聾人家庭及高危夫婦耳聾基因篩查分析和生育指導(dǎo)

查樹偉 許豪勤 呂年青 查佶 周定杰 傅雅麗 石慧 鄒文霓 孫慶 張偉婧

目前，中國人群攜帶突變耳聾基因的比例約為12%，每1 000個(gè)新生兒中就有2～3名聾兒，其中一半以上是由耳聾基因突變導(dǎo)致的遺傳性耳聾[1]。如果進(jìn)行科學(xué)的干預(yù)和指導(dǎo)，可以幫助這些家庭減少生育(再生育)聾兒的風(fēng)險(xiǎn)。本文就孕前耳聾基因篩查項(xiàng)目對聾人家庭及高危夫婦耳聾基因篩查進(jìn)行了分析和生育指導(dǎo)。

對象與方法

一、對象

選取2014年6月—2015年8月在江蘇省的鎮(zhèn)江、泰興、如皋、高郵、漣水和沭陽6個(gè)項(xiàng)目點(diǎn)進(jìn)行耳聾基因篩查項(xiàng)目檢測的孕前耳聾基因高危人群[2]以及已生育的子女1 203例。入選標(biāo)準(zhǔn)為本人聽力檢測有聽力損失和(或)家族成員有耳聾患者，即耳聾基因高危人群。篩查檢測對象分為聾人904例和非聾人299例，包含聾人家庭中父母和1個(gè)子女(31個(gè)聾人家庭共93例)、父母和2個(gè)子女(5個(gè)聾人家庭共20例)以及耳聾基因高危人群夫婦(夫婦共108對216例)生育(再生育)分析以及夫婦僅一方為耳聾基因高危人群等(874例)研究對象的耳聾基因突變類型。

二、方法

1.標(biāo)本采集：對確定耳聾基因篩查的人群收集標(biāo)本，相對集中實(shí)施標(biāo)本的采集，便于標(biāo)本的集中寄送。采集靜脈血2～3 ml，采血者不需要空腹，血樣標(biāo)本使用抗凝劑為EDTA或枸櫞酸鈉的真空塑料采血管。全血在生物冰袋條件下運(yùn)輸，并在12 h內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，-20 ℃保存，盡量新鮮血液進(jìn)行DNA提取。

2.芯片檢測：采用遺傳性耳聾基因芯片檢測試劑盒(博奧生物有限公司)對GJB2(35 del G、176 del 16、235 del C、299 del AT)、GJB3(538 C>T)、SLC26A4(2168 A>G、IVS7-2 A>G)和線粒體DNA 12S rRNA(1494 C>T、1555 A>G)4個(gè)耳聾相關(guān)基因的9個(gè)致聾突變位點(diǎn)，按照實(shí)驗(yàn)操作流程[3]進(jìn)行檢測和結(jié)果判讀。

3.聽力測試：采用語聲測試法，按WHO聽力損失的標(biāo)準(zhǔn)[4]評估聽力。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS 17.0軟件處理數(shù)據(jù)。統(tǒng)計(jì)方法包括統(tǒng)計(jì)學(xué)描述，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、高危人群中聾人和非聾人篩查檢測結(jié)果比較

在1 203例耳聾基因高危人群中，其中男性599例(49.8%)，平均年齡(25.5±13.5)歲；女性604例(50.2%)，平均年齡(26.7±12.5)歲。通過語聲測試法評估高危人群聽力，其中聾人904例(75.1%)、非聾人299(24.9%)。

經(jīng)芯片檢測，高危人群耳聾基因突變總攜帶率為48.2%(580/1 203)，其中聾人耳聾基因突變總攜帶率為48.0%(434/904)，非聾人為48.8%(146/299)，兩者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表1中陽性表示耳聾基因芯片檢測結(jié)果存在純合(均質(zhì))耳聾基因突變、或復(fù)合耳聾基因突變、或雜合(異質(zhì))耳聾基因突變，陰性表示耳聾基因芯片檢測結(jié)果9個(gè)位點(diǎn)均為野生型。聾人和非聾人單一位點(diǎn)陽性的4個(gè)基因型構(gòu)成比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 高危人群中聾人和非聾人的耳聾基因突變率和基因型構(gòu)成比情況[例(%)]

*P<0.05

二、聾人家庭中父母和1個(gè)子女的篩查檢測結(jié)果

在31個(gè)有聾人的家庭中父親、母親和1個(gè)子女同時(shí)進(jìn)行耳聾基因篩查，篩查檢測結(jié)果的家庭耳聾基因突變類型有21種，見表2。表中的35 del G、176 del 16、235 del C、299 del AT、538 C>T、2168 A>G、IVS7-2 A>G、1494 C>T和1555 A>G分別表示芯片檢測的9個(gè)位點(diǎn)，9個(gè)位點(diǎn)野生型(wildtype at all nine loci)可認(rèn)為正常，純合(homozygous)、雜合(heterozygous)、均質(zhì)(homoplasmic)和異質(zhì)(heteroplasmic)分別表示該位點(diǎn)存在的耳聾基因純合突變、雜合突變、均質(zhì)突變和異質(zhì)突變，其他位點(diǎn)為野生型。

三、聾人家庭中父母和2個(gè)子女的篩查檢測結(jié)果

在5個(gè)有聾人的家庭中父親、母親和2個(gè)子女同時(shí)進(jìn)行耳聾基因篩查，檢測的家庭耳聾基因突變類型見表3。

表2 父母和1個(gè)子女家庭檢測的耳聾基因突變類型

Note: 9 [○] represents wildtype at all nine loci; [∽] represents heterozygous mutation; [∞] represents homozygous mutation; [●] represents homoplasmic mutation

表3 父母和2個(gè)子女家庭檢測的耳聾基因突變類型

Note: 9 [○] represents wildtype at all nine loci; [∽] represents heterozygous mutation; [∞] represents homozygous mutation; [●] represents homoplasmic mutation

四、高危人群夫婦的篩查檢測結(jié)果

耳聾基因篩查高危人群中同時(shí)檢測夫(男方)婦(女方)雙方共108對，夫婦耳聾基因突變有48種組合，合并為11種耳聾基因突變類型：

(1)夫婦的一方為9個(gè)位點(diǎn)均為野生型，另一方為單一位點(diǎn)雜合突變(類型編號3-01)，共17例4種組合(176 del 16雜合1例，235 del C雜合9例，299 del AT雜合1例，IVS7-2 A>G雜合6例)。

(2)夫婦的一方為9個(gè)位點(diǎn)均為野生型，另一方為單一位點(diǎn)純合突變(類型編號3-02)，共9例4種組合(176 del 16純合1例，235 del C純合5例，299 del AT純合2例，IVS7-2 A>G純合1例)。

(3)夫婦的一方為9個(gè)位點(diǎn)均為野生型，另一方為兩個(gè)位點(diǎn)復(fù)合突變(類型編號3-03)，共9例6種組合(176 del 16雜合235 del C雜合2例，176 del 16雜合299 del AT雜合1例，235 del C雜合299 del AT雜合2例，235 del C雜合2168 A>G雜合1例，235 del C雜合IVS7-2 A>G純合1例，2168 A>G雜合IVS7-2 A>G雜合2例)。

(4)夫婦雙方都是單一位點(diǎn)雜合突變(類型編號3-04)，共26例11種組合(176 del 16雜合與235 del C雜合1例，176 del 16雜合與299 del AT雜合2例，雙方235 del C雜合7例，235 del C雜合與299 del AT雜合5例，235 del C雜合與538 C>T雜合1例，235 del C雜合與IVS7-2 A>G雜合2例，雙方299 del AT雜合1例，299 del AT雜合與IVS7-2 A>G雜合1例，538 C>T雜合與2168 A>G雜合1例，2168 A>G雜合與IVS7-2 A>G雜合2例，雙方IVS7-2 A>G雜合3例)。

(5)夫婦的一方為單一位點(diǎn)雜合突變，另一方為單一位點(diǎn)純合突變或兩個(gè)位點(diǎn)復(fù)合突變(類型編號3-05)，共10例6種組合(235 del C雜合與235 del C純合3例，235 del C雜合與235 del C雜合299 del AT雜合1例，299 del AT雜合與235 del C雜合299 del AT雜合1例，2168 A>G雜合與235 del C純合1例，IVS7-2 A>G雜合與235 del C純合2例，IVS7-2 A>G雜合與IVS7-2 A>G純合2例)。

(6)夫婦雙方都是單一位點(diǎn)純合突變或兩個(gè)位點(diǎn)復(fù)合突變(類型編號3-06)，共3例3種組合(235 del C純合與176 del 16雜合235 del C雜合1例，235 del C純合與235 del C雜合299 del AT雜合1例，雙方235 del C雜合299 del AT雜合1例)。

(7)男方線粒體突變和女方9個(gè)位點(diǎn)均為野生型(類型編號3-07)，共10例2種組合(1494 C>T均質(zhì)1例，1555 A>G均質(zhì)9例)。

(8)男方線粒體突變和女方單一位點(diǎn)雜合突變(類型編號3-08)，共1例(1555 A>G均質(zhì)與女方235 del C雜合1例)。

(9)男方線粒體突變和雙方其他突變(類型編號3-09)，共5例4種組合(1555 A>G均質(zhì)235 del C雜合與女方235 del C雜合1例，1555 A>G均質(zhì)與女方235 del C純合2例，1555 A>G均質(zhì)與女方235 del C雜合299 del AT雜合1例，1555 A>G均質(zhì)與女方IVS7-2 A>G雜合1例)。

(10)女方線粒體突變和雙方其他突變(類型編號3-10)，共16例5種組合(1555 A>G均質(zhì)11例，1555 A>G均質(zhì)IVS7-2 A>G雜合與男方235 del C純合1例，1555 A>G均質(zhì)與男方235 del C雜合2例，1555 A>G均質(zhì)與男方235 del C純合1例，1555 A>G均質(zhì)與男方IVS7-2 A>G雜合1例)。

(11)雙方線粒體突變(類型編號3-11)，共2例2種組合(1555 A>G均質(zhì)1例，男方1555 A>G均質(zhì)與女方1555 A>G異質(zhì)1例)。

五、高危人群夫婦的生育(或再生育)風(fēng)險(xiǎn)評估

在以上36個(gè)家庭和108對夫婦中4個(gè)基因9個(gè)位點(diǎn)檢測有37個(gè)耳聾基因突變類型(74種組合)，生育(或再生育)咨詢指導(dǎo)風(fēng)險(xiǎn)分析結(jié)果，子女不攜帶相關(guān)突變基因的為類型編號1-04、2-03和3-07，共有13例；部分子女?dāng)y帶相關(guān)突變基因的為類型編號1-14、1-20、3-01和3-08，共有20例；全部(或>1/2)子女?dāng)y帶相關(guān)突變基因的為類型編號1-02和3-02，共有10例；全部(或>1/2)子女?dāng)y帶相關(guān)突變基因并可能生育聾兒的為類型編號1-01、1-03、1-05、1-06、1-07、1-08、1-09、1-10、1-11、1-12、1-13、1-14、1-15、1-16、1-17、1-18、1-19、1-21、2-01、2-02、2-04、3-03、3-04、3-05、3-06、3-09、3-10和3-11，共有101例。見表4。

表4 生育(或再生育)咨詢指導(dǎo)風(fēng)險(xiǎn)分析

Note: “carrier” refers to child carrying deafness gene mutations, which are inherit from parents; “√” represents fertility risk; “×” represents no fertility risk.

討 論

對有生育或再生育意愿的聾人家庭及高危夫婦進(jìn)行孕前耳聾基因篩查可以了解該人群耳聾基因攜帶狀況，并進(jìn)行生育風(fēng)險(xiǎn)評估[5]、咨詢指導(dǎo)和發(fā)現(xiàn)攜帶耳聾基因后防治[6]。

本研究中高危人群篩查檢測結(jié)果，聾人和非聾人耳聾基因突變攜帶率分別為48.0%和48.8%，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的耳聾患者檢測耳聾基因突變攜帶率，如張旭等報(bào)道的43.6%、胡煜等報(bào)道的44.1%、彭新等報(bào)道的52.2%和王荷溪等報(bào)道的55.2%相接近[7-10]。聾人和非聾人的不同耳聾基因攜帶情況存在差異，聾人攜帶SLC26A4和mtDNA 12S rRNA耳聾基因較多，而非聾人攜帶GJB2耳聾基因較多，差異的原因有待增大人群數(shù)量來確定和分析。研究發(fā)現(xiàn)GJB2缺陷可能通過引起耳蝸發(fā)育異常，毛細(xì)胞退化以及內(nèi)耳蝸電位降低導(dǎo)致先天性耳聾[11-13]。進(jìn)一步分子機(jī)理研究認(rèn)為小鼠中GJB2敲除導(dǎo)致的耳蝸內(nèi)miRNA(如miR-96)的表達(dá)異常可能導(dǎo)致其耳蝸發(fā)育異常[14]，而耳蝸中非感覺性細(xì)胞GJB2表達(dá)降低會(huì)導(dǎo)致影響內(nèi)耳毛細(xì)胞的成熟[15]。GJB3耳聾基因主要表達(dá)于耳蝸螺旋韌帶細(xì)胞的III型纖維細(xì)胞，其導(dǎo)致先天性耳聾的機(jī)制不明[16]。SLC26A4基因編碼的Pendrin蛋白表達(dá)于內(nèi)淋巴管和內(nèi)淋巴囊上皮細(xì)胞及橢圓囊和球囊邊緣的神經(jīng)細(xì)胞中，介導(dǎo)細(xì)胞碳酸氫鈉離子、氯離子和碘離子等的交換。Pendrin蛋白表達(dá)異?？赡芡ㄟ^影響細(xì)胞內(nèi)外陰離子的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而影響聲音傳遞導(dǎo)致遲發(fā)型耳聾[17-18]。關(guān)于mtDNA 12S rRNA突變引發(fā)藥物導(dǎo)致耳聾的病理機(jī)制有兩種假說，一種認(rèn)為12S rRNA突變加劇了線粒體內(nèi)核糖體mRNA的誤讀從而導(dǎo)致線粒體功能失調(diào)[19-20]，另一種認(rèn)為12S rRNA的1555A>G突變引起的12S rRNA的超甲基化與耳聾癥狀具有相關(guān)性[21]。

占遺傳性耳聾70%的非綜合征型耳聾主要為孟德爾單基因遺傳病，按遺傳方式分為常染色體顯性遺傳(DFNA)、常染色體隱性遺傳(DFNB)、X-連鎖(DFNX)、Y-連鎖(DFNY)和線粒體遺傳，其中DFNX較為少見，DFNY罕見報(bào)道[1]，本研究主要探討占約80%DFNB和線粒體遺傳。對于DFNB，聾兒的父母多為擁有正常聽力的突變耳聾基因攜帶者，再次生育其后代25%為耳聾患者。聾兒的每個(gè)同胞有25%的幾率為耳聾患者，50%的幾率是正常聽力的攜帶者，25%為正常人。聾人與正常人婚配的后代100%為攜帶者，聾人與正常聽力的攜帶者的后代50%為耳聾患者，聾人與攜帶相同致聾基因的耳聾患者結(jié)合的后代100%為耳聾患者，男女患病機(jī)會(huì)均等。對于線粒體基因突變導(dǎo)致的耳聾，其再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)率的估計(jì)比較復(fù)雜，帶有突變線粒體DNA(mtDNA)的個(gè)體是否發(fā)病受許多因素影響，與突變的性質(zhì)和嚴(yán)重程度、突變mtDNA所占比例、核基因產(chǎn)物的調(diào)節(jié)以及不同組織細(xì)胞的能量閾值均有一定關(guān)系。對于均質(zhì)性的1555 A>G、1494 C>T突變，符合經(jīng)典的母系遺傳方式，mtDNA的突變可通過母親傳給后代，后代男女均可發(fā)病，但只有女性可將突變的mtDNA繼續(xù)傳給下一代，而男性則不再下傳[1]。

本研究的144例(個(gè)或?qū)?聾人家庭和高危夫婦的檢測中有37個(gè)耳聾基因突變類型(74種組合)，對于這些聾人家庭和高危夫婦可以參考表4給予生育(或再生育)咨詢指導(dǎo)風(fēng)險(xiǎn)分析。其中有101例存在生育聾兒的可能，建議在生育(或再生育)時(shí)進(jìn)行產(chǎn)前診斷，必要時(shí)運(yùn)用胚胎移植前遺傳學(xué)診斷技術(shù)(PGD)或采用臨床其他診療方法，可以減少或避免聾兒的出生。