芪芍復脈湯對大鼠下肢缺血模型MVD及VEGF蛋白表達的影響

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近年來，以動脈硬化閉塞癥、血栓閉塞性脈管炎和糖尿病足為主的下肢缺血性疾病嚴重困擾著人們的健康，由組織代謝量與維持生命活動的氧氣需求量之間不平衡所導致。血管新生技術(shù)的出現(xiàn)，為建立有效的側(cè)支循環(huán)，改善下肢缺血狀態(tài)開辟了新途徑。中醫(yī)藥憑其多途徑、多靶點的優(yōu)勢，治療下肢缺血性疾病前景廣闊。本實驗采用結(jié)扎大鼠下肢股動脈制造下肢缺血模型，探討芪芍復脈湯對促進缺血下肢血管新生的作用及其機制，以期為芪芍復脈湯的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 大鼠下肢缺血模型的建立 SD大鼠108只，雄性，6月齡，體質(zhì)量250 g～300 g，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心，合格證號：SCXK(軍)2014-0004。常規(guī)飼養(yǎng)1周后，隨機分為模型組(90只)和假手術(shù)組(18只)。大鼠腹腔注射3.5%水合氯醛(1 mL/100 g)麻醉，選左側(cè)腹股溝中點向膝部作一長度約2 cm的縱向切口，緊貼腹股溝下方分離股動脈主干，行股動脈結(jié)扎、離斷及分支剔除術(shù)，制造下肢缺血模型。假手術(shù)組僅暴露股三角，不結(jié)扎動脈及其分支，術(shù)后大鼠下肢肌肉注射抗青霉素(8 U)，連續(xù)3

d，預防感染。

1.2 動物分組 將造模成功的大鼠，按隨機數(shù)字表法分為5組，模型組18只，芪芍復脈湯高劑量組18只，中劑量組18只，低劑量組18只，粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF)組18只。

1.3 給藥方法 芪芍復脈湯組方：黃芪30 g，當歸15 g，桂枝15 g，麥冬10 g，赤芍15 g，川芎10 g，三七3 g，丹參30 g，土元6 g，全蝎6 g，川牛膝30 g，甘草6 g。廣東一方制藥有限公司生產(chǎn)顆粒劑，1 g顆粒折合生藥量4.5 g ，根據(jù)藥物的溶解性確定最大給藥濃度，以此作為高劑量給藥濃度，0.50倍為中劑量給藥濃度，0.25倍為低劑量給藥濃度。給藥劑量為：高劑量組7.6 g/(kg·d)，相當于60 kg體重成人用量的12倍；中劑量組3.8 g/(kg·d)，相當于60 kg體重成人用量的6倍；低劑量組1.9 g/(kg·d)，相當于60 kg體重成人用量的3倍，加溫開水至10 mL，1 mL/100 g；模型組和假手術(shù)組灌服蒸餾水，1 m L/100 g，每天1次，連續(xù)14 d。

陽性對照藥：應(yīng)用rhG-CSF 200 μg /1.2 mL， 購自山東齊魯制藥有限公司，批號S19990049。用生理鹽水稀釋至12 mL 備用，予rhG-CSF組大鼠患肢皮下注射，注射量0.21 mL/100 g，相當于60 kg體重成人用量的7倍， 每日1次，連續(xù)5 d。

1.4 主要試劑與儀器 一抗(VEGF)購自英國abcam公司，貨號：ab52917；二抗(HRP山羊抗兔鼠通用)購自丹麥DAKO公司，貨號：K5007；CD34抗體，購自英國abcam公司，批號：ab8158 ；組化試劑盒DAB顯色劑購自丹麥DAKO公司，貨號：K5007。

1.5 檢測指標 術(shù)后3 d、7 d、14 d，各組取6只大鼠，用免疫組化方法檢測大鼠患側(cè)內(nèi)收肌毛細血管密度(MVD)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)蛋白表達。

1.5.1 缺血骨骼肌中毛細血管密度測定 石蠟包埋，切片后脫蠟，EDTA抗原修復緩沖液修復抗原，待自然冷卻后，用3%過氧化氫溶液溫室避光孵育25 min，用3%BSA均勻覆蓋組織，室溫封閉30 min，滴加一抗，4 ℃孵育過夜， PBS 緩沖液洗滌 5 min共3次，滴加二抗體，室溫37 ℃孵育20 min，PBS 緩沖液洗滌5 min共3次，DAB顯色，復染、封片。進行400倍的顯微照相。

1.5.2 缺血骨骼肌VEGF蛋白表達測定 石蠟包埋、切片后脫蠟，EDTA抗原修復緩沖液修復抗原，自然冷卻后，用3%過氧化氫溶液溫室避光孵育25 min，用3%BSA均勻覆蓋組織，室溫封閉30 min，加一抗VEGF后4℃孵育過夜， PBS 緩沖液洗滌5 min共3次，滴加二抗(HRP山羊抗兔鼠通用)，室溫孵育50 min，再用PBS 緩沖液洗滌 5 min共3次，滴加DAB顯色液，顯微鏡下觀察2 min，沖洗切片終止顯色，復染細胞核，脫水，封片。400倍顯微鏡鏡檢，每張切片選擇 6個視野，應(yīng)用圖像采集分析系統(tǒng)計算光密度值，取均值作為VEGF的蛋白表達量。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件處理，不同處理因素不同時間點各指標比較采用析因設(shè)計資料的方差分析，如果存在交互作用，分析各因素的單獨效應(yīng)；如果無交互作用，則分析各因素的主效應(yīng)。LSD法進行組間比較。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠下肢缺血模型建立情況 結(jié)扎、離斷大鼠下肢股動脈及其分支的造模效果顯著，除假手術(shù)組外，其余各組均有不同程度的活動障礙，6組大鼠下肢未見壞死。

2.2 各組MVD值比較 術(shù)后3 d，各組間MVD值無統(tǒng)計學意義；術(shù)后7 d，各組間總體不全相同，rhG-CSF組、芪芍復脈湯高劑量組、芪芍復脈湯中劑量組較模型組與低劑量組比較上升(P<0.05或P<0.01)，rhG-CSF組與高劑量組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；術(shù)后14 d，各組間總體不全相同，rhG-CSF組、芪芍復脈湯高劑量組較模型組和低劑量組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，中劑量組較模型組升高(P<0.05)，并且高劑量組高于中劑量組(P<0.05)，高劑量組與G-CSF組比較差異無統(tǒng)計學意義。詳見表1、圖1。

表1 各組大鼠不同時間點MVD值比較(±s)

圖1 各組MVD免疫組化圖

2.3 各組VEGF蛋白表達比較 假手術(shù)組術(shù)后各時間點之間比較無統(tǒng)計學意義；術(shù)后3 d，芪芍復脈湯高、中劑量組、G-CSF組VEGF光密度值較模型組升高(P<0.01)，高劑量組較低劑量組升高(P<0.01)，中劑量組較低劑量組升高顯著(P<0.05)；術(shù)后7 d，模型組較假手術(shù)組VEGF光密度值升高(P<0.05)，芪芍復脈湯高、中劑量組和G-CSF組較模型組升高(P<0.01)，其中G-CSF組較高劑量組升高(P<0.05)，高劑量組較低劑量組升高顯著(P<0.05)；術(shù)后14 d，高、中劑量組和G-CSF組較模型組升高顯著(P<0.05或P<0.01)，并且高劑量組高于中劑量組(P<0.05)，中劑量組高于低劑量組(P<0.05)。詳見表2、圖2。

表2 各組大鼠不同時間VEGF蛋白表達(±s)

3 討 論

血管內(nèi)皮細胞生長因子是血管內(nèi)皮細胞特異性的肝素結(jié)合蛋白，由不同長度、形態(tài)和酸堿度的氨基酸構(gòu)成。在血管生成和側(cè)支循環(huán)構(gòu)建過程中，依賴相關(guān)生長因子，發(fā)揮調(diào)控作用。研究表明VEGF可特異性促進血管內(nèi)皮細胞有絲分裂[1]，有強烈的促血管生成作用。其起作用的方式主要有3方面[2-4]：①它可以直接作用于血管內(nèi)皮細胞，特異性地與血管內(nèi)皮上的特殊受體相結(jié)合，促進內(nèi)皮細胞的分裂、增殖，從而促進血管新生；②通過招募骨髓中的內(nèi)皮祖細胞(EPCs)向外周血遷移、歸巢、整合于受損血管叢，進而分化為內(nèi)皮細胞，促進血管新生。Takah等[5]給予缺血大鼠外源性的VEGF，從而升高外周血中 EPCs 的數(shù)量，就是利用VEGF的這一作用促進了血管再生。③VEGF具有高通透性，因此也叫血管滲透因子[3]，它可以通過增加微血管的通透性，使血液內(nèi)的血漿蛋白滲透致血管外，大量的纖維蛋白原凝固成纖維蛋白，作為內(nèi)皮細胞、成纖維細胞等暫時的基質(zhì)成分，并促進血管內(nèi)皮細胞的分裂、增殖，最終促進血管的生成。毛細血管密度是檢測血管新生的重要指標[6]，它反映血管再生能力的強弱，即MVD的值越高，代表新生毛細血管越豐富。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：術(shù)后14 d，芪芍復脈湯高、中劑量組增加了缺血骨骼肌局部毛細血管密度，并且顯著高于模型組，意味著芪芍復脈湯能夠促進下肢缺血大鼠模型的血管新生。實驗中芪芍復脈湯高、中劑量組與模型組和假手術(shù)組相比，VEGF 的光密度值顯著上調(diào)，證明芪芍復脈湯能通過上調(diào)促血管新生因子蛋白的表達，提高缺血下肢微血管密度，促進缺血下肢側(cè)支循環(huán)的形成，促進血管新生。

大量的實驗研究證實，中藥相對西藥具有多靶點、多途徑的治療優(yōu)勢，很多中藥具有促血管新生的作用[7]。血管新生是近年提出的概念，然而早在幾千年前中醫(yī)學中就有記載：“夫脈者，血之府也?！薄鹅`樞·經(jīng)水》載：“若夫八尺之士，皮肉在此，外可度量切循而得之，其死可解剖而視之……脈之長短……皆有大數(shù)”。說明中醫(yī)所述的“脈”和現(xiàn)代醫(yī)學的“血管”名異而實同，無論從形態(tài)結(jié)構(gòu)還是功能上都相對應(yīng)。從古至今，大部分醫(yī)家認為下肢缺血性疾病的基本病機為氣血瘀滯，經(jīng)絡(luò)阻塞，陽氣不能達于四末。在下肢缺血性疾病的治療上把活血化瘀方法貫穿始終，然而形成瘀血的病因方面歷代醫(yī)家卻眾說紛紜。吾師李廷荃教授認為，下肢缺血性疾病的發(fā)病以中老年人為主，年過半百，其天葵衰，正氣虧虛，所以氣血虧虛是導致疾病發(fā)生的主要原因。現(xiàn)代研究證明陰虛病人的血液黏稠度、紅細胞沉降率、纖維蛋白原含量均高于正常人[8]。陰虛可以導致血液運行遲緩，形成瘀血，所以陰虛是缺血性疾病發(fā)病的重要因素。吾師認為治療此病，當以益氣活血、滋陰復脈為治療大法。

芪芍復脈湯是李廷荃教授經(jīng)過多年臨床實踐，反復探索與完善總結(jié)出的治療下肢缺血性疾病的效驗方。方中黃芪補氣，培正固本，使氣旺則血行；赤芍活血散瘀；麥冬養(yǎng)陰增液，使陰血充、脈絡(luò)盈；三藥共為君，奏益氣活血、滋陰復脈之功。桂枝助陽化氣，溫通經(jīng)脈，發(fā)越陽氣，溫養(yǎng)肌膚；三七、川芎、丹參、川牛膝活血祛瘀、行氣止痛，助赤芍活血化瘀，與桂枝共為臣；當歸養(yǎng)血補血，助麥冬養(yǎng)陰增液；土元、全蝎借其行散走竄之力，搜風通絡(luò)止痛與當歸共為佐藥。甘草調(diào)和諸藥，解土元、全蝎之毒性，為使。全方養(yǎng)陰血以增津液，活血化瘀以通脈絡(luò)，使正氣壯，瘀血除，新血生，血供改善，從而減輕肢體不適癥狀。

本實驗得出：芪芍復脈湯不同劑量組與模型組比較均有差異，并且術(shù)后14 d高劑量組VEGF光密度值和MVD值均顯著高于中劑量組和低劑量組，中劑量組顯著高于低劑量組，說明芪芍復脈湯對下肢缺血大鼠模型的治療存在劑量依賴性，為臨床治療下肢缺血性疾病提供了劑量指導和實驗依據(jù)。

芪芍復脈湯能夠促進缺血大鼠下肢骨骼肌毛細血管密度的增多，促進血管新生，其機制可能與促進缺血組織VEGF蛋白表達有關(guān)。芪芍復脈湯能否動員骨髓中的EPCs，能否增加缺血組織中CD34陽性細胞的含量，還有待進一步的實驗觀察。