蝦、蟹殼中甲殼素/殼聚糖提取工藝及應(yīng)用研究進展

孫翔宇，魏琦峰，任秀蓮

（哈爾濱工業(yè)大學(xué)（威海）海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山東威海264209）

甲殼素（chitin），又名幾丁質(zhì)，甲殼質(zhì)，β-（1，4）-2-乙酰氨基-2-脫氧-D-葡萄糖，分子式（C8H13NO5）n，是由β-1，4糖苷鍵[1]連接起來的線性高分子多糖[1-2]。甲殼素分布極為廣泛，僅次于纖維素[3]，主要存在甲殼動物的外殼、昆蟲表皮、菌類，軟體動物內(nèi)骨骼及藻類等微生物的細(xì)胞壁中，是自然界第二豐富的生物聚合物[4]。殼聚糖（chitosan），又稱為脫乙酰甲殼素、甲殼胺，是甲殼素一定程度脫乙酰而得到的，化學(xué)名稱是β-（1，4）-2-氨基-2-脫氧-D-葡聚糖。

甲殼素有3個主要特征：分子量、乙?；群徒Y(jié)晶度。不同的特征出現(xiàn)在3種不同的晶體中：具有反平行排列的大分子α-甲殼素、平行排列的β-甲殼素和平行和反平行式的γ-甲殼素，其中α-甲殼素是最穩(wěn)定且最豐富的一種形式[5]，在蝦殼、蟹殼中有較強的層間和層間氫鍵作用；而β-甲殼素有弱分子間作用力的特點，相比于α-甲殼素，β-甲殼素對溶劑具有更高的反應(yīng)活性和親和力[6]。

甲殼素/殼聚糖是種帶正電的天然高分子多聚糖[7]，對帶負(fù)電荷的有害物質(zhì)有吸附作用，能夠清除人體內(nèi)的“垃圾”。另外，由于其自身良好的成膜性、絮凝作用以及無毒無刺激等各種優(yōu)異性能，在化工、紡織品以及食品、化妝品等行業(yè)有著廣泛的應(yīng)用[8-10]。

關(guān)于甲殼素/殼聚糖的制備，國內(nèi)有很多相關(guān)的報道[11-13]，目前，國內(nèi)外生產(chǎn)甲殼素的主要來源是水產(chǎn)加工后廢棄的蝦、蟹殼[14]。我國沿海水產(chǎn)資源豐富，加工后的廢棄蝦、蟹下腳料很多，若不合理加以利用，不僅是環(huán)境的負(fù)擔(dān)，更是資源的浪費。因此，探索出一種經(jīng)濟、高效的方法來回收甲殼素，對于蝦、蟹下腳料的綜合利用具有重要的意義。

1 甲殼素/殼聚糖的提取工藝

我國目前工業(yè)生產(chǎn)甲殼素/殼聚糖的主要原料是水產(chǎn)加工廠廢棄的蝦蟹殼，蝦蟹殼中含有大量的碳酸鈣（20%～50%）和蛋白質(zhì)（20%～40%）等[14]，所以提取甲殼素的關(guān)鍵就是去除其中的碳酸鈣和蛋白質(zhì)等主要物質(zhì)[15]。目前甲殼素的提取方法主要有化學(xué)法、酶解法和微生物發(fā)酵法[16]，也有學(xué)者在不斷地研發(fā)新的既簡便又環(huán)保的綠色方法。

1.1 化學(xué)法

化學(xué)法又稱酸堿法，是提取甲殼素的傳統(tǒng)方法，也是當(dāng)前工業(yè)實踐的主要方法。其主要包括脫鹽、脫蛋白和脫色3個步驟，操作簡單，效率高，但要消耗大量的酸堿，并且會產(chǎn)生大量的酸堿廢液，蛋白質(zhì)、鈣和蝦青素等有效成分無法回收，既浪費資源也污染環(huán)境。隨著人們的環(huán)保意識日益增強，也有越來越多的學(xué)者開始開發(fā)新的提取方法。蔚鑫鑫等[17]利用新鮮的小龍蝦殼進行甲殼素提取，尋找出最佳提取條件：室溫下用1.0 mol/L的HCl溶液浸泡24 h后水洗至中性，然后在90℃～100℃用2.0 mol/L的NaOH處理4 h。在該條件下，甲殼素的提取率可達(dá)到16.52%，過高的NaOH濃度可能會導(dǎo)致甲殼素提取過程中固相萃取效率的降低。Chu Yong Soon等[18]研究了0.5 mol/L～2 mol/L NaOH處理的超蟲幼蟲中提取甲殼素，結(jié)果表明：使用0.5 mol/L NaOH處理后提取的甲殼素產(chǎn)量最高，達(dá)到5.43%。國外的Varun等[19]采用化學(xué)萃取法，從蟹殼廢料中提取甲殼素，產(chǎn)率達(dá)到12.2%。Chun-Yung Huang等[20]采用擠壓膨化（CP）、酸溶、堿沉相結(jié)合的方法，從阿根廷魷魚中提取殼聚糖，提高了甲殼素的脫乙酰度（deacetylation degree）、殼聚糖的提取率，降低了殼聚糖的分子量，增強了殼聚糖的殺菌活性。

1.2 酶解法

針對化學(xué)法的弊端，有關(guān)學(xué)者提出了資源化處理法，即采用生物酶對原料進行處理，越來越受到關(guān)注[21]。李永強[1]對去除灰分和蛋白以及甲殼素的制備進行了工藝優(yōu)化研究，選用凝結(jié)芽孢桿菌作為發(fā)酵株，蛋白酶K將蝦殼酶解，結(jié)果標(biāo)明蛋白質(zhì)與灰分的去除率可達(dá)93%和91%。歲姍姍[22]利用響應(yīng)面分析法最終得到了有機酸結(jié)合蛋白酶法提取黃粉蟲中甲殼素的最佳工藝條件，提取率可達(dá)（6.48±0.29）%，與傳統(tǒng)工藝相比相差不大，說明改進傳統(tǒng)工藝是有理論依據(jù)的。姜紅鷹等[23]對幾丁質(zhì)酶、殼聚糖酶等的特性以及表達(dá)水平進行了總結(jié)，得出了畢氏酵母表達(dá)的殼聚糖酶可滿足大規(guī)模制備的結(jié)論；國內(nèi)外也有許多學(xué)者采用了酶法和化學(xué)法相結(jié)合的新思路來制備甲殼素，條件溫和，不僅解決了污染的問題，對其中的蛋白與鈣鹽液進行了利用，但是該方法耗時長，脫蛋白的效果沒有酸堿法好，商業(yè)化酶較貴，成本較化學(xué)法高[16，24]。

1.3 微生物發(fā)酵法

微生物發(fā)酵法就是利用一些細(xì)菌和真菌發(fā)酵體產(chǎn)生的有機酸或蛋白酶來去除蛋白質(zhì)和鈣鹽，從而達(dá)到制取甲殼素的目的。湖北大學(xué)的黃璠[25]采用了微生物發(fā)酵法來脫鈣、脫蛋白質(zhì)，創(chuàng)新的先用了鼠李糖乳桿菌發(fā)酵蝦殼，然后用枯草芽孢桿菌來發(fā)酵脫蛋白，脫蛋白率和脫鈣率分別達(dá)到了85.45%和98.98%。

1.4 EDTA法

根據(jù) pH13時EDTA-Ca的lgk′=lgk的特征，且EDTA的溶解度接近最大[26]的特點可用EDTA代替酸堿脫鈣脫蛋白來達(dá)到制取甲殼素的目的，在此工藝中EDTA可循環(huán)利用，有效地降低了成本，減少了污染。竇勇等[27]采用此方法提取了淡水小龍蝦頭中的甲殼素，試驗表明以13%的EDTA溶液作提取劑，在30℃、pH12、投料比 1 ∶15（g/mL）、反應(yīng) 25 min 的條件下，提取效果最佳，提取率達(dá)24.05%，反應(yīng)前后的脫鈣和脫蛋白率分別達(dá)到了100.0%和98.6%；隨后，在EDTA方法的基礎(chǔ)上，竇勇等又采用了超聲輔助的方法[28]，研究了淡水小龍蝦烹飪前后的甲殼素提取情況，在超聲頻率60 kHz、功率180 W、超聲反應(yīng)45 min、處理溫度30℃，EDTA 濃度 18%，pH 13、料液比 1∶24（g/mL）的最佳條件下，提取灰分含量為0.13%，含氮量為3.51%。孟凡欣等[29]采用了期望函數(shù)和響應(yīng)面法優(yōu)化了EDTA法提取蝦殼中甲殼素的工藝：脫鈣條件pH11，EDTA 濃度 11%，反應(yīng)時間 2 h，料液比 1∶14（g/mL），10 g蝦殼粉中平均可提出2.57 g（干重）甲殼素，相對于未優(yōu)化的工藝提高了20.3%。

1.5 離子液體提取法

離子液體（ionic liquid，IL）由于其優(yōu)質(zhì)的性能備受矚目，在2010年Qin Y等[30-31]首次提出了運用離子液體（IL）1-乙基-3-甲基咪唑乙酸鹽（[C2mim][OAc]）提取甲殼素的方法。該方法是將甲殼素從甲殼素生物質(zhì)中微波輔助溶解到IL中，隨后通過加入水或另一種反溶劑凝結(jié)甲殼素。離子液體萃取的優(yōu)點在于保留高分子量（molecular weight），并且有機會直接從萃取物形成纖維、珠粒和膜，以及由于IL的非揮發(fā)性而增加的安全性。主要缺點為需要大量的、昂貴的必須再循環(huán)的IL；Shamshina等[32]提出了由高酸性和堿性離子制成的廉價離子液體（IL），例如[NH3OH]-[OAc]，可以用于以相當(dāng)甚至更高的幾丁質(zhì)產(chǎn)率和純度漿蝦殼。此外，[NH3OH]-[OAc]的生產(chǎn)成本相對較低，并且可在有效的制漿過程中反應(yīng)性地脫鹽和脫蛋白，從而能分離出純度80%的結(jié)晶度高的天然幾丁質(zhì)。但是這里的缺點是直接使用NH2OH。反應(yīng)性制漿允許比提取方法（2wt%）（wt%為質(zhì)量百分比）高10倍的生物質(zhì)負(fù)載量（20wt%），而不損害純度（分別為78%和81%幾丁質(zhì)）。

1.6 預(yù)處理法

熱甘油預(yù)處理法能夠快速、高效地從蝦殼中分離甲殼素：廢蝦殼在熱甘油中的預(yù)處理能夠通過脫水和溫度誘導(dǎo)的碎片去除蛋白質(zhì)，形成低分子量水溶性碎片，隨后通過溶于水從殼基質(zhì)中去除。Ramamoorthy等[33]開發(fā)了一種更綠色的方案：用熱甘油預(yù)處理蝦殼，隨后用檸檬酸研磨，能夠在一個步驟中除去蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)。若進行兩步處理，這種方法能夠除去大量天然形式的礦物，且脫鹽所需的檸檬酸的使用量減少80%，減少了釋放的二氧化碳的量。此外，預(yù)處理過程中使用的甘油得到了有效的回收利用，光譜和熱分析表明，此方法制取的甲殼素的質(zhì)量優(yōu)于常規(guī)化學(xué)法，而Lowry法定量分析表明此方法脫蛋白效率高于常規(guī)化學(xué)法。到目前為止，所有輔助處理都增強了幾丁質(zhì)的水解[34]，而M.Boric等[35]采用常壓介質(zhì)阻擋放電等離子體用作甲殼動物殼廢物預(yù)處理過程的方法不需要任何溶劑，能夠在強化蛋白質(zhì)去除的同時而不影響甲殼素。

幾種提取方法的優(yōu)缺點比較見下表1。

表1 甲殼素提取方法優(yōu)缺點比較Table 1 Comparison of advantages and disadvantages of chitin extraction methods

通過上表中的比較，可以看出酶解法、微生物發(fā)酵法與離子液體法的產(chǎn)品質(zhì)量較高，但成本較高，目前不適合工業(yè)上大批量生產(chǎn)；強化常壓等離子體法還需要進一步考察能源消耗以及甲殼素產(chǎn)率與質(zhì)量的問題；EDTA法和熱甘油預(yù)處理法步驟簡單，污染小，有著較好的發(fā)展前景，甚至可以取代酸堿法在工業(yè)生產(chǎn)上的地位。

2 甲殼素/殼聚糖應(yīng)用研究

甲殼素/殼聚糖有著十分優(yōu)異的生物活性，如果脫去甲殼素的乙?；?，它會轉(zhuǎn)變成殼聚糖，即可溶性甲殼素。它們的結(jié)構(gòu)與纖維素十分相似，這也意味著它們有些用途類似，甚至是更多的新用途。國內(nèi)外的一些學(xué)者進行過研究，也證實了甲殼素及其衍生物有著增強免疫力、抗腫瘤、抑菌和止血等作用[36-37]，蝦殼類水產(chǎn)養(yǎng)殖廢棄物中殼聚糖的抗癌活性研究已被證明是一種良好的新型制藥工業(yè)[38]?，F(xiàn)將甲殼素/殼聚糖在醫(yī)藥、食品以及化妝品行業(yè)的應(yīng)用作了介紹。

2.1 在醫(yī)藥方面的應(yīng)用

2.1.1 手術(shù)縫合線

傳統(tǒng)的手術(shù)縫線采用的是羊腸線，雖然吸收周期較短，但存在著降解副產(chǎn)品感染傷口等缺點[39]。殼聚糖有著止血功能[40]，能夠促進傷口愈合，可將其制成手術(shù)縫合線[41]，在溶菌酶的作用下酶解，能被人體組織吸收，減少拆除手術(shù)線的疼痛以及傷口感染的可能性，有報道研究了甲殼素在大鼠肌肉降解周期大約為4個月，并且沒有明顯的炎癥反應(yīng)[42]。此外，甲殼素制成的手術(shù)合線在膽汁、尿液等液體中仍能保持強度[43]，是一種十分優(yōu)秀的縫合線材料。

2.1.2 人造皮膚

甲殼素對人體細(xì)胞有很強的親和能力，能被人體內(nèi)的酶溶解，有著較好的成膜性及吸濕性等特點，被廣泛的應(yīng)用在醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域。甲殼素能夠很好的促進細(xì)胞再生，將其植入傷口處，便可生成人造皮膚[44-45]。1989年彭靖教授和醫(yī)科大學(xué)的鄧同蘭教授合作，成功的將殼聚糖薄膜應(yīng)用于人造皮膚的臨床實驗，并且1990年在國家級雜志發(fā)表了相關(guān)論文[46]。目前國外這類皮膚已經(jīng)商品化，也應(yīng)用到了整形外科手術(shù)中。

2.1.3 止血材料

合適的止血材料對術(shù)后恢復(fù)有著十分重要的作用，好的止血材料應(yīng)該具備無毒、止血迅速和不增加感染率等特點。甲殼素及其衍生物有止血效果，它本身具有多糖大分子結(jié)構(gòu)，骨架上帶正電的氨基可與紅細(xì)胞上的負(fù)電荷相互吸引，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，最終形成牢固的血凝塊[47]，從而達(dá)到止血的效果，是一種理想的止血材料。陳全等[48]研究了以甲殼素制備的溫敏水凝膠對于大鼠肝臟損傷出血時的止血性效果，結(jié)果表明，其能夠有效止血，并且在傷口愈合的過程中炎癥較輕；劉緣等[49]對南極磷蝦殼聚糖的止血效果做了研究，結(jié)果表明其明顯優(yōu)于其他商品化來源的殼聚糖，有十分廣闊的應(yīng)用前景。

2.1.4 藥物控釋載體

能作為藥物載體需要具備兩個條件：一是生物活性物質(zhì)在其中必須穩(wěn)定且按需釋放；二是要有良好的機體舒適感和生物相容性。殼聚糖作為藥物控釋載體有著獨特的優(yōu)點：無毒、較好的生物相容性，酸性條件下可形成凝膠以及抗酸抗?jié)兊幕钚裕捎行У亟鉀Q藥物對腸道的副作用[50]。此外殼聚糖還可降低藥物吸收前代謝，以及提高藥物的生物利用度，是一種具有發(fā)展前景的材料。

2.2 在食品工業(yè)的應(yīng)用

2.2.1 功能性食品

甲殼素和殼聚糖作為一種天然的生物質(zhì)，無毒副作用，其本身就可以作為一種功能性保健食品。殼聚糖陽離子多糖和生物活性物質(zhì)作為膳食纖維具有廣闊的應(yīng)用前景，近年研究表明，它在調(diào)節(jié)機體免疫功能，降血脂、血糖、血壓，保護胃腸道等方面發(fā)揮著巨大的作用[51]。殼聚糖通過阻斷膳食脂肪和膽固醇的吸收而具有降低膽固醇的能力，殼聚糖及其兩種衍生物不僅具有較低的細(xì)胞毒性，而且可以控制營養(yǎng)，實現(xiàn)胰島素抵抗治療[52]。

2.2.2 食品添加劑

甲殼素的結(jié)構(gòu)雖然與纖維素相似，但是它的吸濕性更優(yōu)于纖維素，吸水后的表面活性降低程度也小于纖維素。作為食品添加劑，殼聚糖有增稠劑、被膜劑、澄清劑、抗氧化劑、風(fēng)味改良劑、乳化劑等用途。殼聚糖做為被膜劑，被列入國家食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)GB 2760[53]。

2.2.3 果汁澄清劑

我國目前大多用酶法或過濾法來澄清果汁，成本高且周期長。殼聚糖分子上存在游離的氨基帶正電，能夠和酸、多酚類的物質(zhì)進行反應(yīng)，進而對膠態(tài)顆粒絮凝沉淀，達(dá)到澄清果汁的效果，并且不會影響營養(yǎng)成分和風(fēng)味。此外，用殼聚糖作澄清劑操作方便，成本低，有明顯的經(jīng)濟效益[54-55]。

2.2.4 防腐保鮮

殼聚糖是真菌細(xì)胞壁的重要組成部分，具有很高的抗氧化活性，對幾種食物中毒細(xì)菌和真菌具有優(yōu)異的抗菌活性，被建議用作食品防腐劑[56]。研究表明，殼聚糖及其衍生物能延長食物的儲存時間，其形成的抗菌涂層能夠有效地延緩微生物入侵，從而使食物不易腐爛。此外，殼聚糖基可食性膜是可生物降解的，并且可以與包裝中的產(chǎn)品一起食用[57]。

2.3 在化妝品行業(yè)的應(yīng)用

殼聚糖是親水膠體，可以與蛋白質(zhì)等相互作用形成保護膜，從而起到保濕的作用。能夠在頭發(fā)表面形成一層覆蓋膜，不易沾染灰塵，是一種理想的固發(fā)原料[58]。國外有學(xué)者將甲殼素用作化妝品的活性載體，甲殼素-納米纖維（chitin nanofiber）被嵌入抗氧化劑成分（褪黑激素、葉黃素和胞外蛋白），通過皮膚層的滲透可改善活性成分。幾丁質(zhì)和抗氧化成分的結(jié)合具有清除自由基的作用，可用于防止太陽輻射對光老化和皺紋的有害影響[57]。

3 展望

甲殼素是全球第二豐富的生物聚合物，是重要的功能分子，具有十分優(yōu)異的生理活性，有著保護消化系統(tǒng)預(yù)防與治療高血壓等許多功效，市場需求量也越來越大，一種簡便且環(huán)保的分離方法成為一種迫切的挑戰(zhàn)。目前，操作簡便、成本較低的傳統(tǒng)酸堿法仍然占據(jù)著工業(yè)生產(chǎn)的主要地位，但環(huán)境污染問題著實嚴(yán)重，應(yīng)打破這種格局，實現(xiàn)綠色環(huán)保的生產(chǎn)模式。微生物發(fā)酵法存在著發(fā)展空間，應(yīng)著力解決大批量生產(chǎn)時，酸與蛋白酶產(chǎn)生量不足的問題，以期實現(xiàn)工業(yè)化；此外，EDTA法和熱甘油預(yù)處理法值得發(fā)展，適合長期的大批量生產(chǎn)，尤其熱甘油預(yù)處理法有望成為代替酸堿法成為工業(yè)生產(chǎn)的支柱。

每年有大量的海產(chǎn)品下腳料被丟棄，這些是甲殼素的重要來源。我國水產(chǎn)資源豐富，尤其是沿海地區(qū)，若能將其加以利用，不僅減少了資源的浪費，也減輕環(huán)境的壓力。雖然甲殼素的利用在近幾年有了一定的進展，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，應(yīng)繼續(xù)加大研究力度，使之產(chǎn)業(yè)化，為我國的經(jīng)濟效益做出貢獻。