埃及伊蚊表皮結構基因AaCPR100A序列特征和表達特性分析*

陳 靜 張 磊 盧浩然 從軍灝 商子昂 廖承紅 韓 謙

(海南大學熱帶農林學院，海南?？?570228)

昆蟲表皮由蠟質層和幾丁質層組成，具有抵御病原體入侵和不利環(huán)境傷害，支持和維持身體活動的重要作用。研究表皮合成機制，尋找干擾昆蟲表皮合成的方法，可用于控制害蟲 (Charles, 2010)。迄今為止，表皮蛋白(cuticular protein, CP)被分為13個不同的蛋白家族(Willis, 2010; Ioannidouetal., 2014; Liaoetal., 2017)。最大的家族是CPR家族，包含RR氨基酸序列，CPR家族可分成3個亞族，RR-1、RR-2和RR-3(Andersen, 1998, 2000; Karouzouetal., 2007)。普遍把RR-1型的CPR歸類于柔性表皮。但也有例外，發(fā)現RR-1基序在昆蟲表皮中參與成蟲蛻變時剛性表皮的分化(Soaresetal., 2007)。RR-2基序蛋白主要分布在硬表皮(Vanninietal., 2017)，RR-3比較少見，目前還沒有精確的定義(Andersen, 2000; Futahashietal., 2008; Willis, 2010)。埃及伊蚊Aedesaegypti是一種廣泛分布于全球熱帶地區(qū)的重要媒介蚊蟲，傳播登革熱和城市型黃熱病等疾病，是國際公認最危險的蚊蟲之一。對埃及伊蚊表皮蛋白的研究，不僅可揭示其表皮發(fā)育和形成機制，還能為傳染病防治提供理論指導。

本研究擬對埃及伊蚊表皮發(fā)育過程差異基因AaCPR100A(AAEL003049)進行生物信息學分析和表達模式分析，旨在為深入研究該基因在表皮形成過程中的功能及作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試蚊蟲

埃及伊蚊Ae.aegypti(利物浦株系)由軍事醫(yī)學研究院微生物流行病研究所提供，飼養(yǎng)條件為: 室溫 26 ℃±1 ℃、相對濕度 60%±5%、光周期為14 L∶ 10 D (光照: 黑暗)。幼蟲以老鼠飼料飼養(yǎng)，成蟲以8% 糖水飼養(yǎng)。

1.2 生物信息學分析

利用BLAST對AaCPR100A氨基酸序列進行序列分析，構建該蛋白與其他昆蟲的系統(tǒng)發(fā)育關系，并分析其同源性(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。在線分析AaCPR100A的分子量、氨基酸組成(ExPASy，http://us.expasy.org)和信號肽位點(SignalP4.0，http://www.cbs.dtu.dk)(Bendtsenetal., 2004)。運用ScanProsite(http://prosite.expasy.org)(de Castroetal., 2006)分析該蛋白基序。在埃及伊蚊基因組上進行blast(http://www.vectorbase.org)分析，確定該基因的內含子和外顯子。采用ClustalX(vesion 1.83)(Thompsonetal., 2002)軟件與岡比亞按蚊Anophelesgambiae、白紋伊蚊Ae.albopictus、致倦庫蚊Culexquinquefasciatus和果蠅Drosophilamelanogaster的基因序列進行比對，MAGA6.0軟件(Tamuraetal., 2013)的鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 總RNA提取和反轉錄

蚊蟲所有齡期樣品為4個生物學重復，每個重復的樣品數目為：卵20只，1齡幼蟲20只，2齡幼蟲20只，3齡幼蟲10只，4齡幼蟲10只，蛹期5只，雄蟲5只和雌蟲5只。解剖雌性成蟲獲得的頭、胸、中腸和表皮為4個生物學重復，每個重復的樣品數目為10只。

采用磁珠法提取RNA，所用的磁珠通過0.1%的DEPC水溶液處理過夜后用滅菌鍋消毒。取埃及伊蚊的4個發(fā)育時期(成蟲、蛹、幼蟲、卵)和4個不同組織(頭、胸、中腸、皮)樣品，分別加入200 μL的Trizol裂解液(InvitrogenTM)和適量的磁珠，放入研磨器中打磨4 min，使細胞充分裂解，提取樣品的總RNA；為了避免基因組DNA對定量結果的影響，利用TakaRa公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒對RNA進行去基因組DNA的處理，并進行總RNA反轉錄。

1.4 熒光定量PCR檢測不同發(fā)育階段和組織中的表達量

以埃及伊蚊的3-磷酸脫氫酶基因GAPDH(XM_011494724)為內參基因，采用qRT-PCR檢測AaCPR100A基因在不同發(fā)育時期和不同組織的表達特征。根據AaCPR100A和GAPDH序列自行設計定量引物，見表1。

表1 引物序列

熒光定量PCR反應體系為：cDNA 2 μL；2×SYBR premix Ex TaqTM10 μL；PCR forward/Reverse primer(10 μmol/L)各0.4 μL；DEPC水6.8 μL。使用Roche公司的LightCycler96進行實時擴增檢測。反應采用兩步法PCR擴增標準程序：95 ℃ 20 s；95℃5 s；58 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。

根據各組擴增的CT值，采用定量PCR儀數據處理程序，以2- △△ Ct法(Livaketal., 2001)分析基因表達水平計算樣品間基因表達量的差異倍數，根據數據做柱形圖。采用 SPSS13.0統(tǒng)計學軟件方差分析(ANOVA)(Tamuraetal., 2013)進行數據的統(tǒng)計，采用 LSD 法進行多重比較檢驗，顯著性檢驗水平P<0.05。

2 結果

2.1 埃及伊蚊AaCPR100A的序列特征和同源性分析

根據埃及伊蚊AaCPR100A的cDNA序列在埃及伊蚊基因組上的信息，克隆得到該基因的開放閱讀框，其cDNA編碼區(qū)全長765 bp，編碼254個氨基酸，推測其蛋白分子量為28.6 kDa。氨基酸分析結果顯示AaCPR100A蛋白含有19種不同的氨基酸組成，其中谷氨酰胺占15.4%、脯氨酸占11.4%，丙氨酸11%。蛋白結構域分析表明，進行Blastp檢索和ScanProsite工具檢索，AaCPR100A有一個Chitin-binding type R&R domain，位于蛋白的40～101位氨基酸(圖1)。N末端具有信號肽，約為16個氨基酸。

圖1 AaCPR100A的蛋白結構域分析Fig.1 Protein domain analysis of AaCPR100A in Aedes aegypti

將AaCPR100A的氨基酸序列在NCBI數據庫中進行同源序列比對分析，發(fā)現與白紋伊蚊、淡色庫蚊、岡比亞按蚊和果蠅的相似性分別為95%、72%、61%、54%。采用Clustal進行多序列比對，結果顯示保守區(qū)段主要集中在Chitin-binding type R&R結構域。利用clustal1.81 軟件和MEGA7.0.26 軟件以NJ法生成系統(tǒng)進化樹進行Bootstrap 檢測。結果顯示，在分析的所有序列中，AaCPR100A與白紋伊蚊的進化地位最接近(圖2)。

圖2 AaCPR100A與其他物種的CPR100A氨基酸序列系統(tǒng)進化樹分析Fig.2 Phylogenetic tree of Aedes aegypti and other species based on the amino acid sequences of their AaCPR100A

2.2 AaCPR100A基因的組織表達特性

以3-磷酸甘油醛脫氫酶GAPDH基因為內參，分別對埃及伊蚊頭、胸、中腸和表皮以及不同發(fā)育階段的表達水平進行定量PCR檢測。組織定量結果表明AaCPR100A在4種組織中均有表達，但相比頭部，在表皮中的表達豐度值達到42倍，其次在中腸中表達為2倍，腦的最低。由此可見，該基因的表達具有顯著的組織差異性，在表皮中表達豐度最高(圖3)。

圖3 成蟲不同組織AaCPR100A的表達情況分析Fig.3 Expression patterns of AaCPR100A in different tissues of of Aedes aegypti三次獨立實驗統(tǒng)計分析，數據是平均值±SE；柱上標有不同字母表示顯著性差異(P<0.05)。Data are mean±SE; Histograms with different letters indicate significant difference (P<0.05).

在不同發(fā)育階段，AaCPR100A的表達呈現出顯著差異性(圖4)。隨著發(fā)育階段的推移，該基因的表達量呈減少趨勢。卵的表達量與其他發(fā)育階段具顯著性差異，表達量最高，從2齡幼蟲開始，與雄性成蚊的表達量相當。而雌性成蚊的略有所增加(圖4)。該結果說明AaCPR100A的表達具有明顯的發(fā)育階段特異性，可能對于蚊蟲早期表皮的形成起到重要的作用，并且可能與雌性成蚊腹部存儲血液相關。

圖4 AaCPR100A在埃及伊蚊不同齡期的表達量Fig.4 Expression of AaCPR100A in the different stages of Aedes aegypti數據是平均值±SE; 柱上標有不同字母表示顯著性差異(P<0.05)Data are mean±SE; Histograms with different letters indicate significant difference (P<0.05).

3 討論

昆蟲表皮是昆蟲抵御外界不良環(huán)境的第一道防線，獨特的表皮是各種昆蟲能成功生存于生物圈中的重要機理之一，不同的發(fā)育階段均會產生新的表皮，且以不同的形式分布在昆蟲身體內外，從本質上確保了昆蟲的成功進化，反之昆蟲表皮的獨特性也使其成為殺蚊劑和蟲媒控制的靶標(Luzetal., 2005)。

同時，表皮也是蚊蟲抗藥性形成的重要屏障。研究發(fā)現，在抗吡蟲啉殺蟲劑的幼蟲和成蟲中,AaCPR100A基因的表達均比敏感型蟲體的表達高，幼蟲比成蟲的表達更顯著(Riazetal., 2013)?？孤染挣ヮ悮⑾x劑的庫蚊Cx.quinquefasciatus品系表皮中有兩個蛋白表達上調，分別屬于RR-2和CPLC類型(Reidetal., 2012)。電鏡掃描結果顯示不吉按蚊Anophelesfunestus對卞氯菊酯產生抗性后，表皮增厚，藥物穿透能力明顯減弱，同時還發(fā)現抗性雌蚊的表皮厚度比抗性雄蚊表皮厚(Woodetal., 2010)。綜合以上研究，表明昆蟲可能會通過上調表皮蛋白基因的表達來合成更多的表皮蛋白，用以增厚表皮，減少殺蟲劑向體內滲透，以提高其抗藥性。對埃及伊蚊表皮基因的研究，將有助于我們了解這類基因在蚊蟲柔性表皮發(fā)育及在雌性成蚊中的功能，并為其最終應用于蚊蟲的生物防控提供了理論根據。

根據埃及伊蚊蛋白數據庫，已發(fā)現成蚊和蛹的表皮蛋白分別有32和60個被命名，也有許多蛋白被標記為假定的表皮蛋白(Neneetal., 2007)。另外，一些預測蛋白被歸類為柔性或剛性表皮蛋白。表皮蛋白和幾丁質在不同特性和皮層中分布不同，由于幾丁質分子鏈長和乙?；潭鹊牟町愝^小，因此表皮蛋白基因種類和數量的變化成為影響表皮結構及其機械性能的重要因素，表皮蛋白也被認為是昆蟲重要的結構蛋白(Andersenetal., 1995; Liaoetal., 2017)。本研究基于前期研究的基礎，對AaCPR100A基因的序列和時空表達分析，發(fā)現該基因在蚊蟲的卵期發(fā)育過程轉錄水平明顯高于幼蟲和成蟲期，雌性成蚊高于雄性成蚊，并具有一定的組織特異性，這可能不僅參與了蚊蟲早期表皮結構的形成，而且在雌性成蟲中也發(fā)揮重要作用。根據結構域的分析，AaCPR100A具有CPR家族中的RR-1基序，而RR-1亞族表皮蛋白首先是從柔性表皮中分離得到，現在普遍把RR-1型的CPR歸類于柔性表皮。雌性蚊子的腹部往往需要能容納下與其體重等同的血液，因此，形成具有保護作用的高度彈性的表皮對它尤其重要。因此，我們推測AaCPR100A可能參與了蚊蟲柔性表皮的形成，這將在之后的功能研究中進一步探討。