沙虎鯊血常規(guī)檢查方法及外周血細(xì)胞形態(tài)觀察

羅 清 , 高加卿

(萬達(dá)文化旅游規(guī)劃研究院 ， 北京朝陽100022)

鯊魚在分類學(xué)上屬于軟骨魚綱，板鰓亞綱，側(cè)孔總目。它們的共同特征是骨架由軟骨構(gòu)成，軀體呈流線型，皮膚覆有盾鱗，鰓裂每側(cè)5～7個(gè)，牙齒數(shù)層可更換[1]。在國內(nèi)，幾乎所有的公共水族館均引進(jìn)鯊魚進(jìn)行展示，養(yǎng)殖品種主要有黑鰭鯊、白鰭鯊、檸檬鯊、沙虎鯊、護(hù)士鯊、豹紋鯊、扁鯊、雙髻鯊以及鯨鯊等，但現(xiàn)有的醫(yī)療技術(shù)水平難以滿足鯊魚健康管理的要求，鯊魚一旦患病，飼養(yǎng)管理人員往往感到無能為力?，F(xiàn)階段中國水族館行業(yè)正處于發(fā)展的高峰期，目前國內(nèi)開業(yè)及在建的水族館或海洋樂園已接近200家，人工養(yǎng)殖各種鯊魚的數(shù)量大大增加，臨床病例也越來越多，但常常因缺乏檢查手段而影響診治。血常規(guī)檢查在人類及其他許多動(dòng)物的健康檢查、疾病診治過程中具有不可或缺的價(jià)值，但鯊魚的血常規(guī)檢查，目前國內(nèi)尚未見報(bào)道，國外相關(guān)文獻(xiàn)資料也非常有限。本文以沙虎鯊(Car-chariastaurus)為例，著重介紹鯊魚血常規(guī)檢查的具體操作方法和外周血細(xì)胞形態(tài)，以期為業(yè)內(nèi)相關(guān)人員提供借鑒和參考，使血常規(guī)檢查在鯊魚的健康評(píng)估方面發(fā)揮應(yīng)有的價(jià)值。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 2條成年雌性沙虎鯊，其中1條編號(hào)CT-2，體長(zhǎng)2.8 m，體重約160 kg；另一條編號(hào)CT-5，體長(zhǎng)2.6 m，體重140 kg。這兩條沙虎鯊人工飼養(yǎng)3年以上，試驗(yàn)前1年內(nèi)活動(dòng)、進(jìn)食及排泄等均未見異常。

1.2 儀器及試劑 OLYMPUS CX31生物顯微鏡，TRIAC 420200離心機(jī)，改良Neubauer血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，改良Natt-Herrick稀釋液，Wright-Giemsa染液，Eppendorf移液器等。

2 試驗(yàn)方法

2.1 血液采集 鯊魚采血方法有多種，由于本試驗(yàn)中的沙虎鯊體型較大，為便于操作，特選擇尾部外側(cè)動(dòng)脈進(jìn)行采血。采血時(shí)由4名潛水員手持自制的聚乙烯塑料袋下水捕捉沙虎鯊。待沙虎鯊鉆入塑料袋后，立即卷起袋口并將其拖至水池邊，然后掏出鯊魚尾鰭，使尾部露出水面。局部消毒后用5 mL或10 mL的無菌注射器、20 G(0.9 mm)針頭沿尾部側(cè)線垂直進(jìn)針采血1～2 mL，將血液注入EDTA-K2抗凝管中，混勻后及時(shí)送實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)。

2.2 白細(xì)胞和紅細(xì)胞計(jì)數(shù) 用移液器取Natt-Herrick稀釋液990 μL放入一次性塑料試管中，再加入10 μL抗凝全血，即稀釋100倍。充分混勻后用移液器吸取細(xì)胞懸液，充入改良Neubauer血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)池內(nèi)。靜置2～3 min后置于顯微鏡下用低倍鏡或高倍鏡分別計(jì)數(shù)白細(xì)胞和紅細(xì)胞。白細(xì)胞計(jì)數(shù)區(qū)為四角的4個(gè)大方格，紅細(xì)胞計(jì)數(shù)區(qū)為中央大方格內(nèi)的四角和正中5個(gè)中方格。計(jì)數(shù)時(shí)對(duì)于壓線的細(xì)胞應(yīng)采用數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右的原則，以保證計(jì)數(shù)域的一致性，使計(jì)數(shù)準(zhǔn)確。計(jì)數(shù)后通過換算分別得出白細(xì)胞、紅細(xì)胞總數(shù)[2]。

2.3 紅細(xì)胞比容測(cè)定 紅細(xì)胞比容也稱紅細(xì)胞壓積，測(cè)定時(shí)用毛細(xì)管吸取混勻的抗凝全血，將毛細(xì)管的一端插入膠泥中，封口，然后把毛細(xì)管放在離心機(jī)的比容槽上，以12 000 r/min離心5～10 min，最后測(cè)量毛細(xì)管中壓實(shí)紅細(xì)胞長(zhǎng)度和血液總長(zhǎng)度，計(jì)算其比值。

2.4 血紅蛋白測(cè)定 取20 μL抗凝全血，加入5 mL氰化高鐵血紅蛋白(HiCN)轉(zhuǎn)化液中，充分混勻，以3 000 r/min離心5 min，棄去沉淀，以消除細(xì)胞核的干擾。以標(biāo)準(zhǔn)液校正血紅蛋白儀，然后將待檢樣品吸入儀器進(jìn)行測(cè)定，直接讀數(shù)即得血紅蛋白量，單位為g/L。

2.5 白細(xì)胞分類計(jì)數(shù) 取血液1小滴置于載玻片的一端，用蓋玻片推制血涂片，自然干燥后使用Wright-Giemsa染液進(jìn)行染色。油鏡下分類計(jì)數(shù)100個(gè)白細(xì)胞，得出各種白細(xì)胞所占百分率。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 血常規(guī)檢查結(jié)果 兩條沙虎鯊血常規(guī)檢查結(jié)果見表1。

3.2 紅細(xì)胞形態(tài) 沙虎鯊?fù)庵苎?jīng)改良Natt-Herrick稀釋液稀釋后紅細(xì)胞呈卵圓形，細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，細(xì)胞質(zhì)不著色或染淡紫色，細(xì)胞核染紫紅色(見中插彩版圖1)。血涂片經(jīng)Wright-Giemsa染液染色后成熟紅細(xì)胞大多呈橢圓形，細(xì)胞質(zhì)染淡紅色，細(xì)胞核呈圓形，多居中或稍偏于一側(cè)，染深紫紅色(見中插彩版圖2)。另外，在本試驗(yàn)中可見少量未成熟紅細(xì)胞。未成熟紅細(xì)胞呈圓形或橢圓形，細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)出不同程度的嗜多色性，染成藍(lán)色或藍(lán)灰色，在個(gè)別未成熟紅細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可看到Howell-Jolly體，細(xì)胞核大而居中，染深藍(lán)紫色。

表1 沙虎鯊血常規(guī)檢查結(jié)果

3.3 白細(xì)胞形態(tài) 鯊魚外周血經(jīng)改良Natt-Herrick稀釋液稀釋后粒細(xì)胞染黑紫色；單核細(xì)胞個(gè)體大于其他細(xì)胞，染淡紫色；淋巴細(xì)胞個(gè)體較小，染深紫色，看不到明顯的細(xì)胞質(zhì)(見中插彩版圖1)。血涂片經(jīng)Wright-Giemsa染液染色后，白細(xì)胞可明顯區(qū)分為嗜中性粒細(xì)胞、異嗜性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞6種。各種正常成熟白細(xì)胞形態(tài)如下：嗜中性粒細(xì)胞呈圓形或稍不規(guī)則，細(xì)胞質(zhì)是無色的，內(nèi)含少量嗜中性顆粒或者無明顯顆粒，細(xì)胞核多為1～2葉，染深藍(lán)紫色；異嗜性粒細(xì)胞形狀不規(guī)則，細(xì)胞質(zhì)中有染成粉紅色的細(xì)桿狀顆粒，細(xì)胞核染紫紅色，分1～4葉不等，單個(gè)未分葉核形狀多不規(guī)則。嗜酸性粒細(xì)胞與異嗜性粒細(xì)胞大小相似，細(xì)胞質(zhì)中充滿紅色圓形顆粒，細(xì)胞破碎后嗜酸性顆粒常分散在細(xì)胞核附近，細(xì)胞核一般為1～2葉，2葉居多，染藍(lán)紫色。嗜堿性粒細(xì)胞在鯊魚外周血中很少見[3]，筆者所見嗜堿性粒細(xì)胞呈不規(guī)則形，細(xì)胞質(zhì)中含有一些大而深染的嗜堿性顆粒，細(xì)胞核未分葉。淋巴細(xì)胞按個(gè)體大小可分2～3種，反映了不同的成熟階段[4]，小淋巴細(xì)胞呈圓形，圓形細(xì)胞核染成深藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)很少，通常是在核的外面顯現(xiàn)很窄的邊或鋸齒狀輪廓；大淋巴細(xì)胞形狀不完全規(guī)則，細(xì)胞質(zhì)相對(duì)較多，染淡藍(lán)色。單核細(xì)胞多呈圓形，也有不規(guī)則形，細(xì)胞質(zhì)豐富，染成淡藍(lán)色或灰藍(lán)色毛玻璃樣，有時(shí)可見空泡，細(xì)胞核呈不規(guī)則圓形、腎形或馬蹄形等，核染色質(zhì)疏松染紫紅色(見中插彩版圖2)。

3.4 凝血細(xì)胞形態(tài) 鯊魚外周血經(jīng)改良Natt-Herrick稀釋液稀釋后可見凝血細(xì)胞個(gè)體較小，染色較粒細(xì)胞淺，染淺紫色。血涂片經(jīng)Wright-Giemsa染液染色后，可見凝血細(xì)胞有梭形、橢圓形、圓形等多種形狀，細(xì)胞核多為橢圓形或圓形，染紫紅色至深紫色不等，細(xì)胞質(zhì)較少，染淡紫色。圓形的凝血細(xì)胞與小淋巴細(xì)胞相似，只是核染色質(zhì)相對(duì)疏松著色稍淡，細(xì)胞質(zhì)著色較淺，有時(shí)含有少量嗜酸性顆粒(見中插彩版圖2)。

4 討論

為維持較高的血漿滲透壓以適應(yīng)海水環(huán)境，鯊魚血液中含有高濃度的尿素、氧化三甲胺、鈉離子、氯離子等[5-8]。因此，在進(jìn)行紅細(xì)胞和白細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，特采用改良Natt-Herrick稀釋液(1 000 mL蒸餾水中加入氯化鈉17.38 g，尿素31.5 g，硫酸鈉2.5 g，磷酸氫二鈉2.91 g，磷酸二氫鉀0.25 g，甲基紫2 B 0.1 g，37%甲醛7.5 mL)[9-10]。根據(jù)健康鯊魚外周血中的紅細(xì)胞和白細(xì)胞數(shù)量，一般來說用改良Natt-Herrick稀釋液將全血稀釋100倍進(jìn)行計(jì)數(shù)是比較合適的。若遇到紅細(xì)胞或白細(xì)胞過高的樣本，可增加稀釋倍數(shù)；反之，若紅細(xì)胞或白細(xì)胞過低可降低稀釋倍數(shù)。

鯊魚外周血細(xì)胞與禽類比較接近，紅細(xì)胞、白細(xì)胞和凝血細(xì)胞均含有細(xì)胞核，使用血液分析儀通常無法準(zhǔn)確進(jìn)行血常規(guī)檢查，尤其是紅細(xì)胞總數(shù)、白細(xì)胞總數(shù)及白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)結(jié)果誤差較大，但血紅蛋白和紅細(xì)胞比容檢測(cè)結(jié)果具有一定的參考價(jià)值，若實(shí)驗(yàn)室無血紅蛋白儀和測(cè)定紅細(xì)胞比容的離心機(jī)時(shí)，可嘗試使用血液分析儀測(cè)定這兩項(xiàng)指標(biāo)(因受細(xì)胞核的影響，使用血液分析儀測(cè)定血紅蛋白，結(jié)果通常略偏高)。由于本試驗(yàn)中的樣本量少，也未檢索到沙虎鯊血液學(xué)相關(guān)文獻(xiàn)資料，文中血常規(guī)檢查結(jié)果僅供參考。

關(guān)于鯊魚白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)，目前在國際上尚沒有統(tǒng)一的命名和分類標(biāo)準(zhǔn)，如Arnold將細(xì)胞質(zhì)中含有染成粉紅色細(xì)桿狀顆粒的白細(xì)胞判定為嗜酸性粒細(xì)胞，將凝血細(xì)胞與白細(xì)胞一起分類計(jì)數(shù)[10]。然而，細(xì)胞質(zhì)中含有染成粉紅色細(xì)桿狀顆粒的白細(xì)胞與公認(rèn)的嗜酸性粒細(xì)胞在細(xì)胞質(zhì)顆粒和細(xì)胞核形狀方面都存在明顯差異，依據(jù)禽類的傳統(tǒng)分類方法，筆者將其歸入異嗜性粒細(xì)胞[11]。另外，考慮到檢驗(yàn)人員的操作習(xí)慣，同時(shí)便于臨床醫(yī)師參考，筆者建議在涂片做白細(xì)胞分類時(shí)，勿將凝血細(xì)胞計(jì)數(shù)在內(nèi)。值得一提的是，在沙虎鯊?fù)庵馨准?xì)胞分類時(shí)可見少量嗜中性粒細(xì)胞，筆者以往在企鵝、海龜?shù)葎?dòng)物的白細(xì)胞分類中尚未見到，而沙虎鯊的異嗜性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞及凝血細(xì)胞等在形態(tài)方面與企鵝、海龜較為相似。

國際上有關(guān)鯊魚疾病的報(bào)道越來越多，臨床診斷技術(shù)較以往也有了明顯的進(jìn)步[12]。血常規(guī)檢查是鯊魚臨床疾病診斷中重要的手段之一，血常規(guī)檢查的目的是評(píng)價(jià)其健康狀況，為疾病的診斷、療效觀察、預(yù)后判斷提供依據(jù)，因此，了解各項(xiàng)指標(biāo)的臨床意義亦很重要。白細(xì)胞總數(shù)升高通常與感染及炎癥有關(guān)，白細(xì)胞總數(shù)降低伴隨淋巴細(xì)胞減少或嗜中性粒細(xì)胞升高表明應(yīng)激反應(yīng)或膿毒癥[13-14]。異嗜性粒細(xì)胞類似于哺乳動(dòng)物的嗜中性粒細(xì)胞，具有較強(qiáng)的噬菌功能，對(duì)機(jī)體有重要的保護(hù)作用，感染性疾病、應(yīng)激等可導(dǎo)致異嗜性粒細(xì)胞增多。嗜酸性粒細(xì)胞也可以吞噬細(xì)菌和其他外來物質(zhì)，但吞噬能力沒有異嗜性粒細(xì)胞強(qiáng)。一般認(rèn)為嗜酸性粒細(xì)胞與胃腸道、皮膚、鰓絲的抗原刺激和寄生蟲感染有關(guān)[15]，但也有人認(rèn)為鯊魚嗜酸性粒細(xì)胞升高與寄生蟲感染無關(guān)[16]。因此，關(guān)于鯊魚的嗜酸性粒細(xì)胞功能，尚有待進(jìn)一步研究。嗜堿性粒細(xì)胞在鯊魚外周血中很少見，其功能尚未明確，可能如其他高等脊椎動(dòng)物一樣，參與過敏反應(yīng)。淋巴細(xì)胞具有重要的免疫功能，某些病毒性感染癥可見淋巴細(xì)胞數(shù)量上升，各種引起異嗜性粒細(xì)胞增多的原因均可導(dǎo)致淋巴細(xì)胞相對(duì)減少。在更高等的脊椎動(dòng)物中，單核細(xì)胞可分化成巨噬細(xì)胞，不僅具有強(qiáng)大的吞噬功能，而且在特異性免疫中也發(fā)揮著重要作用，但在鯊魚血液中，其功能尚不清楚，需進(jìn)一步深入研究。紅細(xì)胞總數(shù)、血紅蛋白量、紅細(xì)胞比容以及紅細(xì)胞平均值測(cè)定主要用于評(píng)價(jià)鯊魚的貧血類型或脫水，其臨床意義與哺乳動(dòng)物相似，不再贅述。需要注意的是，不同的鹽度環(huán)境或不同的采血部位，鯊魚的血容量會(huì)有所不同，對(duì)紅細(xì)胞比容測(cè)定有一定影響，進(jìn)而可影響臨床判斷[17-18]。另外，鯊魚的凝血細(xì)胞相當(dāng)于哺乳動(dòng)物的血小板，但是凝血細(xì)胞不僅參與血液凝集，而且也具有免疫功能[19]。

本試驗(yàn)詳細(xì)描述了沙虎鯊血常規(guī)檢查的具體操作方法及其外周血中各種血細(xì)胞的典型形態(tài)，希望能為相關(guān)臨床醫(yī)療人員提供參考借鑒。即使許多水族館或海洋樂園不具備測(cè)定血紅蛋白和紅細(xì)胞比容的條件，僅手工進(jìn)行紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)及白細(xì)胞分類，也能夠獲得重要的鯊魚健康管理數(shù)據(jù)。因此，有必要推廣鯊魚血常規(guī)檢查技術(shù)，使其作為輔助檢查手段之一，在各種鯊魚的健康檢查和疾病診斷中發(fā)揮應(yīng)有的作用。