調(diào)控Nedd4—2泛素化降解上皮離子通道的研究進(jìn)展

張豪 田苗 孫小虎 歐陽露

[摘要] 神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)發(fā)育抑制蛋白4-2（Nedd4-2）是一種泛素-蛋白連接酶，屬于泛素連接酶E3 HECT家族，主要參與蛋白質(zhì)降解過程，在細(xì)胞分化、凋亡等生命活動中發(fā)揮重要作用。上皮鈉離子通道（ENaC）是細(xì)胞膜上的一種糖基化大分子蛋白，在腎臟、肺等組織中，主要調(diào)節(jié)機體Na+的轉(zhuǎn)運、液體的重吸收，其結(jié)構(gòu)、功能異常，與諸多疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。相關(guān)研究表明，Nedd4-2參與ENaC調(diào)節(jié)，從而調(diào)控機體相關(guān)功能。本文通過回顧近幾年國內(nèi)外文獻(xiàn)，總結(jié)了Nedd4-2、ENaC的結(jié)構(gòu)與功能及調(diào)控Nedd4-2泛素化降解ENaC的相關(guān)研究進(jìn)展。

[關(guān)鍵詞] 神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)發(fā)育抑制蛋白4-2；泛素化；上皮鈉通道；研究進(jìn)展

[中圖分類號] R33 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）07（a）-0037-05

Research progress of ubiquitination epithelial sodium channel by the regulation of Nedd4-2

ZHANG Hao1 TIAN Miao2 SUN Xiaohu3 OUYANG Lu4

1.School of Dentistry， Hubei University of Medicine， Hubei Province， Shiyan 442000， China；2.School of Nursing， Hubei University of Medicine， Hubei Province， Shiyan 442000， China； 3.Department of Gynecology， Maternal and Child Health Hospital of Shiyan City， Hubei Province， Shiyan 442000， China；4.Department of Pharmacy， Shiyan Renmin Hospital Affliated to Hubei University of Medicine， Hubei Province， Shiyan 442000， China

[Abstract] Neural precursor cell expressed developmentally down-regulated protein 4-2 （Nedd4-2） is a ubiquitin protein ligase of the E3 HECT family， which is known to bind and regulate a number of membrane proteins， and mediate diverse extracellular signals， such as cell differentiation and apoptosis. Epithelial sodium channel （ENaC） is an integral membrane protein， plays a crucial role in Na+ transport and fluid reabsorption in the kidney and lung， whose structural abnormalities or disfunctions may cause some diseases. At present， Nedd4-2 protein participate in the regulation of ENaC and regulate the function of the body. This paper reviewed the structure and function of the Nedd4-2 and ENaC， and summarized the regulation of ENaC trafficking by Nedd4-2.

[Key words] Neural precursor cell expressed developmentally down-regulated protein 4-2； Ubiquitination； Epithelial sodium channel； Research progress

泛素化在蛋白質(zhì)翻譯后修飾過程中起著重要作用，是內(nèi)源性蛋白質(zhì)降解的主要途徑之一，在調(diào)控細(xì)胞生命活動中發(fā)揮重要作用，其功能失調(diào)與心血管疾病、骨代謝疾病的發(fā)病密切相關(guān)[1]。在泛素化修飾過程中，E3酶是關(guān)鍵酶，能特異性識別底物。E3酶根據(jù)結(jié)構(gòu)可分為3種：E6-相關(guān)蛋白羧基末端同源（homologous to E6-associated protein c-terminus，HECT）家族、環(huán)指E3（RING finger）及U-box家族，神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)發(fā)育抑制蛋白4-2（Nedd4-2）是HECT家族中最大的成員[2]，本文主要探討泛素連接酶Nedd4-2。

上皮鈉離子通道（ENaC）是細(xì)胞膜上的一種糖基化大分子蛋白，存在于肺、腎臟、骨骼等組織，對機體Na+重吸收、維持水鈉平衡、血壓調(diào)節(jié)至關(guān)重要。近年來研究表明，調(diào)控Nedd4-2泛素化降解ENaC，從而參與某些疾病的發(fā)生發(fā)展如急性肺水腫[3]、高血壓[4]等。本文就近年來調(diào)控Nedd4-2泛素化降解ENaC的相關(guān)研究進(jìn)行綜述。

1 泛素（Ubiquitin，Ub）與泛素連接酶Nedd4-2

1.1 Ub

Ub是一種高度保守的多肽，由76個氨基酸構(gòu)成，因在機體中廣泛分布、含量豐富而被稱為Ub。Ub共價結(jié)合于底物蛋白的賴氨酸殘基，被Ub標(biāo)記的蛋白質(zhì)將被特異性地識別并迅速降解。目前，國內(nèi)外普遍認(rèn)為泛素化過程是一個三酶級聯(lián)反應(yīng)，需要3種酶參與：泛素激活酶E1、泛素結(jié)合酶E2、泛素連接酶E3。在ATP提供能量的條件下，E1酶將Ub激活；激活后的Ub與E2酶結(jié)合，同時E3酶特異地識別底物，并引導(dǎo)E2酶將Ub結(jié)合到底物蛋白上，重復(fù)上述過程，當(dāng)?shù)孜镞B接至少4個Ub時，26s蛋白酶將其水解成肽段，并釋放出Ub繼續(xù)參與循環(huán)過程。由于蛋白酶體識別蛋白質(zhì)并將其降解是一個非特異性的過程。因此，E3酶在整個蛋白質(zhì)泛素化過程中發(fā)揮了重要的作用，決定了反應(yīng)的特異性。

1.2 Nedd4-2結(jié)構(gòu)及表達(dá)

Nedd4-2是一種泛素-蛋白連接酶，屬于E3 HECT家族，該家族有9位成員：Nedd4、Nedd4-2、ITCH、SMURF1、WWP1、WWP2、NEDL1和NEDL2[5]。所有的Nedd4 E3成員都具有類似的結(jié)構(gòu)：1個位于N-末端與膜結(jié)合的C2結(jié)構(gòu)域，2～4個負(fù)責(zé)與蛋白-蛋白相互作用的WW結(jié)構(gòu)域及1個位于C-末端負(fù)責(zé)結(jié)合泛素蛋白的HECT結(jié)構(gòu)域[2]。見圖1。

WW結(jié)構(gòu)域由35～40個氨基酸構(gòu)成，具有2個保守的色氨酸殘基，通常WW結(jié)構(gòu)域與靶蛋白的PY（PPxY）模體或底物蛋白的磷酸絲/蘇氨酸殘基結(jié)合[6]。Nedd4-2成員含有多種WW結(jié)構(gòu)域，提示其可與多種蛋白結(jié)合。C2結(jié)構(gòu)域由約120個氨基酸組成的Ca2+結(jié)合區(qū)域，可與磷脂或某些蛋白質(zhì)結(jié)合。HECT結(jié)構(gòu)域是由約350個氨基酸組成催化區(qū)域，分為C-lobe和N-lobe，N-lobe與E2酶結(jié)合，C-lobe包含半胱氨酸受體，其主要負(fù)責(zé)Ub的轉(zhuǎn)移[7]。

進(jìn)化分析表明，Nedd4-2在脊椎動物中的表達(dá)高度保守。人類的Nedd4-2基因位于染色體18q21.31，包含38個外顯子，因而可以轉(zhuǎn)錄多種Nedd4-2-mRNA。在NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索發(fā)現(xiàn)，人類的Nedd4-2至少有17種亞型，它們具有類似的結(jié)構(gòu)：4個WW結(jié)構(gòu)域、C2及HECT結(jié)構(gòu)域[8]。研究發(fā)現(xiàn)，Nedd4-2在肝臟、腎臟、肺等組織中高度表達(dá)[8]。

2 ENaC的結(jié)構(gòu)與功能

ENaC蛋白屬于ENaC/Deg超家族，是細(xì)胞膜上的一種糖基化大分子蛋白。ENaC由α、β、γ 3種同源亞基組成，每個亞基都有2個跨膜區(qū)域（TM1和TM2）、胞內(nèi)的氨基端和羧基端及1個大的細(xì)胞外環(huán)結(jié)構(gòu)[9]，以2α1β1γ四聚體結(jié)構(gòu)為主要組成方式，其中α亞基是主要的功能單位，β和γ亞基為附屬亞基[10]。最近，發(fā)現(xiàn)ENaC還存在δ亞基，并且δ亞基的存在可以增強ENaC的功能[11]。

ENaC屬于非電壓依賴性通道，受細(xì)胞膜上電位變化的影響較小，對Na+的選擇性遠(yuǎn)高于K+，此作用可被特異性抑制劑阿米洛利（Amiloride）及其類似物阻斷。Na+跨膜轉(zhuǎn)運包括兩個步驟：Na+順著電化學(xué)梯度通過極化膜上的ENaC進(jìn)入細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)的Na+再通過基側(cè)膜上的Na+-K+-ATP酶泵出細(xì)胞外。這種活性的跨上皮細(xì)胞Na+轉(zhuǎn)運對于維持水鈉平衡、血容量及血壓起重要作用[9]。近年來研究表明，ENaC失活或阻塞與某些疾病的發(fā)生有關(guān)，如α或β或γ亞基發(fā)生基因突變，導(dǎo)致腎臟遠(yuǎn)曲小管對Na+、水重吸收增強，引發(fā)Liddle綜合征[12]。

3 Nedd4-2對ENaC的調(diào)節(jié)機制

Nedd4-2主要介導(dǎo)離子通道蛋白的泛素化降解過程，其通過WW結(jié)構(gòu)域與靶蛋白的PY模體或底物蛋白的磷酸絲/蘇氨酸殘基相互作用，從而介導(dǎo)靶蛋白降解[8]。ENaC的α、β、γ亞基羧基端有PY模體，Nedd4-2的WW結(jié)構(gòu)域與ENaC的PY模體結(jié)合，從而促使ENaC泛素化，降低細(xì)胞膜上ENaC的表達(dá)[13]。當(dāng)β或γ亞基突變或Nedd4-2被磷酸化時，Nedd4-2與ENaC相互作用減弱，導(dǎo)致ENaC功能異常活躍，血壓升高、腎臟遠(yuǎn)曲小管對Na+重吸收增強，引發(fā)Liddle綜合征[14]。鄧旺等[15]采用胰島素刺激肺泡上皮Ⅱ型細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Nedd4-2蛋白的表達(dá)受到抑制，細(xì)胞膜上的αENaC蛋白的表達(dá)增加，從而加速肺泡內(nèi)液體清除，緩解急性肺損傷。此外，δ亞基未發(fā)現(xiàn)PY模體[16]。

3.1 Usp2-45/Nedd4-2通路

泛素特異性加工酶2-45（ubiquitin-specific protease 2-45，Usp2-45）是Usp2的產(chǎn)物。Usp2因mRNA的選擇性拼接而生成2種亞型，即Usp2-45和Usp2-69，它們具有共同的水解核心[17]。研究發(fā)現(xiàn)，Usp2-45 mRNA在許多組織中均有表達(dá)（除肺與膽囊），其與骨骼肌縱向生長、離子通道活性調(diào)節(jié)有關(guān)[18]。

前期研究證實[19]，Usp2-45可將ENaC去泛素化，減少ENaC被Nedd4-2泛素化降解，增加細(xì)胞膜上ENaC的表達(dá)及活性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這種現(xiàn)象是由于Usp2-45改變了ENaC的構(gòu)象[20]。Oberfeld等[21]認(rèn)為，Usp2-45的N-端和C-端都可與Nedd4-2的HECT域結(jié)合，降低Nedd4-2的活性，減弱Nedd4-2對ENaC的泛素化降解，增加細(xì)胞膜上ENaC的表達(dá)。

3.2 Ndfip2/Nedd4-2通路

Nedd4-2家族交互作用蛋白（Nedd4 family interacting protein 2，Ndfip2）是由Harvey等[22]在2002年發(fā)現(xiàn)的。Ndfip2主要分布于高爾基體、核內(nèi)體及多泡小體，其具有3個跨膜區(qū)域，在C-端具有兩個PY模體，可與Nedd4-2的WW結(jié)構(gòu)域結(jié)合[23]。Shearwin等[24]在研究HEK293T時發(fā)現(xiàn)，Ndfip2的PY模體與Nedd4-2的WW結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從而阻止Nedd4-2與ENaC的結(jié)合，增加細(xì)胞膜上ENaC的表達(dá)。

3.3 cAMP/PKA/Nedd4-2通路

cAMP/PKA/Nedd4-2是調(diào)節(jié)ENaC的一條重要通路。既往認(rèn)為cAMP大多數(shù)生理功能都是通過PKA實現(xiàn)的。cAMP是細(xì)胞內(nèi)第二信使，胞外某些信號分子，如細(xì)胞因子，與G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合后激活腺苷酸環(huán)化酶，催化ATP生成cAMP，從而激活PKA[25]。Snyder等[26]研究發(fā)現(xiàn)，PKA被cAMP激活后，將Nedd4-2磷酸化，阻止Nedd4-2的WW結(jié)構(gòu)域與ENaC結(jié)合，從而減弱Nedd4-2對ENaC泛素化作用。此外，有文獻(xiàn)報道cAMP激活PKA后，環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）上的絲氨酸氨殘基被PKA磷酸化，磷酸化的CREB與轉(zhuǎn)錄共激活因子CREB結(jié)合蛋白結(jié)合到cAMP反應(yīng)元件上，從而增加ENaC的轉(zhuǎn)錄[27]。

3.4 Sgk1/Nedd4-2通路

血清-糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的蛋白激酶（serum and glucocorticoid-inducible kinase，Sgk）屬于AGC家族成員，是一種Ser/Thr蛋白激酶，由N-末端、中間催化結(jié)構(gòu)域及C-末端組成。Sgk有3種同源體：Sgk1、Sgk2和Sgk3，且Sgk2、Sgk3與Sgk1的N末端結(jié)構(gòu)不同[28]。盡管這3種同源體都可以調(diào)節(jié)ENaC的活性，但是目前Sgk1調(diào)節(jié)ENaC研究最為詳細(xì)[28]。

研究發(fā)現(xiàn)，Sgk1參與ENaC活性的調(diào)節(jié)[29]。Nedd4-2有3個氨基酸殘基：Ser-221、Thr-246、Ser-327，它們都是Sgk1的底物。當(dāng)Sgk1與它們結(jié)合時，Nedd4-2被磷酸化，從而減弱Nedd4-2對ENaC的泛素化作用[29]。14-3-3蛋白是一種廣泛存在于真核生物體內(nèi)的酸性蛋白質(zhì)，Sgk1可促進(jìn)Nedd4-2與14-3-3結(jié)合，導(dǎo)致Nedd4-2構(gòu)象發(fā)生改變，從而阻止了Nedd4-2對ENaC的泛素化作用[30]。此外，研究發(fā)現(xiàn)，Sgk1也含有PY模體，可直接與Nedd4-2的WW結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從而促進(jìn)ENaC的活性[31]，提示Sgk1/Nedd4-2可能通過3種方式調(diào)節(jié)ENaC：①Sgk1直接與Nedd4-2的氨基酸殘基結(jié)合，將Nedd4-2磷酸化；②Sgk1可促進(jìn)Nedd4-2與14-3-3結(jié)合；③Sgk1的PY模體與Nedd4-2的WW結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從而阻斷Nedd4-2對ENaC的泛素化，提高細(xì)胞膜上ENaC表達(dá)。

3.5 Akt/Nedd4-2通路

蛋白激酶B（Protein kinase B，PKB或Akt）屬于AGC家族成員，其有3種同源體：Akt1、Akt2、Akt3。Akt是PI3K下游底物，當(dāng)受到胰島素等分子刺激時，PI3K/Akt通路被激活。此時，Akt被活化，并將Nedd4-2磷酸化，從而增強ENaC的活性；當(dāng)PI3K被抑制時，Akt不能被活化，此時Nedd4-2表達(dá)增加[15]。提示Akt通過磷酸化Nedd4-2，減弱Nedd4-2對ENaC的泛素化作用。

3.6 AMPK/Nedd4-2通路

AMP依賴的蛋白激酶（Adenosine 5‘-monophosphate-activated protein kinase， AMPK）是生物能量代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵分子，受AMP/ATP比值調(diào)控，從而調(diào)控能量代謝。當(dāng)骨骼肌收縮或心肌缺血時，AMPK被激活，從而調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞的代謝與血管功能，促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運和脂肪酸的氧化[32]。近年來發(fā)現(xiàn)，AMPK參與了ENaC活性的調(diào)節(jié)。Bhalla等[33]認(rèn)為，當(dāng)受到代謝應(yīng)激刺激時，AMPK被活化，活化的AMPK將Nedd4-2磷酸化，促進(jìn)ENaC的β亞基與Nedd4-2結(jié)合，加快ENaC泛素化降解，從而抑制ENaC的活性。

4 小結(jié)

信號通路調(diào)節(jié)是細(xì)胞生命活動的基礎(chǔ)，同時也是諸多藥物的靶點。本文通過回顧相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)由Nedd4-2介導(dǎo)ENaC泛素化與諸多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如Liddle綜合征，它是一種常染色體顯性遺傳的單基因高血壓病，其臨床表現(xiàn)為早發(fā)的高血壓、低醛固酮血癥等。當(dāng)ENaC的β或γ亞基突變時，Nedd4-2不能與ENaC結(jié)合，使得ENaC不能被正常泛素化降解，導(dǎo)致ENaC功能異?；钴S，Na+重吸收增加，引起Liddle綜合征[14]。然而，目前對Nedd4-2/ENaC通路研究仍然有限。

Na+是體內(nèi)大量存在的陽離子，承擔(dān)著維持機體酸堿平衡，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外水分等重要作用。在骨骼中，Na+含量約占到體內(nèi)總鈉量的50%。據(jù)報道，Na+攝入量的異常與代謝性骨病的發(fā)生密切相關(guān)[34]，而ENaC是調(diào)節(jié)Na+平衡的重要途徑。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，ENaC參與了成骨細(xì)胞活性及功能的調(diào)節(jié)，從而參與骨代謝的調(diào)節(jié)[35]。Nedd4-2/ENaC信號通路是否參與了成骨細(xì)胞活性及功能的調(diào)節(jié)，從而參與骨代謝，目前國內(nèi)外鮮有相關(guān)報道。為此，今后將展開深入研究，探討Nedd4-2/ENaC信號通路與代謝性骨病發(fā)病機制是否存在相關(guān)性，并為代謝性骨病的治療提供理論依據(jù)。

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（收稿日期：2017-11-11 本文編輯：王 娟）