旋毛蟲(chóng)副肌球蛋白在BaculoDirect昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)及鑒定*

王子霞 郝春悅 趙 夕 黃京京 程喻力 諸欣平

(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，北京 100069)

旋毛蟲(chóng)病是一種呈世界性廣泛分布的食源性人獸共患寄生蟲(chóng)病。該病嚴(yán)重影響人體健康及畜牧業(yè)生產(chǎn)，阻止家畜尤其是豬的感染是減少人類患病的重要措施。迄今，尚無(wú)有效的獸用抗旋毛蟲(chóng)疫苗問(wèn)世(Baietal., 2017)。制備有效的旋毛蟲(chóng)抗原是研制疫苗的關(guān)鍵步驟。本課題組前期研究首次發(fā)現(xiàn)并克隆了旋毛蟲(chóng)副肌球蛋白(TsPmy，GenBank登陸號(hào)為EF429310)，并證實(shí)重組蛋白(rTspmy)具有較好的免疫學(xué)活性和免疫保護(hù)性，以及免疫調(diào)節(jié)功能(Sunetal., 2015)。然而，由于前期對(duì)TsPmy的研究基于原核表達(dá)系統(tǒng)，重組蛋白表達(dá)為包涵體形式，即無(wú)活性蛋白聚集體、復(fù)性困難，且原核表達(dá)的宿主E.coli翻譯后修飾功能有限，不能產(chǎn)生N-和O-端糖基化、脂肪酸?；⒘姿峄约岸蜴I等修飾(Dalyetal., 2005)，而這些修飾對(duì)于活性蛋白的生物活性、功能、結(jié)構(gòu)、溶解度等都非常重要，因此限制了對(duì)TsPmy功能的進(jìn)一步研究(范翠英等, 2012)。

目前，常見(jiàn)的真核表達(dá)系統(tǒng)有酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。酵母表達(dá)系統(tǒng)簡(jiǎn)單高效，有的蛋白可分泌至細(xì)胞外，易于純化，但是該系統(tǒng)蛋白產(chǎn)物不均一，具有密碼子偏好，一個(gè)基因能否成功表達(dá)具有較大隨機(jī)性；哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)成本高、操作復(fù)雜、產(chǎn)量低；而昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)以桿狀病毒作為外源基因載體，具備翻譯后修飾功能，例如正確的蛋白折疊、寡聚、磷酸化、糖基化、酰基化、二硫鍵的形成、蛋白水解剪切等，可提高蛋白可溶性，這一系列的特性使其具備成功表達(dá)復(fù)雜結(jié)構(gòu)蛋白的可能。另外，由于桿狀病毒的宿主是無(wú)脊椎動(dòng)物昆蟲(chóng)，不會(huì)感染其他動(dòng)物、植物、人類，故認(rèn)為桿狀病毒的應(yīng)用較為安全，因而被廣泛地應(yīng)用于基因工程、藥物開(kāi)發(fā)、疫苗生產(chǎn)、免疫活性分子和某些致瘤病毒蛋白的表達(dá)以及基因表達(dá)調(diào)控的研究等多個(gè)領(lǐng)域中，其表達(dá)的重組蛋白可具有天然免疫功能(Smithetal., 1983)。迄今為止,已有上千基因在昆蟲(chóng)細(xì)胞或幼蟲(chóng)體內(nèi)得到高效表達(dá)，為獲得大量的類原型蛋白及其功能研究提供了可行性(van Oersetal., 2015)。本研究擬利用昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)rTsPmy，以期獲得生物學(xué)活性較好的重組蛋白，為旋毛蟲(chóng)病疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1桿狀病毒、細(xì)菌、細(xì)胞：Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞購(gòu)自Gibco公司，桿狀病毒購(gòu)自Invitrogen公司，感受態(tài)DH5α菌購(gòu)自北京天根生化科技公司，感受態(tài)DB3.1菌(質(zhì)粒pDONR221)以及大腸桿菌BL21(DE3)菌株來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2主要試劑：TsPmy/pET28 a(含TsPmy基因)由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存；Gateway BP ClonaseII Enzyme Mix and Reagents、BaculoDirect N-Term Transfection Kit、更昔洛韋(gancicovir)購(gòu)自Invitrogen公司，SFX-Insect Media、胎牛血清(FBS)購(gòu)自Hyclone公司，Sf-900 III SFM、Grace′s Medium, unsupplemented、0.25%胰蛋白酶(含0.25%EDTA)購(gòu)自Gibco公司；雙抗(青霉素、鏈霉素)購(gòu)自Sigma公司；小鼠抗TsPmy羧基端單克隆抗體(9G3)(Haoetal., 2014)、人工感染旋毛蟲(chóng)小鼠血清以及人工感染旋毛蟲(chóng)豬血清由本實(shí)驗(yàn)室制備；His單克隆抗體購(gòu)自Gene公司；IRDye 800CW標(biāo)記的羊抗小鼠以及羊抗豬IgG多抗購(gòu)自LI-COR公司；His Bind試劑盒、Protein Refolding試劑盒購(gòu)自Novagen公司。

1.2 方法

1.2.1目的基因attB-Pmy的擴(kuò)增：首先根據(jù)GenBankTsPmy基因的編碼區(qū)全序列2 655 bp(75～2 729 bp)設(shè)計(jì)含attB位點(diǎn)的TsPmy引物，(上游引物P15′-G G G G A C A A G T T T G T A C A A A A A A G C A G G C T T C A T G T C T C T G T A T C G C A G TC-3′，下游引物P2 5′-G G G G A C C A C T T T G T A C A A G A A A G C T G G G T C C T A A T A T T C A T G T C C T T C T TC-3′)，由上海Invitrogen公司合成。擴(kuò)增條件：98 ℃ 5 s；94 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 3 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行0.8 %瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定。

1.2.2重組桿狀病毒的構(gòu)建：利用試劑盒將純化后目的片段與供體載體質(zhì)粒pDONR221(含attP位點(diǎn))進(jìn)行Gateway BP重組反應(yīng)構(gòu)建入門(mén)載體，反應(yīng)條件25 ℃孵育1 h。產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂在含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基平板進(jìn)行篩選，挑取陽(yáng)性菌落進(jìn)行PCR鑒定：95 ℃ 5 s；94 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 3 min。將PCR鑒定陽(yáng)性結(jié)果送至上海Invitrogen公司測(cè)序，選取測(cè)序正確的質(zhì)粒作為入門(mén)載體質(zhì)粒(pDONR221/Ts-Pmy)，利用BaculoDirect N-Term Transfection Kit，通過(guò)BaculoDirect線性DNA與pDONR221/Ts-Pmy進(jìn)行Gateway LR重組反應(yīng)，構(gòu)建重組桿狀病毒DNA(含his tag)，反應(yīng)條件為25 ℃，18 h。

1.2.3重組桿狀病毒轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞：取懸浮培養(yǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(1.5～2.5×106cells/mL)的Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞接種至6孔板(8×105個(gè)/孔)，培養(yǎng)基為Grace′s Insect Medium，Unsupplemented，27 ℃過(guò)夜培養(yǎng)使其貼壁生長(zhǎng)，利用轉(zhuǎn)染試劑CellfectinⅡ Reagent、LR重組反應(yīng)液進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。將重組桿狀病毒DNA導(dǎo)入Sf9細(xì)胞，同時(shí)加入更昔洛韋100 μmol/L進(jìn)行藥物篩選：將六孔板置于濕潤(rùn)、密封、避光的無(wú)菌盒內(nèi)，27 ℃孵育7 d左右，直到出現(xiàn)病毒感染現(xiàn)象，此時(shí)收集培養(yǎng)上清液，作為第1代重組病毒P1，經(jīng)所獲病毒液反復(fù)感染Sf9細(xì)胞，以獲得滴度較高的重組病毒(P3，P4)。

1.2.4重組蛋白的表達(dá)、純化及免疫學(xué)鑒定: 懸浮培養(yǎng)Sf9細(xì)胞(2～4×106cells/mL)，以較高滴度重組病毒感染Sf9細(xì)胞。由于rTspmy為胞內(nèi)表達(dá)，不分泌至細(xì)胞培養(yǎng)上清，且BaculoDirect線性DNA在外源基因插入位點(diǎn)后有6個(gè)連續(xù)的his-tag序列，因此，分別于感染后0、24、48、72 h收集細(xì)胞沉淀，通過(guò)超聲破碎法制備細(xì)胞裂解液，以低溫高速離心(4 ℃, 10 000×g)分離沉淀和上清，應(yīng)用SDS-PAGE及Western blotting進(jìn)行表達(dá)時(shí)相、表達(dá)量以及可溶性分析，其中Western blotting一抗為his tag單克隆抗體(1∶5000)。大量懸浮培養(yǎng)Sf9細(xì)胞，于重組病毒感染后96 h收集細(xì)胞沉淀，通過(guò)超聲破碎細(xì)胞，采用His Bind試劑盒、Protein Refolding試劑盒對(duì)rTsPmy進(jìn)行純化、復(fù)性，步驟參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。使用抗旋毛蟲(chóng)單克隆抗體9G3(1∶20 000)、人工感染旋毛蟲(chóng)小鼠血清(1∶2 000)以及人工感染旋毛蟲(chóng)豬血清(1∶2 000)分別作為一抗，對(duì)純化后的rTsPmy進(jìn)行免疫學(xué)鑒定。

2 結(jié)果

2.1 TsPmy重組桿狀病毒的構(gòu)建與表達(dá)

2.1.1AttB位點(diǎn)連接的TsPmy基因產(chǎn)物(AttB-Pmy)構(gòu)建成功：TsPmy基因編碼區(qū)全序列 2 655 bp，引入attB位點(diǎn)后，大小為2 718 bp，為下一步構(gòu)建入門(mén)載體做準(zhǔn)備。P1、P2引物擴(kuò)增出的片段大小與目的片段長(zhǎng)度吻合(圖1)。

圖1 Pmy基因PCR擴(kuò)增Fig.1 The amplification of TsPmy gene by PCRM: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1: TsPmy基因PCR產(chǎn)物；2: 陰性對(duì)照(H2O作為模板)。M: DNA marker; 1: PCR product of TsPmy gene; 2: Negative control (template was H2O).

2.1.2入門(mén)載體質(zhì)粒(pDONR221/TsPmy)鑒定以及測(cè)序: BP重組反應(yīng)構(gòu)建入門(mén)載體質(zhì)粒(pDONR221/TsPmy)，轉(zhuǎn)化之后，挑取pDONR221/TsPmy的陽(yáng)性菌落，以TsPmy的引物P1、P2進(jìn)行菌落PCR，陽(yáng)性菌落擴(kuò)增片段大小約2.7 kb，擴(kuò)增后測(cè)序結(jié)果顯示均含有陽(yáng)性重組質(zhì)粒pDONR221/TsPmy，重組質(zhì)粒序列經(jīng)BLAST比對(duì)，顯示完全匹配，沒(méi)有突變或缺失。通過(guò)LR反應(yīng)構(gòu)建重組桿狀病毒DNA。

2.1.3重組桿狀病毒DNA鑒定： 以重組桿狀病毒DNA為模板，利用桿狀病毒線性DNA多角體基因部分為上游引物，TsPmy 3′端作為下游引物，進(jìn)行PCR，并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳。結(jié)果顯示擴(kuò)增片段位于3 000 bp左右，與預(yù)期值相符(圖2)。表明TsPmy基因已轉(zhuǎn)座到BaculoDirect線性DNA上，得到了重組病毒DNA。

圖2 重組病毒DNA的PCR鑒定Fig.2 Identification of recombinant viral DNA by PCRM: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1: TsPmy特異性引物鑒定的PCR產(chǎn)物；2:陰性對(duì)照(H2O作為模板)。M: DNA marker; 1: PCR product of recombinant viral DNA with TsPmy specific primer; 2: Negative control (template was H2O).

2.2 重組病毒感染昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf9

以P4重組病毒感染Sf9，感染后每隔24 h在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)。如圖3所示，于轉(zhuǎn)染后48 h細(xì)胞出現(xiàn)病毒感染的病理征象：細(xì)胞核變圓、變大，細(xì)胞體積增大，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)囊泡、顆粒，增殖速度減慢；72 h大多數(shù)細(xì)胞已停止增殖，96 h細(xì)胞開(kāi)始裂解(圖3)。在72～96 h收集細(xì)胞沉淀，以獲得重組蛋白；在96 h后或細(xì)胞裂解后收集培養(yǎng)上清，以獲得重組病毒。

2.3 rTsPmy的表達(dá)時(shí)相分析及Western blotting鑒定

BaculoDirect線性DNA在rTsPmy基因插入位點(diǎn)后有6個(gè)連續(xù)的his-tag序列，重組病毒感染Sf9細(xì)胞，rTsPmy為胞內(nèi)表達(dá)，不分泌至細(xì)胞培養(yǎng)上清。本實(shí)驗(yàn)分別取24、48、72 h病毒感染Sf9細(xì)胞，經(jīng)SDS-PAGE電泳、考馬斯亮蘭染色以及Western blotting分析(His單抗作為一抗)，結(jié)果顯示，感染后24 h，rTsPmy尚未表達(dá)；48 h，在全細(xì)胞裂解液沉淀及上清rTsPmy均有表達(dá)，可見(jiàn)此時(shí)rTsPmy呈現(xiàn)部分可溶性表達(dá)，可溶表達(dá)量較少；72 h時(shí)，rTsPmy表達(dá)量明顯增加，但全細(xì)胞裂解液上清中未見(jiàn)目的條帶，可見(jiàn)此時(shí)rTsPmy已經(jīng)基本呈不可溶表達(dá)，目的條帶為110 kDa處特異條帶，與插入片段編碼蛋白質(zhì)的理論值相符，未感染的Sf9細(xì)胞在相應(yīng)處無(wú)特異條帶(圖4)。

圖3 重組病毒感染的昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf9形態(tài)學(xué)變化(400×)Fig.3 Morphological changes of recombinant virus-infected Sf9 cellsA. 未感染重組病毒的Sf9細(xì)胞在0、24、48、72 h的狀態(tài)；B. 重組病毒感染的Sf9細(xì)胞在0、24、48、72 h的狀態(tài)。Sf9細(xì)胞為懸浮培養(yǎng)，圖中箭頭所指為出現(xiàn)囊泡、顆粒的細(xì)胞。Uninfected Sf9 cells (A) and infected Sf9 cells (B) in 0，24，48，72 h. Sf9 cells were suspended in culture medium. Arrows refer to the Sf9 cells with vesicles and granules.

圖4 TsPmy的表達(dá)時(shí)相分析及Western blotting鑒定Fig.4 SDS-PAGE and Western blotting analysis of expression of rTsPmyA. 用SDS-PAGE的方法分析rTsPmy的表達(dá)時(shí)相。M: 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1: 未感染Sf9全細(xì)胞裂解液(1%SDS)作為陰性對(duì)照；2-5: 分別為Sf9細(xì)胞感染重組病毒24、48、72、96 h后全細(xì)胞裂解液(1%SDS)。B. 用Western blotting的方法分析rTsPmy的表達(dá)，一抗為his tag單克隆抗體，二抗IRDye 800CW標(biāo)記的羊抗小鼠多克隆抗體。M: 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1: 未感染Sf9細(xì)胞全細(xì)胞裂解液(1%SDS)；2-4: 分別為Sf9細(xì)胞感染重組病毒48 h后全細(xì)胞裂解液(1%SDS)、細(xì)胞裂解液沉淀(1%SDS)、細(xì)胞裂解液上清(PBS)；5-7: 分別為Sf9細(xì)胞感染重組病毒72 h后全細(xì)胞裂解液(1%SDS)、細(xì)胞裂解液沉淀(1%SDS)、細(xì)胞裂解液上清(PBS)；8-9: 分別為Sf9細(xì)胞感染重組病毒96 h后全細(xì)胞裂解液(1%SDS)、細(xì)胞裂解液沉淀(1%SDS)、細(xì)胞裂解液上清(PBS)。A. SDS-PAGE analysis of Sf9 cell lysate. M: Molecular markers; 1: Uninfected Sf9 cell lysate (1%SDS) as a negative control; 2-5: Infected Sf9 cell lysate harvested at 24, 48, 72, 96 h after infection (1%SDS). B. Western blotting analysis of Sf9 cell lysate. Samples were detected by anti-his tag monoclonal antibody. The cell lysates were separated as precipitation and supernatant with high speed centrifugation (4 ℃, 10 000×g). M: Molecular size markers; 1：Uninfected Sf9 cell lysate (1%SDS) as negative control; Infected Sf9 cell lysate harvested at 48 h(2-4),72 h(5-7) and 96 h (8-10) after infection respectively (2,5,8 cell lysate (1%SDS); 3,6,9 precipitation (1%SDS); 4,7,10 supernatant (PBS)).

2.4 rTsPmy的純化及鑒定

由于rTsPmy在昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中可溶表達(dá)量較少，因此選擇沉淀部分進(jìn)行his鎳柱純化，并復(fù)性。SDS-PAGE電泳后，在約110 kDa處可見(jiàn)單一條帶，經(jīng)his tag單抗以及本實(shí)驗(yàn)室制備的9G3單克隆抗體檢測(cè)，在約110 kDa處可見(jiàn)單一條帶(圖5)。

圖5 rTsPmy的純化及鑒定Fig.5 Purification and identification of rTsPmyA. SDS-PAGE檢測(cè)rTsPmy純化結(jié)果。純化方法為his鎳柱純化。M: 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1: 純化rTsPmy； 2: 感染Sf9細(xì)胞裂解液。B. 用Western blotting方法鑒定純化rTsPmy。M: 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1: 一抗為his tag單克隆抗體，二抗IRDye 800CW標(biāo)記的羊抗小鼠多克隆抗體; 2： 一抗為9G3單克隆抗體，二抗IRDye 800CW標(biāo)記的羊抗兔多克隆抗體。A. SDS-PAGE analysis of purified rTsPmy. M: Molecular size markers; 1: Purified rTsPmy; 2: Infected Sf9 cell lysate. B. Identification of rTsPmy by Western blotting. M: Molecular size markers; 1: Purified rTsPmy detected by anti-his tag monoclonal antibody; 2: Purified rTsPmy detected by 9G3 monoclonal antibody.

圖6 rTsPmy與不同陽(yáng)性血清的Western blotting鑒定Fig.6 The antigenicity of rTsPmy by Western blottingM: 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1: 人工感染旋毛蟲(chóng)豬血清；2: 人工感染旋毛蟲(chóng)小鼠血清；3:正常豬血清；4: 正常小鼠血清。M: Molecular markers; 1: rTsPmy recognized by infected swine sera; 2: rTsPmy recognized by infected mice sera; 3: rTsPmy recognized by normal swine sera; 4: rTsPmy recognized by normal mice sera.

2.5 rTsPmy免疫學(xué)特性鑒定

Western blotting結(jié)果顯示，rTsPmy能被人工感染旋毛蟲(chóng)的豬抗血清、小鼠抗血清所識(shí)別，重組蛋白對(duì)陰性對(duì)照血清(正常豬血清，正常小鼠血清)均未出現(xiàn)識(shí)別信號(hào)，表明rTsPmy具有抗原特異性(圖6)。

3 討論

副肌球蛋白是多種無(wú)脊椎動(dòng)物的肌纖維蛋白，例如軟體動(dòng)物、環(huán)節(jié)動(dòng)物、節(jié)肢動(dòng)物等，它存在于蟲(chóng)體平滑肌、皮下以及部分寄生蟲(chóng)體表，還可以分泌至體外(Schmitzetal., 1996)。旋毛蟲(chóng)副肌球蛋白有較好的免疫學(xué)活性且具有免疫保護(hù)作用，在免疫接種小鼠獲得36.2%的肌幼蟲(chóng)減蟲(chóng)率，是一個(gè)重要的疫苗候選蛋白(Yangetal., 2008)。TsPmy在原核表達(dá)系統(tǒng)中出現(xiàn)的不完全表達(dá)、純化效果不佳、有內(nèi)毒素污染且為包涵體沉淀形式等問(wèn)題，這些問(wèn)題的存在限制了對(duì)TsPmy功能的深入研究。為了進(jìn)一步深入研究TsPmy的功能，本實(shí)驗(yàn)利用昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了rTsPmy，且經(jīng)純化后能被感染血清有效識(shí)別，提示經(jīng)該表達(dá)系統(tǒng)獲得的rTsPmy具有較好的抗原性。相對(duì)于原核表達(dá)系統(tǒng)而言，昆蟲(chóng)桿狀表達(dá)系統(tǒng)具備明顯的優(yōu)勢(shì)，包括：該表達(dá)系統(tǒng)無(wú)內(nèi)毒素污染，有較完善的轉(zhuǎn)錄、翻譯后加工修飾功能，使得重組蛋白生物學(xué)活性高；表達(dá)過(guò)程中無(wú)血清培養(yǎng)有利于重組蛋白的純化等。相較于其他真核表達(dá)系統(tǒng)而言，它可在多角體啟動(dòng)子控制下高效表達(dá)，蛋白產(chǎn)量相對(duì)較高(秦順晴等, 2012)。另外，本實(shí)驗(yàn)選用BaculoDirect桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，不同于傳統(tǒng)的Bac to Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，避免了大腸桿菌冗長(zhǎng)耗時(shí)的定向轉(zhuǎn)座或昆蟲(chóng)細(xì)胞中長(zhǎng)時(shí)間的同源重組，而是使用了快速的Gateway重組反應(yīng)來(lái)獲得轉(zhuǎn)染所需的重組桿狀病毒，節(jié)省了制備重組病毒需要的數(shù)天時(shí)間，加快了研究進(jìn)程，而且，Gateway克隆技術(shù)十分靈活，方便了將來(lái)載體的替換。

應(yīng)用昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)獲得rTsPmy，可避免內(nèi)毒素的污染，且his單抗檢測(cè)顯示單一條帶，避免了原核表達(dá)系統(tǒng)出現(xiàn)的不完全表達(dá)，后期應(yīng)用親和層析柱純化效果較好。但應(yīng)用昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)獲得的rTsPmy也存在一定局限性，雖然優(yōu)化表達(dá)溫度和時(shí)間可以獲得一定量的可溶性rTsPmy，但是通過(guò)該表達(dá)系統(tǒng)獲得的rTsPmy主要為不可溶形式，可能是由于副肌球蛋白是多聚體結(jié)構(gòu)蛋白，分子量較大，本身易以不可溶形式存在(Liuetal., 1998)的原因。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)獲得了翻譯后修飾更加完善、純化效果較好的rTsPmy，其生物學(xué)活性更適于深入研究TsPmy的功能，該研究為制備有效的旋毛蟲(chóng)病疫苗候選抗原分子提供了生物學(xué)基礎(chǔ)。