 的激活劑AICAR 并不能改善I／R引起的心肌葡萄糖攝取下降（P＞0．05）。說明I／R引起心肌胰島素抵抗，但是預(yù)給予AMPK的激活劑AICAR可以部分改善缺血再灌注引起的心肌胰島素抵抗，但是此心肌保護(hù)作用在AMPKα2－／－小鼠消失。 見圖 1。

2．2 給予AICAR對(duì)缺血再灌注后心肌有保護(hù)作用

在C57BL／6小鼠中，與 I／R 組相比，AICAR 能明顯降低I／R心臟的心肌損傷，表現(xiàn)為灌流液中CK和 cTnI含量降低（圖2A 和圖2B，P＜0．05）、心肌梗死面積減?。▓D2C，P＜0．05）及心肌細(xì)胞凋亡減少（圖 2D；均P＜0．05）。 但是，在 AMPKα2－／－小鼠中，與I／R組相比，給予AICAR并不能有效地改善I／R后心肌的損傷程度（P＞0．05）（圖 2），表明在AMPKα2－／－小鼠，AICAR 的心肌保護(hù)作用消失。

2．3 預(yù)給予AICAR對(duì)小鼠離體心臟收縮和舒張功能的影響 為了進(jìn)一步明確給予AMPK的激動(dòng)劑AICAR所帶來的生物學(xué)作用，筆者采用心率壓力指數(shù)衡量 I／R后心臟功能（圖 3）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在C57BL／6小鼠，預(yù)給予AICAR促進(jìn)I／R后心臟收縮舒張功能的恢復(fù)。但是，上述保護(hù)作用在AMPKα2－／－小鼠消失，再次表明激活 AMPK 改善 I／R后的心肌胰島素抵抗對(duì)心肌有保護(hù)作用。

3 討 論

隨著心血管外科技術(shù)成熟，心肌保護(hù)措施的提高及CPB裝置的改善，心血管外科手術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生率以及術(shù)后的病死率已顯著下降。但患者在進(jìn)行CPB時(shí)卻必須承受長時(shí)間的心臟停止搏動(dòng)和血液供應(yīng)，血液和CPB人工材料長時(shí)間、大面積接觸，非搏動(dòng)性灌注，體溫大幅升降，控制性低血壓，血液嚴(yán)重稀釋，以及手術(shù)創(chuàng)傷、出血、藥物等刺激，這些均可引起機(jī)體發(fā)生嚴(yán)重的全身炎癥反應(yīng)、I／R損傷、嚴(yán)重的應(yīng)激狀態(tài)，最終引起患者術(shù)后的心功能損傷，其中由心臟I／R引起的心肌胰島素抵抗，可能是導(dǎo)致心功能損傷，最終導(dǎo)致患者并發(fā)癥發(fā)生率和病死率增加的重要原因之一［1］。因此及時(shí)降低甚至糾正心肌胰島素抵抗可能對(duì)改善患者預(yù)后具有重要意義。

圖1 預(yù)給予AICAR改善I／R后心肌葡萄糖攝取

圖2 預(yù)給予AICAR對(duì)缺血再灌注心肌有保護(hù)作用

圖3 激活A(yù)MPK對(duì)小鼠離體心臟收縮和舒張功能的影響

研究證實(shí)激活A(yù)MPK，可通過促進(jìn)心肌葡萄糖運(yùn)載體 4（glucose transporter 4，GLUT4）向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)增加心肌葡萄糖攝取和利用，改善心肌胰島素抵抗。因此通過給予AMPK的激動(dòng)劑AICAR可能會(huì)改善CPB下的心肌胰島素抵抗，進(jìn)而改善患者預(yù)后。

胰島素抵抗是機(jī)體、組織以及細(xì)胞的一種病理生理狀態(tài)，導(dǎo)致胰島素靶組織對(duì)胰島素介導(dǎo)的葡萄糖攝取以及利用障礙；胰島素抵抗下的靶組織需要超常量的胰島素才能引起正常量反應(yīng)［2］。在CPB下的心臟手術(shù)，由于血液稀釋、非搏動(dòng)性灌注、創(chuàng)傷、低壓、低溫以及麻醉等刺激均可引起機(jī)體產(chǎn)生嚴(yán)重的應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致血中游離脂肪酸、葡萄糖、乳酸和甘油濃度升高，這些激素的增加會(huì)抑制胰島素在外周組織細(xì)胞對(duì)胰島素受體、胰島素受體底物－1（In?sulin receptor substrate，IRS－1）以及細(xì)胞分裂活化蛋白激酶的磷酸化作用。同時(shí)也有研究發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重應(yīng)激增加的腎上腺皮質(zhì)激素也會(huì)間接升高血糖以及導(dǎo)致胰島素抵抗［3］。

有大量的研究已經(jīng)證實(shí)，心肌葡萄糖氧化生成ATP是最經(jīng)濟(jì)、最高效的供能方式［4］。同時(shí)在心衰患者中研究發(fā)現(xiàn)，心肌葡萄糖攝取和利用下降是導(dǎo)致心功能障礙的重要原因［5］。在糖尿病中也有研究證實(shí)，心肌葡萄糖攝取下降是導(dǎo)致糖尿病心肌病的重要原因［6］。因此，CPB后心肌葡萄糖攝取障礙可能會(huì)引起心肌能量的生成不足，引起心功能下降。心肌功能障礙是CPB后患者并發(fā)癥發(fā)生率和死亡率的增加的重要原因［7］。因此，尋找改善CPB導(dǎo)致的急性心肌胰島素抵抗的措施可能會(huì)改善CPB后患者的預(yù)后。

但與糖尿病導(dǎo)致的慢性胰島素抵抗相比，由于對(duì)急性損傷了解的很少，如手術(shù)等導(dǎo)致的急性心肌胰島素抵抗，且創(chuàng)傷后急性心肌胰島素抵抗的機(jī)制比較復(fù)雜，可能有眾多的因素可以導(dǎo)致急性心肌胰島素抵抗。由CPB導(dǎo)致生成增加的應(yīng)激性激素和炎性因子可能是導(dǎo)致心肌胰島素抵抗的重要原因之一［8］。在以前的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，CPB后的胰高血糖素、生長激素等會(huì)對(duì)抗胰島素的作用導(dǎo)致外周的胰島素抵抗［9］。有研究發(fā)現(xiàn)心肌I／R損傷是導(dǎo)致心肌葡萄糖攝取障礙獨(dú)立危險(xiǎn)因素，同時(shí)有研究已證明激活A(yù)MPK可以恢復(fù)胰島素抵抗心肌葡萄糖的攝取，改善心肌胰島素抵抗。最新一篇研究已經(jīng)證明，AMPK的一種小的激動(dòng)劑AICAR可以降低離體心臟的I／R損傷。但激活A(yù)MPK是否是通過改善I／R引起的心肌胰島素抵抗，降低心肌損傷的還未見報(bào)道。

本研究發(fā)現(xiàn)給予AMPK的激動(dòng)劑AICAR，可以明顯的增加離體心肌葡萄糖的攝取和利用，進(jìn)而改善離體心肌的胰島素抵抗，發(fā)揮心肌保護(hù)的重要作用。更為重要的是通過心率－壓力指數(shù)檢測(cè)，筆者驗(yàn)證了激活A(yù)MPK可以明顯的改善離體心肌的心臟收縮舒張功能。