基于線粒體COⅠ基因序列進(jìn)行庫蠓亞屬(雙翅目：蠓科)近似種的分子鑒定*

岑?；?徐宗意 韓曉靜 常瓊瓊 段 琛 侯曉暉

(遵義醫(yī)學(xué)院，貴州遵義 563000)

庫蠓屬(CulicoidesLatreille, 1809)是我國蠓科三大吸血蠓屬之一，該屬昆蟲個體微小、種類繁多，廣泛分布于世界各地。迄今為止，全世界吸血蠓已知4屬1 671種，我國已知3屬443種(Borkent, 2016; 常瓊瓊等, 2017)。吸血蠓不僅可刺吸血液、叮咬人畜，還可作為媒介傳播多種病毒，如藍(lán)舌病病毒(BTV)、施馬倫貝格病毒(SBV)、家畜流行性出血熱病毒(EHDV)、非洲馬瘟病毒(AHSV)等(Purse, 2015)，這些病毒可引發(fā)家畜流行病造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，如歐洲BT和SB大流行等(Saegermanetal., 2008;Hoffmannetal., 2012)。另外，藍(lán)舌病(BT)和非洲馬瘟病(AHS)已被列入世界動物衛(wèi)生組織(OIE)優(yōu)先考慮的15種疾病之中(Perrinetal., 2006)。

蠓科昆蟲的傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定方法往往依賴形態(tài)結(jié)構(gòu)完整的成蟲，性別差異、非成蟲階段以及形態(tài)殘缺蟲體的鑒定往往也比較困難，有時甚至無法鑒定。同時，庫蠓形態(tài)變異較大，近似種的鑒定往往十分困難。例如，庫蠓亞屬中的刺螫庫蠓C.punctatus、灰黑庫蠓C.pulicaris和新替庫蠓C.newsteadi以及它們中還存在諸多由形態(tài)特征相似的隱種組成的復(fù)組或種團(tuán)(灰黑庫蠓種團(tuán)和新替庫蠓種團(tuán))(Pagesetal., 2009)等，這無疑使其近緣、近似種的鑒別變得更為艱難。線粒體DNA一般為不含間隔區(qū)和內(nèi)含子的雙鏈環(huán)狀，且作為核外遺傳信息載體，具有結(jié)構(gòu)簡單、無重復(fù)序列、母系遺傳、進(jìn)化速度快等特點，是研究昆蟲群體分子分類、遺傳結(jié)構(gòu)、分子系統(tǒng)發(fā)育的理想分子標(biāo)記(Liuetal., 2013)，且已應(yīng)用于多種昆蟲類群的分子鑒定研究(賀驥等，2014；胡澤章等，2017；陳珊等，2017)，極大地彌補(bǔ)了傳統(tǒng)形態(tài)分類學(xué)鑒定的不足。雖然蠓科昆蟲的分子分類研究起步較遲，但進(jìn)展迅速。自1992年變翅庫蠓Culicoidesvariipennis種群的基因差異研究開始(Tabachnick, 1992)，國際上有關(guān)蠓科昆蟲的分子生物學(xué)研究突飛猛進(jìn)(Augotetal., 2010; Anderetal., 2013; Denisetal., 2013; Sturetal., 2014)，為開展蠓科昆蟲的分子分類技術(shù)研究奠定了堅實基礎(chǔ)。相比之下，國內(nèi)有關(guān)蠓科昆蟲的分子分類學(xué)研究卻鮮有報道。因此，本研究以庫蠓亞屬中刺螫庫蠓C.punctatus、灰黑庫蠓C.pulicaris和新替庫蠓C.newsteadi3個形態(tài)近似種為例，分析COⅠ分子分類方法應(yīng)用于鑒別不同生境的庫蠓近似種的可行性，為蠓蟲分類及其相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 蠓蟲標(biāo)本及采集

于2014—2016年赴貴州、廣西、四川、重慶、黑龍江等5省市進(jìn)行蠓蟲采集，并置于無水乙醇中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩１狙芯窟x擇4種、50個庫蠓的COⅠ分子數(shù)據(jù)，其中荒川庫蠓C.arakawai和刺螫庫蠓C.punctatus數(shù)據(jù)來自研究組采集的標(biāo)本，而灰黑庫蠓C.pulicaris和新替庫蠓C.newsteadi數(shù)據(jù)來自于GenBank數(shù)據(jù)庫，具體信息見表1。

表1 供試庫蠓的相關(guān)信息

續(xù)表1 Tab.l Continued

1.2 主要儀器和試劑

光學(xué)體式顯微鏡(德國Leica公司)、PCR擴(kuò)增儀(美國BOI-RAD公司)、UVP凝膠成像系統(tǒng)(美國BOI-RAD公司)等?；蚪M提取試劑盒(QIAGEN, 德國)、PCR MasterMix(TIANGEN, 中國)、引物(上海捷瑞生物工程有限公司)、瓊脂糖凝膠回收試劑盒(TIANGEN, 中國)、瓊脂糖(Biowest Agarose, 西班牙)等。

1.3 標(biāo)本鑒定

按照常規(guī)方法對蠓蟲標(biāo)本進(jìn)行分選、解剖，除胸部外制成永久裝片用于形態(tài)鑒定，胸部樣本單獨編號后進(jìn)行分子實驗。根據(jù)虞以新(2005)對本研究的庫蠓進(jìn)行種類鑒定，并進(jìn)行一側(cè)翅的拍照。

1.4 基因組DNA提取

將保存的蠓蟲胸部研磨后，按照QIAGEN DNeasy Blood & Tissue Kit說明書進(jìn)行單只蠓蟲基因組DNA提取，并保存至-20 ℃。

1.5 PCR擴(kuò)增

按照通用引物(上游引物L(fēng)CO1490：5′- T A A A C T T C A G G G T G A C C A A A A A A T CA -3′和下游引物HCO2198：5′- G G T C A A C A A A T C A T A A A G A T A T T GG -3′)進(jìn)行COⅠ序列的擴(kuò)增(Folmeretal., 1994)，引物終濃度為10 pmol/μL，模板DNA為1.5 μL，反應(yīng)總體系為25 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳條帶判斷是否為目的條帶。按照瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明書進(jìn)行PCR產(chǎn)物切膠純化，純化后的產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行雙向測序。

1.6 COⅠ序列分析

利用Clustal X、DNAMAN、MEGA 6.0、Mrbayes v3.1.2、Modeltest v3.7等生物信息學(xué)軟件對庫蠓線粒體DNA COⅠ序列進(jìn)行比對、編輯、比較等分析，以Kimura雙參數(shù)模型計算遺傳距離矩陣。以荒川庫蠓C.arakawai為外群，通過鄰接法(NJ)、最大似然法(ML)和貝葉斯法(Bayes)構(gòu)建分子系統(tǒng)樹。根據(jù)Bootstrap 1 000次自舉檢驗確定NJ和ML系統(tǒng)樹中各結(jié)點的置信值。采用Mrbayes v3.1.2構(gòu)建Bayes樹，通過Modeltest v3.7估算的最優(yōu)模型為 TVM+G，具體的替換模型參數(shù)設(shè)置為核苷酸替換類型數(shù)=6(nst=6)；設(shè)置位點間速率變異呈gamma分布(rates=invgamma)；對MCMC變量運行4條馬爾科夫鏈，以隨機(jī)樹為起始樹，共運行1百萬代(ngen=1000000)，每1000代進(jìn)行一次抽樣(samplefreq=1000)；在去掉老化樣本后，應(yīng)用剩余的樣本構(gòu)建系統(tǒng)樹，將所得結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計，得到Bayes樹的支系結(jié)構(gòu)以及各支系的后驗概率。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩兩比較采用兩獨立樣本t檢驗，P﹤0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)特征比較

刺螫庫蠓C.punctatus、灰黑庫蠓C.pulicaris和新替庫蠓C.newsteadi等3種近似種的形態(tài)特征十分相近。在3種雌性庫蠓形態(tài)特征中，除胸部特征外，頭部和腹部的6個形態(tài)特征基本一致(表2)；在胸部翅斑分布的8個形態(tài)特征中，除第1前緣暗斑是否延伸超過中2室的1/2、翅臀室淡斑數(shù)目以及中1室和中2室的暗斑是否相互連接等極細(xì)微的差異外幾乎無異(圖1)。同時，在3種雄性庫蠓的尾器部分，存在第9腹板后緣凹陷、陽莖中葉呈柱狀和抱器基節(jié)粗壯、內(nèi)側(cè)緣有一簇刺狀鬃和陽基側(cè)突基部分離、中部稍長、端部細(xì)分枝等多處相似之處(表2中未列出)。因此，由于這些極其相似的形態(tài)學(xué)特征使得上述種類在進(jìn)行形態(tài)學(xué)分類時變得異常艱難。

圖1 本研究中庫蠓近似種的左側(cè)翅圖Fig.1 The left wing of sibling species in this study1. 刺螫庫蠓C. punctatus；2. 灰黑庫蠓C. pulicaris；3. 新替庫蠓C. newsteadi.

2.2 PCR擴(kuò)增及序列測定

本研究通過對4種、18個地理種群的50只庫蠓線粒體COⅠ基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增、純化和雙向測序，并經(jīng)過序列比對及人工校對后，最終獲得長度約394 bp的COⅠ基因片段。

2.3 序列比對

將本研究中獲得的全部荒川庫蠓C.arakawai和刺螫庫蠓C.punctatus的COⅠ序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中同源序列進(jìn)行比對，搜索到的同源序列登錄號分別為AB360975.1(荒川庫蠓C.arakawai)和AB360989.1(刺螫庫蠓C.punctatus)的同源序列，前者與荒川庫蠓(GX-2/SC-1/SC-2/GZ-2)的序列相似度均大于99%，與荒川庫蠓(CQ-1/GZ-1/GX-1)的序列相似度為100%；后者與刺螫庫蠓C.punctatus的序列相似度均大于98%。

2.4 遺傳距離

利用MEGA 6.0軟件計算庫蠓COⅠ序列的遺傳距離(詳見附表一)。結(jié)果表明，種內(nèi)和種間遺傳距離分別為0.000～0.014和0.181～0.234，兩者差異顯著。同時，通過采用兩獨立樣本t檢驗統(tǒng)計分析，種內(nèi)組為0.007±0.007，種間組為0.202±0.019，統(tǒng)計結(jié)果為P﹤0.05，故兩者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。因此，通過COⅠ序列遺傳距離分析可以區(qū)分刺螫庫蠓C.punctatus、灰黑庫蠓C.pulicaris、新替庫蠓C.newsteadi等庫蠓近似種，提示COⅠ序列可用于庫蠓的種類鑒別。

2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

本研究選擇與刺螫庫蠓C.punctatus等3個近似種處于不同亞屬(二囊亞屬)的荒川庫蠓C.arakawai為外群，采用鄰接法(NJ)、最大似然法(ML)和貝葉斯法(Bayes)分別構(gòu)建4種庫蠓的系統(tǒng)發(fā)育樹，得到基本一致的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(圖2～3)。系統(tǒng)發(fā)育樹聚類分析表明：在NJ樹、ML樹和 Bayes樹中，荒川庫蠓C.arakawai、刺螫庫蠓C.punctatus、灰黑庫蠓C.pulicaris和新替庫蠓C.newsteadi等4種不同庫蠓各自構(gòu)成單系(群)，同一種不同地理種群各自聚為一支，且4種不同庫蠓種類間無交叉，與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致。由圖2可以看出，灰黑庫蠓C.pulicaris和新替庫蠓C.newsteadi首先聚合在一起形成一支，繼而與同為庫蠓亞屬的刺螫庫蠓C.punctatus聚類為一大支，最后與以荒川庫蠓C.arakawai為外群的二囊亞屬匯合，形成完整的有根樹。

圖2 基于線粒體COⅠ序列構(gòu)建的ML樹Fig.2 Maximum Likelihood tree constructed based on mitochondrial COⅠ sequence注：各分支上的數(shù)字為自舉檢驗置信值1000次。Note: Numbers on each node are the values of bootstrap 1000 replicates.

圖3 基于線粒體COⅠ序列構(gòu)建的Bayes樹Fig.3 The Bayes tree constructed based on mitochondrial COⅠ sequence注:各分支上數(shù)字為后驗概率。Note: Numbers on each node are posterior probability value.

3 討論

從Hebert等提出COⅠ基因是DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因以來(Hebertetal., 2003)，COⅠ基因在蠓蟲的分子分類和系統(tǒng)發(fā)育等方面得到廣泛應(yīng)用(Slamaetal., 2014; Bellisetal., 2015)，并可有效鑒別95%的已知庫蠓種(Anderetal., 2013)。COⅠ基因在很大程度上彌補(bǔ)了傳統(tǒng)形態(tài)分類學(xué)在鑒定非成蟲期及形態(tài)殘缺標(biāo)本時的不足。在面對高度近似種時，單純形態(tài)分類的不足就顯得尤為突出(Nolanetal., 2007)。本研究基于形態(tài)學(xué)特征和COⅠ分子標(biāo)記數(shù)據(jù)對目前極易產(chǎn)生誤判的庫蠓屬庫蠓亞屬的3個高度近似種進(jìn)行分析，研究結(jié)果顯示形態(tài)學(xué)和分子數(shù)據(jù)之間具有高度的一致性，這表明能從分子水平上利用COⅠ基因序列之間的變異快速準(zhǔn)確地鑒別刺螫庫蠓C.punctatus、灰黑庫蠓C.pulicaris和新替庫蠓C.newsteadi這3個高度近似種，這也進(jìn)一步證實了線粒體COⅠ基因序列在庫蠓近似種的分類鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析方面具有較高的應(yīng)用價值。

就庫蠓近似種遺傳距離的研究結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)不僅種內(nèi)遺傳距離(0.000～0.014)遠(yuǎn)小于種間遺傳距離(0.181～0.234)，而且種內(nèi)最大遺傳距離(灰黑庫蠓C.pulicaris：0.014)亦小于種間最小遺傳距離(新替庫蠓C.newsteadi與刺螫庫蠓C.punctatus：0.181)，此3種的種內(nèi)遺傳距離和種間遺傳距離之間無重疊，足以區(qū)分這3個庫蠓物種。經(jīng)計算，平均種間遺傳距離(0.202)約為平均種內(nèi)遺傳距離(0.007)的29倍，符合Hebert等提出的種間差異大于種內(nèi)差異10倍的物種鑒定規(guī)則(Hebertetal.，2004)，這說明線粒體COⅠ基因是一種理想的分子標(biāo)記，適用于庫蠓近似種之間的種類鑒別。同時，結(jié)果還顯示采集自貴州、四川、重慶、海南和黑龍江等5個不同生境中的刺螫庫蠓C.punctatus的種內(nèi)遺傳距離均不超過0.005；而采集自貴州遵義地區(qū)的刺螫庫蠓C.punctatus(GZ-12/GZ-13/GZ-101/GZ-103)和荒川庫蠓C.arakawai(GZ-1/GZ-2)的種間遺傳距離卻為0.206。這既說明刺螫庫蠓C.punctatus為一廣布種，同時也證實了同一物種不同地理種群之間的個體差異小，而不同物種即使是在同一生境下也會由于生態(tài)隔離的存在而具有較大的種間個體差異。這與Augot等(2013)關(guān)于翅痣庫蠓C.stigma和帕羅庫蠓C.parroti兩庫蠓屬近似種的研究結(jié)果大致相同。

就庫蠓近似種系統(tǒng)發(fā)育樹的建樹結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)以二囊亞屬的荒川庫蠓C.arakawai為外群構(gòu)建的庫蠓亞屬3種近似種的NJ樹、ML樹和Bayes樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)是大體一致的。但由于不同建樹方法的理論基礎(chǔ)以及建樹的偏向性方面所存在差異，導(dǎo)致在物種種內(nèi)親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近上存在微小的差異，這與Gomulski等(2006)基于rDNA-ITS2序列探討庫蠓亞屬及其近緣種的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系所得出的結(jié)論是一致的。同時，庫蠓近似種的聚類分析與其形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果是一致的，且近似種間各分支都有較高的置信值，說明應(yīng)用線粒體COⅠ基因構(gòu)建的分子進(jìn)化樹能分析庫蠓近似種之間的親緣關(guān)系且可靠程度較高。然而，在種內(nèi)一些分支上亦存在相對較低的置信值，如灰黑庫蠓C.pulicaris個體之間的置信值中有3個置信值低于50，這在李瑋瑋等(2009)對小蔗螟的分析研究中也出現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象。究其原因可能是由于COⅠ序列堿基組成及變異速度存在差異以及COⅠ序列片段提供的有效信息有限所致，如研究中所用的只有50個樣本，并且經(jīng)過Clustal W比對和人工校對后的COⅠ基因序列長度為394 bp，在一定程度無法提供較為全面的有效信息。故在后續(xù)的研究中，應(yīng)從提供更豐富的樣本數(shù)量和更全面有效信息序列等方面著手。

目前，已有大量研究表明在對雙翅目(搖蚊科、麻蠅科)昆蟲進(jìn)行分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析時聯(lián)合線粒體DNA、核糖體DNA以及形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行綜合比較分析，其研究結(jié)果比僅用線粒體COⅠ基因進(jìn)行分析得到的結(jié)果更為理想，更有研究表明聯(lián)合COⅠ基因和其他分子標(biāo)記基因進(jìn)行類群鑒定的成功率可高達(dá)99% (Guoetal., 2011; Carewetal., 2013)。這說明聯(lián)合多個互補(bǔ)基因序列以及形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)綜合分析可得到更為全面、準(zhǔn)確的種類鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果。與此同時，也有研究發(fā)現(xiàn)COⅠ基因在某些類群的分子系統(tǒng)學(xué)研究中并不適用，如腔腸類動物和馬達(dá)加斯加蛙類等(Hebertetal.，2003)，以及核基因組中線粒體假基因(NUMTs)的存在，也會對庫蠓分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析的結(jié)果造成一定程度的干擾。正因如此，新的分子標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用也逐漸得到了研究工作者的廣泛關(guān)注，如編碼蛋白基因CAD序列已證實其在很大程度上更有利于分析昆蟲的進(jìn)化關(guān)系(Moultonetal., 2004; Wiegmannetal., 2009)，且在庫蠓的分子系統(tǒng)學(xué)研究中價值亦如此(Bellisetal.，2013；Bellisetal.，2014)。因此，結(jié)合多個形態(tài)學(xué)特征和多個分子標(biāo)記進(jìn)行庫蠓的物種鑒定和系統(tǒng)發(fā)育將更具前途。