miRNA-34 a及XIAP在不同基因分型乳腺癌中的表達及意義

王振威，肖剛，劉威，趙永魁，李小江

1唐山市婦幼保健院普通外科，河北 唐山063000

2華北理工大學附屬醫(yī)院普通外科，河北 唐山063000

3遷安市人民醫(yī)院普外一科，河北 唐山0644000

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，占女性新發(fā)腫瘤的29%，其發(fā)病率逐漸年輕化，是20～59歲女性癌癥死亡的主要原因之一，嚴重影響婦女身心健康甚至危及生命[1]。放療、化療和手術治療是乳腺癌患者最常見的治療方法。傳統(tǒng)的化療、放療方法可以緩解疾病的惡化，但在乳腺癌治療中有較大的不良反應，且治療效果有限[2]。研究表明，致癌作用的分子機制不僅與蛋白質(zhì)編碼基因有關，且與非編碼調(diào)控RNA有關[3]。miRNA是小的非編碼RNA，可以作為致癌因子或抑癌因子，在癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，靶向miRNA可能作為診斷和治療惡性腫瘤的新策略。研究表明，miRNA-34a在乳腺癌、肝癌、胰腺癌等多種腫瘤中異常表達，與腫瘤的進展密切相關[4]。而X連鎖凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XⅠAP）是凋亡抑制蛋白家族中作用最強的一種，是與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關的凋亡相關基因[5]。但是關于miRNA-34a、XⅠAP在不同基因分型乳腺癌中的表達情況尚不明確，基于此，本研究旨在探討miRNA-34和XⅠAP在不同基因分型乳腺癌中的表達情況，并初步探究相關分子機制，以期為乳腺癌的靶向治療提供一定理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年1月至2016年6月唐山市婦幼保健院普通外科手術切除后經(jīng)病理證實為乳腺癌患者的石蠟包埋乳腺癌組織及相應癌旁組織。納入標準：①術后經(jīng)病理證實為乳腺癌；②患者病歷資料完整；③患者術前未經(jīng)放化療及靶向治療；④組織標本保存完好。排除標準：①合并其他系統(tǒng)的腫瘤；②伴結(jié)締組織疾?。虎酆喜⑻悄虿?、血液系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病等。共納入77例患者，年齡25～76歲，平均（48.31±6.93）歲；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期47例，Ⅲ～Ⅳ期30例；組織學分級：Ⅰ級13例，Ⅱ～Ⅲ級64例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移37例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移40例；病理類型：浸潤性導管癌65例，其他類型12例。根據(jù)乳腺癌組織雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）、人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）表達情況，將77例乳腺癌患者進行基因分型：管腔A型（Luminal A）18例，管腔B型（Luminal B）19例，HER2過表達型（HER2+）19例，三陰性21例。

1.2 實時熒光定量PCR檢測miRNA-34 a表達水平

使用TRⅠzol試劑（購自美國Ⅰnvitrogen公司）從液氮凍存的組織中提取總RNA，然后用Reverse Transcription Ki（t購自日本Takara公司）將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，后用SYBR Green（購自日本Takara公司）進行實時PCR分析。利用ABⅠ7500系統(tǒng)（購自美國應用生物系統(tǒng)公司）進行實時熒光定量（quantitative real-time，qRT）-PCR檢測。以U6作為內(nèi)參。本研究所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成，引物設計如下。miRNA-34a：正義，5'-GACTGAGTACAAACTGGTGG-3'；反義，5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。U6：正義，5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'；反義，5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。50 μl PCR 反應體系：10×Buffer 5 μl，2.5 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）4 μl，taq 酶 0.5 μl，Pmix 2.5 μl，上游引物和下游引物各 1 μl，雙蒸水（distillation-distillation H2O，ddH2O）36 μl。PCR 反應條件：94℃預變性2 min，94℃變性25 s，60℃退火35 s，72 ℃延伸20 s，31 個循環(huán)。應用2-ΔΔCt法計算miRNA-34a相對表達量，ΔCt=CtmiRNA-34a-CtU6，ΔΔCt=ΔCt乳腺癌組織-ΔCt癌旁組織。

1.3 蛋白免疫印跡（WB）法檢測XIAP蛋白表達水平

使用補充有苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）（Riche）的 RⅠPA 蛋白提取試劑（Beyotime）從組織中提取XⅠAP蛋白質(zhì)。在4℃2500 r/min下離心10 min后，通過10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離上清液，將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。將膜在磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）和5%脫脂乳中封閉1 h，并用兔抗人XⅠAP多克隆抗體（1∶200）和內(nèi)部對照兔抗大鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體（Cell Signaling Technology，1∶200）4℃孵育過夜。將膜用辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）綴合的二抗在室溫下孵育1 h。使用Quantity One軟件（Life Technologies）評估XⅠAP蛋白相對表達水平。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計-軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗；相關性分析采用Pearson相關分析；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織及癌旁組織中miRNA-34 a和XIAP蛋白相對表達水平的比較

乳腺癌組織中miRNA-34a相對表達水平低于癌旁組織，XⅠAP蛋白相對表達水平高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。不同基因分型乳腺癌組織中miRNA-34a、XⅠAP蛋白相對表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義（F=7.128，P=0.000；F=3.824，P=0.013）；與Luminal A、Luminal B和三陰性乳腺癌組織相比，HER2+乳腺癌組織中miRNA-34a相對表達水平降低，而XⅠAP相對表達水平升高（P＜0.05）。（表1）

表1 miRNA-34 a及XⅠAP在不同基因分型-乳腺癌組織及癌旁組織中的相對表達水平比較（± s）

表1 miRNA-34 a及XⅠAP在不同基因分型-乳腺癌組織及癌旁組織中的相對表達水平比較（± s）

注：a與癌旁組織比較，P＜0.05；b與Luminal A比較，P＜0.05；c與Luminal B比較，P＜0.05

組織癌旁組織（n=77）乳腺癌組織（n=77）Luminal A（n=18）Luminal B（n=19）HER2+（n=19）三陰性（n=21）miRNA-34a XⅠAP 1.01±0.03 0.53±0.13a 0.61±0.15a 0.55±0.11a 0.41±0.13a b c 0.56±0.16a 0.89±0.16 1.09±0.20a 1.03±0.21a 1.06±0.19a 1.23±0.25a b c 1.05±0.17a

2.2 乳腺癌組織中miRNA-34 a及XIAP蛋白相對表達水平與臨床特征的關系

乳腺癌組織中miRNA-34a相對表達可能與年齡、腫瘤直徑、組織學分級、ER狀態(tài)、PR狀態(tài)無關（P＞0.05）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、HER2陽性表達的乳腺癌組織中miRNA-34a相對表達水平均低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、HER2陰性表達的乳腺癌組織（P＜0.05）。乳腺癌組織中XⅠAP相對表達可能與年齡、腫瘤直徑、組織學分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ER狀態(tài)、PR狀態(tài)無關（P＞0.05）；TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、HER2陽性表達的乳腺癌組織中XⅠAP蛋白相對表達水平均高于TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、HER2陰性表達的乳腺癌組織（P＜0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征乳腺癌組織中miRNA-34 a和ⅠXAP蛋白的表達水平（ n=77）

2.3 乳腺癌基因分型分布與臨床特征的關系

不同年齡、TNM分期患者的乳腺癌的基因分型分布比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），而不同腫瘤直徑、組織學分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及病理類型患者的乳腺癌的基因分型分布比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（表3）

表3 乳腺癌基因分型分布與臨床特征的關系（ n=77）

2.4 乳腺癌組織中miRNA-34 a與XIAP相對表達的相關性分析

Pearson相關性分析顯示，乳腺癌組織中，隨著miRNA-34a相對表達水平的降低，XⅠAP蛋白相對表達水平逐漸提高，二者呈負相關（r=-0.404，P＜0.05）。

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率占全身各種惡性腫瘤的7%～10%[6]。乳腺癌的早期發(fā)現(xiàn)、合理治療能夠有效延長患者的生存期，Ⅰ期患者5年生存率達93%，Ⅱ期患者5年生存率達81%[7]。然而，乳腺癌的治療及預后在同樣病理類型、同一臨床分期、同種治療方式的患者中仍存在差異，這些提示乳腺癌存在基因分型。隨著分子生物學的發(fā)展，乳腺癌基因分型成為其病理學分型的發(fā)展和補充[8]。研究表明，由于其異質(zhì)性，不同基因分型乳腺癌的流行病學危險因素、疾病自然進程、治療反應存在差異[9]。根據(jù)乳腺癌的基因分型指導患者治療，以提高疾病的診療效果仍然是目前的研究熱點和難點。

乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程與多種致癌基因及抑癌基因的表達相關。致癌基因或抑癌基因表達異常通過調(diào)控細胞增殖、遷移參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程。miRNA靶向結(jié)合mRNA的3’非翻譯區(qū)（3’UTR）來抑制轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平的基因表達[10]，通過調(diào)節(jié)其他腫瘤抑制因子或致癌基因表達而起到致癌基因或抑癌基因的作用。多種miRNA表達的上調(diào)或下調(diào)在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[11-12]。miRNA-34a作為潛在的抑癌基因，通過下調(diào)多種靶標起到抑制腫瘤的作用。過往研究已證實，miRNA-34a在乳腺癌組織中的相對表達水平顯著下調(diào)，且其表達水平與患者年齡、腫瘤分化程度、腫瘤大小等無明顯相關性，而與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關[13]。與此一致，本研究發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，乳腺癌組織中miRNA-34a相對表達水平降低，提示miRNA-34a在乳腺癌中起抑癌基因的作用。進一步探討miRNA-34a與臨床特征的關系發(fā)現(xiàn)，miRNA-34a相對表達水平與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關。隨著TNM分期的升高，miRNA-34a相對表達水平降低，且有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者miRNA-34a相對表達水平低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者。研究結(jié)果提示，miRNA-34a參與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移等過程。研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌中，與ER狀態(tài)有關的miRNA有miRNA-342、miRNA-217、miRNA-206等，與PR狀態(tài)有關的 miRNA 有 miRNA-377、miRNA-520g、miRNA-93等，而miRNA-520d、miRNA-302c、miRNA-30e等與HER2狀態(tài)有關[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，在HER2+乳腺癌中miRNA-34a相對表達水平最低，且在Luminal A、Luminal B、HER2+和三陰性乳腺癌組織中miRNA-34a的相對表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義。另外，miRNA-34a相對表達水平與HER2狀態(tài)有關，而與ER和PR狀態(tài)無關。此結(jié)果提示，miRNA-34a相對表達水平與乳腺癌基因分型有關。HER2+乳腺癌的生物學行為更為惡性，預后較差，且HER2過表達與乳腺癌的復發(fā)及轉(zhuǎn)移有關[15]。由此推測，miRNA-34a表達水平的降低與乳腺癌的惡性進展有關，其在乳腺癌不同基因分型中的差異性表達可能為深入探究不同基因亞型乳腺癌提供理論基礎。

XIAP基因作為miRNA-34a的靶基因，在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等多種腫瘤組織中表達上調(diào)，能直接抑制caspase3、caspase7、caspase9蛋白的活性，從而阻止細胞凋亡，參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[16]。閆紅等[17]發(fā)現(xiàn)，XⅠAP在乳腺癌中高表達，且與HER2狀態(tài)有關，在HER2陽性腫瘤組織中的陽性表達率顯著高于HER2陰性腫瘤組織。與此一致，本研究發(fā)現(xiàn)，XⅠAP在乳腺癌組織中的表達水平高于癌旁組織，且隨著TNM分期的升高，XⅠAP相對表達水平逐漸增加，提示XⅠAP可能參與乳腺癌組織的惡性轉(zhuǎn)化過程。另外，在Luminal A、Luminal B、HER2+和三陰性乳腺癌組織中，XⅠAP蛋白相對表達水平存在差異，XⅠAP蛋白在HER2+型中的相對表達水平高于Luminal A和Luminal B，提示XⅠAP表達與HER2陽性密切相關，與閆紅等[17]的研究結(jié)果一致。由此推測，XⅠAP可能對乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的凋亡起重要調(diào)控作用，且與乳腺癌的基因分型有關。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miRNA-34a在乳腺癌中的相對表達水平下調(diào)，與XⅠAP表達呈負相關，且與HER2陽性表達有關。這一結(jié)果對于豐富乳腺癌的基因分型和指導治療具有重要作用。miRNA-34a與XⅠAP的表達與乳腺癌的惡性進展密切相關，二者可能共同參與一種或多種途徑調(diào)控乳腺癌進程。然而，由于本研究樣本量較少，且可能受到病例篩選的隨機性和研究誤差的影響，在后續(xù)研究中需擴大樣本量，并更精確地去驗證miRNA-34a在不同基因型乳腺癌中的表達情況，以期為疾病的診療提供一定理論依據(jù)。