一測多評(píng)法測定復(fù)方白芷止痛膠囊中4種指標(biāo)成分

黃廣偉 楊素德 曹婧迪

摘要：目的 以歐前胡素為內(nèi)標(biāo)物，建立測定復(fù)方白芷止痛膠囊中阿魏酸、綠原酸、異歐前胡素多種指標(biāo)性成分含量的一測多評(píng)方法。方法 采用HPLC，色譜柱為Thermo Hypersil GOLD（4.6 mm×250 mm，5 ?m），以乙腈-0.2%甲酸為流動(dòng)相，梯度洗脫，柱溫30 ℃，檢測波長分別為320 nm（綠原酸、阿魏酸）和300 nm（歐前胡素、異歐前胡素），流速為1 mL/min進(jìn)行測定。以歐前胡素為內(nèi)標(biāo)物，建立復(fù)方白芷止痛膠囊中阿魏酸、綠原酸、異歐前胡素的相對(duì)校正因子。結(jié)果 復(fù)方白芷止痛膠囊中阿魏酸、綠原酸、異歐前胡素的相對(duì)校正因子重現(xiàn)性良好，分別為1.16、2.00、1.00，一測多評(píng)法測定結(jié)果與外標(biāo)法比較無顯著差異。結(jié)論 以歐前胡素為內(nèi)標(biāo)物建立復(fù)方白芷止痛膠囊多種指標(biāo)性成分的一測多評(píng)法結(jié)果準(zhǔn)確性良好，方法可行，可作為復(fù)方白芷止痛膠囊的質(zhì)量控制方法。

關(guān)鍵詞：復(fù)方白芷止痛膠囊；一測多評(píng)法；阿魏酸；綠原酸；歐前胡素；異歐前胡素

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.09.021

中圖分類號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2018）09-0086-05

Abstract： Objective To develop a new method for content determination of chlorogenic acid， ferulic acid， and isoimperatorin in Compound Baizhi Zhitong Capsules through quantitative analysis of multi-components by single-marker （QAMS） method by setting imperatorin as internal standard substance. Methods HPLC was adopted. The chromatographic column of Thermo Hypersil GOLD （4.6 mm×250 mm， 5 ?m） was used； the mobile phase was composed of acetonitrile and 0.2% formic acid in gradient elution； the flow speed was 1 mL/min； the detection wavelength were 320 nm （chlorogenic acid， ferulic acid） and 300 nm （imperatorin and isoimperatorin）. The relative analysis correction factors of imperatorin to other three components were established by setting imperatorin as internal standard substance. Results The relative analysis correction factors of chlorogenic acid， ferulic acid， and isoimperatorin in Compound Baizhi Zhitong Capsules were 1.16， 2.00， and 1.00， which had a high reproducibility. There was no significant difference between QAMS and external standard method. Conclusion The QAMS method for Compound Baizhi Zhitong Capsules by setting imperatorin as internal standard substance is accurate and feasible， which can be used as a useful quality control method for Compound Baizhi Zhitong Capsules.

Keywords： Compound Baizhi Zhitong Capsules； quantitative analysis of multi-components by single-marker； chlorogenic acid； ferulic acid； imperatorin； isoimperatorin

復(fù)方白芷止痛膠囊為王永炎院士的臨床經(jīng)驗(yàn)方，由白芷、藳本、天麻3味藥組成，臨床治療偏頭痛具有良好效果。方中白芷性溫、味辛，歸胃、大腸、肺經(jīng)，具有發(fā)散風(fēng)寒、通竅止痛、燥濕止帶、消腫排膿等功效，臨床常用于治療陽明頭痛、眉棱骨痛、鼻淵頭痛、牙痛、風(fēng)寒濕痹等，其主要含有香豆素類成分、揮發(fā)油類、多糖類、甾醇類及生物堿等，香豆素類含量可達(dá)1%左右[1]，其中包括歐前胡素、異歐前胡素等[2-3]。藁本祛風(fēng)散寒、除濕止痛，用于風(fēng)寒感冒、巔頂疼痛、風(fēng)濕痹痛，其主要含有揮發(fā)油類，如洋川芎內(nèi)酯類、藁本內(nèi)酯類等[4-5]。王連國等[6]采用HPLC測定不同產(chǎn)地白芷飲片中歐前胡素和異歐前胡素的含量并進(jìn)行比較。2015年版《中華人民共和國藥典》將阿魏酸作為控制藁本質(zhì)量的成分。選取單一指標(biāo)性成分難以表征具有多樣性、復(fù)雜性特點(diǎn)的中藥制劑的質(zhì)量，而一測多評(píng)法是通過測定1個(gè)成分實(shí)現(xiàn)以多個(gè)成分同步監(jiān)控產(chǎn)品質(zhì)量的有效方法[7-8]。為更好地控制復(fù)方白芷止痛膠囊的產(chǎn)品質(zhì)量，本研究選取阿魏酸、綠原酸、歐前胡素、異歐前胡素為指標(biāo)成分，以歐前胡素為內(nèi)標(biāo)物，采用HPLC建立一測多評(píng)法，對(duì)制劑中的4種成分進(jìn)行含量測定，從而保證制劑質(zhì)量的可控性[2，9-10]。

1 儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀（DAD檢測器），美國Agilent公司；KQ-100V超聲波清洗器，昆山市超聲波儀器有限公司；Thermo Hypersil GOLD色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m）。

對(duì)照品阿魏酸（批號(hào)110773-201614，含量99.0%）、綠原酸（批號(hào)110753-201716，含量99.3%）、歐前胡素（批號(hào)110826-201616，含量99.6%）、異歐前胡素（批號(hào)110827-201611，含量99.4%），中國食品藥品檢定研究院；復(fù)方白芷止痛膠囊（12粒/板，0.3 g/粒，批號(hào)分別為170501、170502、170601、170602、170701、170702、170801、170802、170901、170902），上海綠谷生命園醫(yī)藥有限公司。甲醇、乙腈為色譜純，甲酸為分析純，純化水由礫鼎超純水機(jī)制備，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

采用Thermo Hypersil GOLD色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m）；流動(dòng)相為乙腈-0.2%甲酸，梯度洗脫程序見表1；檢測波長：綠原酸、阿魏酸為320 nm，歐前胡素、異歐前胡素為300 nm；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 ?L。阿魏酸、綠原酸、歐前胡素素、異歐前胡素峰的分離度均大于1.5，拖尾因子介于0.95～1.05，理論塔板數(shù)按各色譜峰計(jì)均不少于5000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液的制備

分別取阿魏酸、綠原酸、歐前胡素、異歐前胡素對(duì)照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成阿魏酸258.19 ?g/mL、綠原酸399.58 ?g/mL、歐前胡素490.43 ?g/mL、異歐前胡素160.83 ?g/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備

取復(fù)方白芷止痛膠囊內(nèi)容物適量，研細(xì)，取0.2 g，精密稱定，置25 mL棕色量瓶中，用50%甲醇超聲處理（功率100 kW，頻率40 kHz）10 min使溶解并稀釋至刻度，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備

按處方比例分別制備缺白芷、缺白芷和藁本的陰性樣品，按供試品溶液制備方法，同法制備缺白芷的陰性對(duì)照溶液及缺白芷和藁本的陰性對(duì)照溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn)

分別精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、缺白芷陰性對(duì)照溶液和缺白芷和藁本陰性對(duì)照溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果見圖1。

2.3.2 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，用倍半稀釋法稀釋成6個(gè)不同濃度，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，以峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：綠原酸Y=28.763X-8.4743（r=0.999 8），阿魏酸Y=49.56X-7.711（r=0.999 8），歐前胡素Y=24.806X-6.328 2（r=0.999 8），異歐前胡素Y=24.887X-2.260 8（r=0.999 8）。線性范圍分別為：綠原酸0.0799～0.799 2 ?g、阿魏酸0.051 6～0.516 4 ?g，歐前胡素0.098 1～0.980 9 ?g，異歐前胡素0.032 2～0.321 7 ?g。

2.3.3 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定綠原酸、阿魏酸、歐前胡素、異歐前胡素峰面積，RSD分別為0.10%、0.11%、0.05%、0.09%，表明儀器的精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取批號(hào)為170601的復(fù)方白芷止痛膠囊樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定峰面積，計(jì)算含量及其RSD，結(jié)果綠原酸、阿魏酸、歐前胡素、異歐前胡素樣品含量RSD分別為0.82%、0.31%、0.51%、1.26%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取批號(hào)為170601的復(fù)方白芷止痛膠囊樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、16、24 h進(jìn)樣，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，結(jié)果綠原酸、阿魏酸、歐前胡素、異歐前胡素峰面積RSD分別為0.07%、0.08%、0.07%、0.11%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱定復(fù)方白芷止痛膠囊樣品約0.1 g，平行分成6份（100.04、99.96、99.97、99.98、99.98、99.97mg），按1∶1比例加入對(duì)照品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定綠原酸、阿魏酸、歐前胡素、異歐前胡素峰面積，計(jì)算各成分的平均加樣回收率及RSD，結(jié)果綠原酸、阿魏酸、歐前胡素、異歐前胡素的加樣回收率分別為98.67%、99.86%、100.04%、101.02%，RSD分別為1.60%、1.96%、1.47%、0.90%。

2.4 相對(duì)校正因子的確定

3種成分相對(duì)校正因子（fk/s）的計(jì)算參考《一測多評(píng)法建立的技術(shù)指南》，以多個(gè)質(zhì)量濃度點(diǎn)計(jì)算所得的fk/s取平均值作為定量用fk/s。fk/s=（Cs×Ak）÷（Ck×As），式中Cs為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度，As為內(nèi)標(biāo)物色譜峰面積，Ck為其他對(duì)照組分質(zhì)量濃度，Ak為其他對(duì)照組分色譜峰面積。取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣10 ?L，測定綠原酸、阿魏酸、歐前胡素、異歐前胡素的峰面積，以歐前胡素為內(nèi)標(biāo)物，分別計(jì)算3種待測成分與歐前胡素之間的fk/s，最終確定綠原酸、阿魏酸、異歐前胡素與歐前胡素的fk/s分別為1.16、2.00、1.00。

2.5 相對(duì)校正因子耐用性考察

2.5.1 不同流速的影響

分別考察不同流速（0.9、1.1 mL/min）對(duì)各成分fk/s的影響，結(jié)果顯示綠原酸、阿魏酸、異歐前胡素與內(nèi)標(biāo)物歐前胡素間的fk/s在不同流速條件下重現(xiàn)性良好，RSD分為0.10%、0.07%、0.04%。

2.5.2 不同柱溫的影響

分別考察不同的柱溫（28、32 ℃）對(duì)各成分fk/s的影響，結(jié)果顯示綠原酸、阿魏酸、異歐前胡素與內(nèi)標(biāo)物歐前胡素間的fk/s在不同柱溫條件下重現(xiàn)性良好，RSD分為0.34%、0.18%、0.31%。

2.5.3 不同流動(dòng)相的影響

分別考察0.3%甲酸、0.1%甲酸、0.05%磷酸對(duì)各成分fk/s的影響，結(jié)果顯示綠原酸、阿魏酸、異歐前胡素與內(nèi)標(biāo)物歐前胡素間的fk/s在不同流動(dòng)相條件下重現(xiàn)性良好，RSD分為0.73%、0.38%、0.21%。

2.5.4 不同色譜柱的影響

分別考察Waters Xbridge Shield RP18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m）、ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m）、Thermo Hypersil GOLD色譜柱對(duì)各成分fk/s的影響，結(jié)果顯示綠原酸、阿魏酸、異歐前胡素與內(nèi)標(biāo)物歐前胡素間的fk/s在不同色譜柱條件下重現(xiàn)性良好，RSD分別為0.31%、0.52%、0.66%。

2.6 待測成分色譜峰定位

取“2.3.3”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣10 ?L，測定綠原酸、阿魏酸、異歐前胡素與內(nèi)標(biāo)物歐前胡素的相對(duì)保留時(shí)間，結(jié)果相對(duì)保留時(shí)間的RSD分別為0.20%、0.10%、0.01%，表明相對(duì)保留時(shí)間波動(dòng)較小，可以作為綠原酸、阿魏酸、異歐前胡素的定位。

2.7 一測多評(píng)法與外標(biāo)法測定結(jié)果比較

采用外標(biāo)法測定10批復(fù)方白芷膠囊樣品中綠原酸、阿魏酸、歐前胡素、異歐前胡素4種成分的含量，驗(yàn)證一測多評(píng)法計(jì)算值的準(zhǔn)確性和可靠性，對(duì)2種方法測得的數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果見表2。2種方法的測定結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），表明一測多評(píng)法準(zhǔn)確性良好，方法可行，結(jié)果可靠。

3 討論

白芷作為復(fù)方白芷止痛膠囊的君藥，止痛作用突出，其辛能散，溫能祛寒，性燥能除濕，凡風(fēng)寒濕邪所致氣血阻滯而疼痛者均可選用。其作用部位廣泛，包括頭痛、身痛、脘腹疼痛等，尤其為歷代治療頭痛的要藥。白芷香豆素為白芷的重要活性物質(zhì)，具有鎮(zhèn)痛作用，歐前胡素為含量相對(duì)較高的白芷香豆素之一，歐前胡素在復(fù)方白芷止痛膠囊中含量較高，穩(wěn)定性好，因此，選擇歐前胡素為內(nèi)標(biāo)物符合一測多評(píng)法對(duì)內(nèi)標(biāo)物的要求。

本試驗(yàn)考察了供試品溶液的制備方法，分別選取超聲、振搖考察提取方法，選取5、10、15 min考察提取時(shí)間，選取30%甲醇、70%甲醇考察提取溶劑，結(jié)果表明，用50%甲醇超聲處理10 min可使樣品完全溶解且所得待測成分含量最大。此外，為使色譜峰對(duì)稱性更好，選擇50%甲醇為提取溶劑。試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，異歐前胡素與前后雜質(zhì)峰較難分離，為使分離度合格，本試驗(yàn)考察了流動(dòng)相種類對(duì)異歐前胡素峰的影響，分別選取0.2%甲酸和0.2%磷酸，結(jié)果以0.2%磷酸為流動(dòng)相時(shí)出現(xiàn)新的雜質(zhì)峰，分離度未改善，因此選擇0.2%甲酸；改變色譜梯度增加出峰時(shí)間，達(dá)到有效分離。

本研究通過測定內(nèi)標(biāo)物歐前胡素與阿魏酸、綠原酸、異歐前胡素的fk/s，分別考察了不同柱溫、流速、流動(dòng)相及色譜柱對(duì)測定結(jié)果的影響，結(jié)果RSD均小于2%，表明一測多評(píng)法建立的fk/s耐用性良好。10批樣品的一測多評(píng)法與外標(biāo)法測定結(jié)果無顯著差異，表明本方法準(zhǔn)確性良好，方法可行，結(jié)果可靠，可作為復(fù)方白芷止痛膠囊的質(zhì)量控制方法。

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（收稿日期：2018-03-09）

（修回日期：2018-03-30；編輯：陳靜）