乙二醛和丁二酮抑制PhIP形成的作用機制研究

韓中惠，王曉敏，吳士瑩，張燕，王碩

（1．天津科技大學食品工程與生物技術學院，食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室，天津300457；2.南開大學醫(yī)學院，天津市食品科學與健康重點實驗室，天津300071）

熱加工可提高食品營養(yǎng)品質，改善食品營養(yǎng)消化率和延長食品保質期等[1]，但在熱加工過程中也會伴隨產生一些健康危害物，如雜環(huán)胺[2]、亞硝胺、丙烯酰胺[3]、呋喃[4]等。雜環(huán)胺是富含蛋白質的食物在熱加工過程中形成的具有多環(huán)芳香族結構的致癌致突變物的一類化合物。動物實驗證明這些雜環(huán)胺具有增加罹患結腸癌、胰腺癌、胃癌和食道癌等疾病的風險[5]。國際癌癥研究機構（International Agency for Research on Cancer，IARC）把八種雜環(huán)胺（包括2-氨基-1-甲基-6-苯基-咪唑 [4，5-b]吡啶（2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4，5-b]pyridine，PhIP））列為 2 類致癌物[6]。針對肉制品中雜環(huán)胺的相關研究具有重要意義。到目前為止，已經從熱加工的肉類中分離鑒定了30多種的雜環(huán)胺[1]，其中2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑并[4，5-b]吡啶（PhIP）是含量較高的一種[7]，所以 PhIP 經常作為研究雜環(huán)胺的代表物。

相關機制研究闡明，苯丙氨酸和肌酐是形成PhIP的必需前體物；苯乙醛是形成PhIP的關鍵中間體，由苯丙氨酸通過Strecker（斯特雷克）降解產生[1，8-9]。目前研究表明多酚類化合物[10-11]，酰胺化合物[10]和金屬陽離子[12]等物質都能顯著減少食品中PhIP的含量，其相關的抑制PhIP形成的機理也被闡明。研究人員證實不同種類的糖能夠抑制食品中雜環(huán)胺PhIP的產生，然而對于抑制機制鮮有報道[13-14]。我們的研究工作發(fā)現(xiàn)糖的降解產物α-二羰基化合物能夠顯著抑制PhIP的形成，并揭示了糖通過其降解產物丙酮醛抑制PhIP形成的作用機制[15]。乙二醛和丁二酮與丙酮醛同屬于α-二羰基化合物，均為糖降解產物，并對雜環(huán)胺PhIP的產生具有顯著的抑制作用，但并沒有研究揭示其抑制機制。因此，本文將系統(tǒng)分析在模擬體系中乙二醛和丁二酮抑制雜環(huán)胺PhIP形成的作用機制，為真實食品中雜環(huán)胺的形成控制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

PhIP標準品（98%）：加拿大 Toronto Research Chemicals公司；肌酐和苯丙氨酸標準品：美國Sigma-Aldrich公司；苯乙醛標準品：上海阿拉丁生化科技有限公司；乙二醛（40%水溶液）、丁二酮、肌酐和苯丙氨酸（均為分析純）：美國Sigma-Aldrich公司；甲酸銨和乙酸銨（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；AccQ-Tag試劑包：美國Waters公司。固相萃取柱HyperSep C18（200 mg/5 mL）：美國 Thermo Scientific 公司；固相萃取柱 Si-SCX-2（200 mg/5 mL）：美國 SILICYCLE公司。

1.2 儀器與設備

Agilent 6410型高效液相色譜-三重四級桿質譜聯(lián)用儀（high performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometer，HPLC-MS/MS）和 Agilent 7890B/977A型氣相-質譜聯(lián)用儀（gas chromatographymass spectrometer，GC-MS）：美國 Agilent公司；LC-20A型高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC）：日本 Shimadzu公司；12通道固相萃取儀：美國Sigma-Aldrich公司；RCT BS 25型磁力攪拌器和MS 3型渦旋混合器：德國IKA公司；FE20K型PH計：瑞士梅特勒-托利多公司；5804R型離心機：美國Beckman公司；MGS-2200型氮吹儀：日本東京理化公司；SBH200D/3型干浴加熱器：英國BIBBY公司。

1.3 模擬體系的建立

1.3.1 苯丙氨酸/肌酐/乙二醛（或丁二酮）模擬體系

分別取 0.01、0.05、0.1、0.5 mmol的乙二醛或丁二酮。將不同摩爾量的乙二醛（或丁二酮）、0.1 mmol的肌酐和0.1 mmol的苯丙氨酸分別置于螺口管中，加入3 mL二甘醇（86%）/水（14%）溶液中，然后在渦旋振蕩器上使其充分混勻溶解后放入干浴加熱器中。干浴加熱器溫度為130℃，加熱時間為120 min[15]。加熱反應結束后，取出樣品，放在冰水中冷卻至室溫待用。每組試驗重復進行3次。

1.3.2 苯丙氨酸/乙二醛（或丁二酮）和肌酐/乙二醛（或丁二酮）模擬體系

分別取 5、10、20、50、100 μmol的乙二醛或丁二酮。將不同摩爾量的乙二醛（或丁二酮）和0.1 mmol的苯丙氨酸或0.1 mmol的肌酐置于螺口管中，加入3 mL二甘醇（86%）/水（14%）溶液中，以下處理方式同1.3.1。

1.3.3 PhIP/乙二醛（或丁二酮）模擬體系

分別取 0.01、0.025、0.05 、0.1、0.25 μmol的乙二醛或丁二酮。將不同摩爾量的乙二醛（或丁二酮）和10 nmol的PhIP置于螺口管中，加入3mL二甘醇（86%）/水（14%）溶液中，以下處理方式同1.3.1。

1.4 試驗方法

1.4.1 標準溶液的配制

配制不同濃度的苯丙氨酸、苯乙醛、肌酐和PhIP標準溶液，將它們至于4℃的冰箱中避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 苯丙氨酸的檢測

苯丙氨酸的測定使用的是AccQ·Tag方法[16]。首先使用配制Waters AccQ·Fluor衍生試劑對檢測樣品進行衍生，然后將衍生好的樣品待HPLC測定。

HPLC的色譜條件：色譜柱為Waters AccQ·Tag氨基酸分析柱 Nova-PakC18（3.9 mm×150 mm，4 μm）；柱溫為35℃；流速為0.8 mL/min；流動相：A為AccQ·Tag/水洗脫液（1/10，體積比），B為乙腈/水混合液（60/40，體積比）；檢測器為熒光檢測器，其激發(fā)波長為250 nm，發(fā)射波長為395 nm；進樣體積為1 μL。洗脫梯度如表1。

1.4.3 苯乙醛的檢測

將樣品使用適量的乙酸乙酯/己烷（3/1，體積比）提取3次。低溫下進行除有機溶劑，然后使用10 mL的乙酸乙酯定容，將制得的樣品過有機濾膜（0.22 μm），待GC-MS分析。

GC-MS分析方法是根據(jù)之前描述的方法進行一些修改[17]。氣質是由氣相色譜Agilent 7890B和質譜選擇檢測器（mass selective detector，MSD）5977A組成。樣品分離色譜柱 HP5-MS（30 m×0.25 nm×0.25 μm）；進樣的體積是1 μL。氣體為氦氣，載氣流速為1 mL/min，進樣口溫度為280℃，傳輸線到MSD的溫度為280℃。離子源溫度為230℃，質量范圍為50 amu～550 amu。色譜柱升溫程序：40℃保持1 min，然后以5℃/min到240℃，再以10℃/min升溫至280℃。

1.4.4 肌酐的檢測

將樣品進行50倍的稀釋，在將稀釋后的樣品進行水相濾膜過濾（0.22 μm），濾液待HPLC進行分析。

分析方法如前所述進行適當修改[18]。HPLC的色譜條件：色譜柱為 Kromasil C18（250 mm×4.6 mm×5 μm），流動相：A相為 25 mmol/L KH2PO4緩沖液（pH=6.9），B相為乙腈；10%B相等度洗脫；流速為0.8 mL/min；檢測器為紫外檢測器，檢測波長為215 nm；進樣體積為20 μL。

1.4.5 PhIP的檢測

樣品凈化參考實驗室已建立方法，試驗步驟如下[6，19]：采用丙磺酸陽離子（Si-SCX-2）交換柱和 C18 固相萃取柱串聯(lián)萃取，將樣品洗脫液用氮氣吹干然后用1 mL 色譜純甲醇復溶、稀釋，再離心（15 min，1 000 g）、過0.22 μm有機微孔過濾膜，待測。

HPLC-MS/MS的條件：色譜柱為Zorbax Eclipse Plus C18（2.1×150 nm，3.5 μm）；柱溫為 25 ℃；流速為0.2 mL/min；流動相：A 為甲酸銨（10 mol/L，pH=3.5），B為乙腈；洗脫梯度為：0～12 min，10%～60%（B相）；12 min～14 min，60%～10%（B 相）；進樣的體積為 1 μL；質譜使用電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI）；霧化和碰撞的氣為氮氣；霧化氣壓力為0.28 MPa；毛細管電壓為4 000 V；干燥器流量為10 L/min；干燥器溫度為350℃；PhIP的質譜躍遷模式為m/z 225.3→m/z 210。

1.5 統(tǒng)計分析

試驗所得到的數(shù)據(jù)以平均值標準偏差（mean±SD）表示。其相關數(shù)據(jù)通過方差分析（analysis of variance，ANOVA）和鄧肯測試（Duncan test）。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析軟件為IBM SPSS 19.0。作圖軟件為OriginPro 2016。

2 結果與分析

2.1 檢測方法驗證

為確定測定結果的準確性，對苯丙氨酸、苯乙醛、肌酐和PhIP的方法進行了詳細的方法學考察。其中考察的指標包括線性回歸方程、檢出限（limit of detection，LOD）、定量限（limit of quantilty，LOQ）回收率以及相對標準偏差。苯丙氨酸、苯乙醛、肌酐和PhIP標品的濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，其線性回歸方程、線性相關系數(shù)r2、檢出限LOD和定量限LOQ如表2。

表2 苯丙氨酸、苯乙醛、肌酐和PhIP的線性回歸方程、相關系數(shù)及檢測限Table 2 Regression equations，correlation coefficients and detection limits for phenylalanine，phenylacetaldehyde，creatintine，and PhIP respectively

苯丙氨酸、苯乙醛、肌酐和PhIP在樣品中的回收率分別為85.9%～90.1%，75.6%～81.6%，70.5%～86.9%和75.1%～81.3%，相對標準偏差分別為1.8%～4.3%，2.3%～4.7%，4.3%～5.1%和3.7%～5.2%。試驗數(shù)據(jù)表明，測定苯丙氨酸、苯乙醛、肌酐和PhIP的方法具有較高的準確性和可靠性。

2.2 乙二醛和丁二酮對苯丙氨酸的影響

圖1顯示了乙二醛和丁二酮分別與苯丙氨酸反應后苯丙氨酸量的變化。

圖1 模擬體系中乙二醛和丁二酮對苯丙氨酸的影響Fig.1 Effects of glyoxal and diacety on phenylalanine（Phe）in model system

隨著乙二醛的逐漸添加，苯丙氨酸的量也逐漸降低，乙二醛添加量為100 μmol時，苯丙氨酸的濃度降低了（93.52±1.45）%。丁二酮對苯丙氨酸的影響與乙二醛一樣，也能使模擬體系中的苯丙氨酸濃度降低，當丁二酮的添加量為100 μmol時，苯丙氨酸的濃度降低了（99.71±0.72）%。以上結果表明乙二醛和丁二酮與苯丙氨酸發(fā)生了反應，消耗了苯丙氨酸的量。

苯丙氨酸是PhIP的關鍵前體物，乙二醛或丁二酮消耗苯丙氨酸的直接結果是導致PhIP形成的減少。但是有研究表明，將苯丙氨酸通過Strecker降解形成苯乙醛是形成PhIP的重要途徑，苯乙醛是形成PhIP的重要中間物[1，20]。因此，分析苯乙醛的變化是準確闡明乙二醛或丁二酮和苯丙氨酸的反應在PhIP形成中的作用的關鍵。

通過GC-MS分析，圖2顯示了乙二醛和丁二酮分別與苯丙氨酸反應后苯乙醛量的變化。

圖2 模擬體系中乙二醛和丁二酮對苯乙醛的影響Fig.2 Effects of glyoxal and diacety on phenylacetaldehyde（PEA）in model system

由圖2可知，當添加0～100 μmol的乙二醛后，苯乙醛的濃度增加至（0.026±0.002）μmol/mL，說明乙二醛可與苯丙氨酸反應形成苯乙醛。丁二酮與苯丙氨酸反應形成苯乙醛的量比乙二醛的量低（p＜0.05），但也能夠顯著促進苯乙醛的形成，且隨濃度變化而增加。

以上結果證實，苯丙氨酸可以通過乙二醛或丁二酮發(fā)生Strecker降解反應降解為苯乙醛[21]，而苯乙醛是形成PhIP關鍵的中間物，由此可見苯乙醛的增多可以促進PhIP的形成。因此，分析認為苯丙氨酸和乙二醛或丁二酮之間的反應不會有助于PhIP的減少，反而促進PhIP的形成。

2.3 乙二醛和丁二酮對肌酐的影響

圖3顯示了乙二醛和丁二酮分別與肌酐反應后肌酐量的變化。

由圖3可知，在肌酐/乙二醛（丁二酮）模型系統(tǒng)中，隨著乙二醛濃度從0～100 μmol增加，肌酐的濃度從（0.036±0.002）mmol/mL降至（0.021±0.001）mmol/mL。相同情況，隨著丁二酮加入量逐漸增加，肌酐的濃度也逐漸降低。以上結果表明，乙二醛和丁二酮都可以與形成PhIP的關鍵前體物肌酐發(fā)生反應，進而可使PhIP的形成水平降低。

圖3 模擬體系中乙二醛和丁二酮對肌酐的影響Fig.3 Effects of glyoxal and diacety on creatitine（Crn）in model system

2.4 乙二醛和丁二酮對PhIP的影響

圖4顯示了乙二醛和丁二酮分別與PhIP反應后PhIP量的變化。

由圖4可知，在模擬體系中，PhIP的量隨著乙二醛濃度的增加（從0～0.25 μmol）而顯著降低（p＜0.05），當在 0.05 μmol時 PhIP 降低（77.27±3.91）%，但是在 0.05 μmol～0.25 μmol之間 PhIP 的降低沒有顯著的變化（p＜0.05）。丁二酮與PhIP反應的變化趨勢與以上的情況相似，PhIP隨乙二醛添加量的增加而逐漸減少；但是減少量顯著低于乙二醛（p＜0.05）。通過以上乙二醛和丁二酮對PhIP的影響可以得出，此二種α-二羰基化合物能夠與PhIP發(fā)生化學反應，可促使PhIP減少。

圖4 模擬體系中乙二醛和丁二酮對PhIP的影響Fig.4 Effects of glyoxal and diacety on PhIP in model system

2.5 乙二醛和丁二酮對PhIP形成的抑制

以苯丙氨酸/肌酐/乙二醛和苯丙氨酸/肌酐/丁二酮模型系統(tǒng)來研究乙二醛和丁二酮對PhIP形成的影響。PhIP的量隨著乙二醛和丁二酮的濃度增加而下降[15]。這意味著乙二醛和丁二酮顯著減少了模型體系中PhIP的形成（p＜0.05）。這些結果證實，乙二醛和丁二酮在減少PhIP形成中起重要作用，這可能是由于乙二醛和丁二酮消耗PhIP或其前體物所致。

3 結論與討論

通過對不同模擬體系中前體物，中間體及產物的系統(tǒng)分析，初步推測了乙二醛和丁二酮抑制PhIP形成的作用機制。乙二醛和丁二酮可分別與苯丙氨酸、肌酐和PhIP發(fā)生化學反應，乙二醛、丁二酮與肌酐的反應，以及乙二醛、丁二酮與PhIP的反應可減少PhIP形成；相反，乙二醛、丁二酮與苯丙氨酸反應可促進PhIP前體物苯乙醛的形成進而促進PhIP形成，因此反應體系中PhIP的總體減少是這些化學反應的綜合作用結果。這與丙酮醛抑制PhIP的作用機制相同[15]。結合前期相關研究結果分析，進一步證明糖可通過熱降解形成α-二羰基化合物來實現(xiàn)對雜環(huán)胺PhIP的抑制作用。研究結論為建立食品加工中雜環(huán)胺的有效減控技術奠定了理論基礎。