登革1型和2型病毒混合感染樣本的一步法實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立*

孫愛娟 林立豐 蘭策介 劉欽梅 高 劍 周 潔 李春曉石清明 邢 丹 張恒端 董言德 郭曉霞** 趙彤言**

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)，安徽合肥 230032； 2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，媒介生物危害和自然疫源性疾病北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100071; 3. 廣東省疾病預(yù)防控制中心， 廣東廣州 511430)

登革熱(Dengue fever, DF)/重癥登革熱(Severe dengue, SD)是由登革病毒(Dengue virus, DENV)引起的重要的蚊媒傳染病。埃及伊蚊Aedesaegypti和白紋伊蚊Ae.albopictus是主要的傳播媒介，主要流行于熱帶和亞熱帶地區(qū)(WHO，2009)。登革病毒屬于黃病毒科黃病毒屬，根據(jù)表面抗原的不同分為4個(gè)血清型(DENV-1～DENV-4)(Kautneretal.，1997)。近年來，氣候變化、城市化及旅游業(yè)的快速發(fā)展等為登革熱的傳播和擴(kuò)散提供了更快捷、便利的條件，使登革熱的流行區(qū)域不斷擴(kuò)大(Naishetal.，2014;Thisyakornetal.，2015)，新的血清型登革病毒株輸入到已有登革熱流行的區(qū)域，使得同一個(gè)地區(qū)存在多個(gè)血清型登革病毒的混合流行(Saldaetal.，2005；Sharpetal.，2014；Reddyetal.，2017)，致使多個(gè)血清型登革病毒混合感染患者數(shù)量逐年增加并伴隨著重癥登革熱患者人數(shù)的增加。特別是2014年我國(guó)廣東省暴發(fā)了有史以來最為嚴(yán)重的登革1型和2型病毒混合傳播流行(Zhaoetal.，2016)，引起了人們的廣泛關(guān)注。本研究旨在建立檢測(cè)登革1型和2型病毒混合樣本的一步法熒光定量PCR方法，為登革熱的診斷和預(yù)測(cè)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 毒株、細(xì)胞

登革1型和2型病毒均由廣東省疾病預(yù)防控制中心提供，在本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)乳鼠腦傳代，保存于-80 ℃冰箱。登革3型、4型病毒、黃熱病毒和甲型H3N2流感病毒的病毒核酸由美萊博公司提供。白紋伊蚊C6/36細(xì)胞：含8%胎牛血清的RPMI Medium 1640培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)，28 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)。BHK-21細(xì)胞：含8%胎牛血清的DMEM(Dulbeecco’s Modified Eagle Medium)培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)，37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)。

1.2 主要儀器與試劑

Roche LightCycler?480II 實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(德國(guó)Roche公司)、QIAamp 病毒RNA提取試劑盒(凱杰生物工程股份有限公司)、登革1型病毒C基因和登革2型病毒C基因重組質(zhì)粒由北京天一輝遠(yuǎn)公司合成、RPMI Medium 1640 basic培養(yǎng)基(Gibco 公司)、胎牛血清、Gibco DMEM basic培養(yǎng)基(Gibco 公司)、低熔點(diǎn)瓊脂(美國(guó) sigma公司)、CO2培養(yǎng)箱(Nuaire公司)Premix Ex TaqTM(Probe qPCR), Bulk由Takara公司生產(chǎn)(貨號(hào)：RR390 L)、RNaseOUTTMRecombinant Ribonuclease Inhibitor由thermo fisher公司生產(chǎn)(貨號(hào)：10777019)、MuLV Reverse Transcriptase由 thermo fisher生產(chǎn)(貨號(hào)：N8080018)。

1.3 引物和探針的設(shè)計(jì)與合成

分別針對(duì)登革1型病毒C基因和登革2型病毒C基因保守區(qū)，使用Primer Premier 5.0自行設(shè)計(jì)引物和探針(表1)，由上海生工生物工程公司合成。登革1型和2型病毒的探針5′端標(biāo)記的熒光基團(tuán)分別為FAM和HEX。

表1 登革1型和2型病毒的引物及探針序列

1.4 陽性模板核酸的制備

取1×108copies/μL 含目的基因擴(kuò)增序列的登革1型和2型病毒基因重組質(zhì)粒，按10倍倍比稀釋，分別獲得1×108～1×101copies/μL的檢測(cè)樣品。

1.5 一步法實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)

反應(yīng)體系：PremixExTaqTM(Probe qPCR)，Bulk 15 μL、RNaseOUTTMRecombinant Ribonuclease Inhibitor 0.3 μL、MuLV Reverse Transcriptase 0.3 μL、登革1型和2型病毒的上、下游引物(50 μmol/L)各0.2 μL、登革1型和2型病毒的探針(50 μmol/L)各0.2 μL、ddH2O 3.2 μL、模板核酸10 μL。反應(yīng)條件是:50 ℃ 30 min；95 ℃ 15 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，共40 個(gè)循環(huán)，分別根據(jù)FAM和HEX 熒光信號(hào)判定結(jié)果。

1.6 一步法實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的特異性和敏感性測(cè)試

用上述建立的一步法實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)登革1～4型病毒、黃熱病毒及甲型H3N2流感病毒的RNA，用于檢驗(yàn)特異性；檢測(cè)登革1型和2型病毒濃度為1×108～1×101copies/μL基因重組質(zhì)粒，確定該方法的最低檢測(cè)拷貝數(shù)；基因重組質(zhì)粒按1×108～1×102copies/μL稀釋，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算3次之間的平均CT值及各梯度濃度的變異系數(shù)，檢驗(yàn)穩(wěn)定性。

1.7 混合感染登革1型和2型病毒樣本的制備及檢測(cè)

BHK-21細(xì)胞接種到12 孔板中培養(yǎng)至單層，將制備好的登革1型和2型病毒懸液分別按10 倍梯度等比稀釋，按0.2 mL/孔接種到12孔板中，15 min/次進(jìn)行搖勻，37 ℃孵育1.5 h，加入1 mL 2%低熔點(diǎn)瓊脂與2×DMEM培養(yǎng)基混合物(1∶1)覆蓋，待凝固后置培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，6 d后用結(jié)晶紫染色后計(jì)算空斑數(shù)。

C6/36細(xì)胞按2.5×105/孔轉(zhuǎn)移到6孔板中，28 ℃ 5 % CO2培養(yǎng)24 h后接種病毒，實(shí)驗(yàn)分為3組：登革1型病毒感染組、登革2型病毒感染組、登革1型和2型病毒混合感染組。每組按感染復(fù)數(shù)MOI=1(2.5×105PFU/孔)接種病毒，37℃ 5%CO2，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1.5 h后吸出病毒懸液上清，RPIM 1640培養(yǎng)液清洗兩次，然后加入2 mL 2%FBS的RPIM 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)36、48、60、72、84、96、120 h后吸取100 μL病毒上清， -80 ℃保存?zhèn)溆茫?取樣后加入100 μL的維持液于各培養(yǎng)孔內(nèi)補(bǔ)齊至2 mL，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。按照RNA提取試劑盒說明書提取收集的病毒上清RNA，用上述建立的一步法實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)C6/36混合感染登革1型和2型病毒后不同時(shí)間的病毒拷貝數(shù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS 19.0軟件，采用配對(duì)t檢驗(yàn)，分別分析登革1型和2型病毒單獨(dú)感染和混合感染時(shí)不同時(shí)間點(diǎn)樣本的拷貝數(shù)之間有無差異。

2 結(jié)果

2.1 一步法實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的特異性

用上述建立的一步法實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)登革1～4型病毒、黃熱病毒及甲型H3N2流感病毒的RNA，結(jié)果只有登革1型和2型病毒出現(xiàn)典型的S型擴(kuò)增曲線，黃熱病毒及甲型H3N2流感病毒未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，特異性較好(圖1)。

圖1 登革1型和2型病毒的擴(kuò)增曲線Fig.1 Amplification curves of DENV-1(FAM) and DENV-2(HEX) 1. DENV-1; 2. DENV-2.

圖2 不同稀釋度登革1型病毒陽性模板核酸的擴(kuò)增曲線Fig.2 Amplification curves of DENV-1 RNA positive standards at different dilution rates 1∶1×108；2∶1×107；3∶1×106；4∶1×105；5∶1×104；6∶1×103；7∶1×102.

2.2 一步法實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的靈敏度和重復(fù)性

用上述建立的一步法實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)登革1型和2型病毒基因重組質(zhì)粒，拷貝數(shù)分別為1×108～1×101copies/μL，結(jié)果顯示登革1型和2型病毒的最低檢測(cè)限度均為1×102copies/μL(圖2, 3)。登革1型病毒標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖4)的斜率為-3.41，相關(guān)系數(shù)0.993，登革2型病毒標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖5)的斜率為-3.280，相關(guān)系數(shù)0.995，均具有良好的線性關(guān)系。上述1×108～1×102copies/μL濃度梯度的基因重組質(zhì)粒不同時(shí)間重復(fù)檢測(cè)3次，登革1型病毒的變異系數(shù)在0.22%～1.45%之間(表2)，登革2型病毒的變異系數(shù)在0.21%～0.70%之間(表3)，該方法檢測(cè)的重復(fù)性較好。

圖3 不同稀釋度登革2型病毒陽性模板核酸的擴(kuò)增曲線Fig.3 Amplification curves of DENV-2 RNA positive standards at different dilution rates1∶1×108；2∶1×107；3∶1×106；4∶1×105；5∶1×104；6∶1×103；7∶1×102.

表2 登革1型病毒檢測(cè)時(shí)各梯度濃度的Ct 值及變異系數(shù)Tab.2 Ct value and coefficient of variation of each concentration of DENV-1

表3 登革2型病毒檢測(cè)時(shí)梯度濃度的Ct值及變異系數(shù)

圖4 不同稀釋度登革1型病毒陽性模板核酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 The standard quantitative curve of DENV-1 RNA positive standards at different dilution rates

2.3 C6/36混合感染登革1型和2型病毒后病毒復(fù)制動(dòng)態(tài)檢測(cè)

根據(jù)上述建立的方法，檢測(cè)兩個(gè)不同血清型登革病毒混合感染C6/36細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)病毒拷貝數(shù)的變化(圖6)。三次重復(fù)的變異系數(shù)最大值為14.68%(<15%)，可認(rèn)為具有較好的重復(fù)性，結(jié)果可行。使用配對(duì)t檢驗(yàn)：登革1型和2型病毒混合感染C6/36細(xì)胞后，登革1型病毒的拷貝數(shù)與單獨(dú)感染的拷貝數(shù)相比，無顯著差異，使用配對(duì)t檢驗(yàn)，在36～60 h時(shí)，登革1型和2型病毒混合感染C6/36細(xì)胞后，登革2型病毒的拷貝數(shù)與單獨(dú)感染C6/36細(xì)胞的拷貝數(shù)相比無顯著差異，在72 h時(shí)，混合感染時(shí)登革2型病毒的拷貝數(shù)與單獨(dú)感染時(shí)相比顯著下降(t=5.161,P=0.036)，同樣的，在84～120 h時(shí)混合感染時(shí)登革2型病毒的拷貝數(shù)與單獨(dú)感染時(shí)相比顯著下降。

圖5 不同稀釋度登革2型病毒陽性模板核酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 The standard quantitative curve of DENV-2 RNA positive standards at different dilution rates

圖6 登革1型和2型病毒單獨(dú)與混合感染C6/36細(xì)胞的復(fù)制動(dòng)態(tài)Fig.6 The replication capicity of DENV-1 and DENV-2 when infected C6/36 cells singly and simultaneouslyA. 登革1型病毒單獨(dú)與混合感染C6/36細(xì)胞時(shí)的復(fù)制動(dòng)態(tài);B.登革2型病毒單獨(dú)與混合感染C6/36細(xì)胞時(shí)的復(fù)制動(dòng)態(tài)。A. Replication capacity of DENV-1 in C6/36 cells when infected with DENV-1 singly and DENV-1, DENV-2 simultaneously; B. The replication capacity of DENV-2 inC6/36 cells when infected DENV-1 singly and DENV-1, DENV-2 simultaneously.

3 討論

近年來，隨著登革熱流行范圍的擴(kuò)大，不同血清型登革病毒輸入到已有登革熱流行的區(qū)域，導(dǎo)致同時(shí)存在多個(gè)血清型登革病毒流行的地區(qū)增多，致使多個(gè)血清型登革病毒混合感染患者逐年增長(zhǎng)并伴隨著重癥登革熱患者人數(shù)的增加，使得多個(gè)血清型病毒混合感染病例的診斷和預(yù)防面臨挑戰(zhàn)(Anoopetal.,2010)。因此，建立快速、準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)室診斷方法對(duì)登革熱患者的診斷和疫情控制具有重大意義。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)因靈敏性與特異性高且可定量等優(yōu)勢(shì)而被廣泛應(yīng)用于各種病原體檢測(cè)(侯美如等，2013)，其中多重?zé)晒舛縋CR因能夠分型且減少操作帶來的污染等特點(diǎn)，在許多領(lǐng)域得到了應(yīng)用。

本研究分別針對(duì)登革1型和2型病毒C基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)合成引物和探針，建立了一步法實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。該檢測(cè)方法是特異的，可檢測(cè)出登革1型和2型病毒，且和登革3型、4型病毒以及黃熱病毒、流感病毒均無交叉反應(yīng)，可用于登革病毒的檢測(cè)及分型，對(duì)登革1型和2型病毒的最低限度均為102copies/μL，靈敏度較高，重復(fù)性好。該方法，可用于登革熱患者的早期診斷。與ELISA(Waggoneretal.，2013)等其他方法相比，操作簡(jiǎn)便，耗時(shí)較少。同時(shí)，該方法可一次性檢測(cè)混合感染登革1型和2型病毒的樣本，并可對(duì)病毒拷貝進(jìn)行定量，為登革熱的診斷和預(yù)測(cè)提供技術(shù)支撐。