高效液相色譜法同步測定添加劑預(yù)混合飼料中六種水溶性維生素

張 憬，梁 斌，吳志奇，祝秀梅，戴海潔，南玉琴

（甘肅省獸藥飼料監(jiān)察所，甘肅蘭州 730030）

水溶性維生素對于畜禽養(yǎng)殖是重要的營養(yǎng)成分，其可參與蛋白質(zhì)、脂肪等的代謝，能夠提高免疫能力、預(yù)防疾病等。目前對于多種維生素的同步檢測都是高效液相色譜法，但是所用提取液、流動(dòng)相、采集波長千差萬別。為驗(yàn)證并找到一個(gè)理想的檢測方法，節(jié)約時(shí)間成本，本實(shí)驗(yàn)選擇了常見的六種B族維生素：煙酸、煙酰胺、葉酸、硫胺（維生素 B1）、核黃素（維生素 B2）、鹽酸吡哆醇（維生素B6），比較不同波長、不同色譜柱溫、不同提取方法，以獲得最佳檢測條件。

1 材料與方法

1.1 提取液 在已裝入700 mL去離子水的1000 mL容量瓶中，加入50 mg EDTA，振搖溶解后再加入25 mL冰乙酸、5 mL三乙胺，用去離子水定容搖勻。

1.2 流動(dòng)相 流動(dòng)相A：在已裝入700 mL去離子水的1000 mL容量瓶中，加入50 mg EDTA、1.1 g庚烷磺酸鈉，振搖溶解后再加入25 mL冰乙酸、5 mL三乙胺，用去離子水定容搖勻。用冰乙酸、三乙胺調(diào)節(jié)pH值至3.40，過0.45μm濾膜，超聲脫氣，待用。

流動(dòng)相B：甲醇，色譜純。

流動(dòng)相 A：流動(dòng)相 B=91∶9。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液

1.3.1 煙酸貯備液 準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品0.0250 g于25 mL棕色容量瓶，用去離子水溶解定容，此溶液濃度為 1000μg/mL。

1.3.2 煙酰胺貯備液 準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品0.0250 g于25 mL棕色容量瓶，用去離子水溶解定容，此溶液濃度為 1000μg/mL。

1.3.3 葉酸貯備液 準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品0.0500 g于50 mL棕色容量瓶，加入40 mL去離子水振搖，滴加0.25 mol/L氫氧化鈉，用最少量使葉酸溶解（因葉酸水溶性差，用氫氧化鈉將葉酸轉(zhuǎn)化為葉酸鹽），用去離子水溶解定容，此溶液濃度為1000μg/mL。

1.3.4 維生素B1貯備液 準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品0.0250 g于25 mL棕色容量瓶，用25%乙醇溶液溶解定容，此溶液濃度為1000μg/mL。

1.3.5 維生素B2貯備液 準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品0.0100 g于100 mL棕色容量瓶，加入2 mL去離子水、1 mL冰乙酸，在沸水浴80～100℃煮沸30 min，冷卻至室溫后用去離子水定容，此溶液濃度為 1000μg/mL。

1.3.6 維生素B6貯備液 準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品0.0250 g于25 mL棕色容量瓶，用0.1 mol/L鹽酸溶解定容，此溶液濃度為1000μg/mL。

1.3.7 混合標(biāo)準(zhǔn)中間液 分別準(zhǔn)確吸取六種標(biāo)準(zhǔn)貯備液2.50 mL至50 mL棕色容量瓶中，用流動(dòng)相定容。各組分濃度均為50μg/mL。

1.3.8 混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液 依次準(zhǔn)確吸取混合 標(biāo)準(zhǔn) 中 間 液 0.30、0.60、1.00、1.50、2.00 mL 至50 mL棕色容量瓶，用流動(dòng)相定容。得到系列曲線溶液，濃度分別為 0.3、0.6、1.0、1.5、2.0 μg/mL 。

1.4 儀器和設(shè)備 安捷倫高效液相色譜儀1100；pH計(jì)；恒溫水浴鍋；超聲波清洗器。

1.5 液相色譜條件 色譜柱：Poroshell 120 SBC18，4.6 mm×150 mm，粒度 2.7 μm；檢測器：DAD 檢測器；流動(dòng)相流速：0.65 mL/min；進(jìn)樣體積：10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同波長下的數(shù)據(jù)采集 參考GB/T 14700（2002）、GB/T 14701 （2002）、GB/T 14702（2002）、陳金泉等（2012）對復(fù)合維生素B片中多種維生素檢測的研究及張媛媛等（2017）對高效液相檢測復(fù)合維生素片的研究，提及多個(gè)檢測波長，此次共設(shè)置有 214、246、267、280 nm， 經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，214 nm和246 nm條件下基線不穩(wěn)定，組分出峰不理想，在267 nm和280 nm波長下基線穩(wěn)定，故最終選擇267、280 nm兩個(gè)波長同時(shí)采集數(shù)據(jù)。

2.2 不同色譜柱溫對測定的影響 共比較了三種柱溫：30、35、40℃。 經(jīng)過比較發(fā)現(xiàn)，30℃和40℃下，維生素B1和維生素B2分離效果都比較差，特別是在40℃，維生素B1被維生素B2完全包容。故最終選擇35℃柱溫。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線 在流動(dòng)相0.65 mL/min流速，柱溫35℃，267、280 nm雙波長下采集標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，各組分能夠很好地分離，且各組分相關(guān)系數(shù)為0.99964～0.99998。

圖1中，峰1為煙酸，峰2為煙酰胺，峰3為維生素B6，峰4為葉酸，峰5為維生素 B1，峰6為維生素 B2， 出峰時(shí)間分別為 2.993、4.153、6.474、10.393、17.758、19.098 min。圖 1 上半部為 267 nm波長圖譜，下半部為280 nm波長圖譜。由圖1可以看出，煙酸、煙酰胺、維生素B1和維生素B2在267 nm波長下相應(yīng)值高，葉酸和維生素B6在280 nm波長下響應(yīng)值高。

圖2為六個(gè)組分中響應(yīng)值最低的維生素B1在0.30～2.00μg/mL濃度范圍的標(biāo)準(zhǔn)曲線，由圖可以看出，相關(guān)系數(shù)仍然可以達(dá)到0.99964，對于組分的外標(biāo)法定量非常理想。

2.4 樣品提取 樣品提取方法主要有超聲提取和沸水?。?0℃）提取。精確稱取水溶性維生素預(yù)混料0.1600 g于50 mL棕色容量瓶，加入約35 mL提取液振搖后采用兩種提取法分別提取30 min，冷卻至室溫后用提取液定容搖勻，過0.45μm注射器濾膜過濾，上高效液相色譜儀測定。

圖3為水浴提取法樣品圖譜。兩種提取方法均可從維生素預(yù)混合飼料中提取出六種組分，沒有其他雜峰影響這六種維生素的定量。

圖1 1.0μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液圖譜

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 樣品圖譜

由表1可以看出，六種組分超聲提取法均比水浴提取法檢測值偏低，尤其葉酸，超聲提取僅為水浴提取的31%，因此樣品提取應(yīng)采用沸水浴提取。

2.5 添加回收及精密度試驗(yàn) 稱取0.16 g不含水溶性維生素的預(yù)混合飼料于50 mL棕色容量瓶中，加入1 mL 50μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，采用樣品提取同樣的方法，用沸水浴提取30 min，在與標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的色譜條件下測定，測定結(jié)果見表2。

表1 提取方法比較mg/kg

表2 加標(biāo)回收率

由表2可知，六種組分回收率為92.9%～98.7%，可見此提取方法簡單，效果比較理想，且對每個(gè)組分的重復(fù)測定相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值在1%以內(nèi)。

2.6 檢出限 經(jīng)測定，六種水溶性維生素的檢出限分別為煙酸4 mg/kg、煙酰胺5 mg/kg、維生素B610 mg/kg、葉酸 5 mg/kg、維生素 B110 mg/kg、維生素B25 mg/kg。

2.7 流動(dòng)相的選擇 梁琳等（2016）的研究中，用磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀作流動(dòng)相，而本次試驗(yàn)用磷酸氫二鉀：乙腈作流動(dòng)相，但幾個(gè)組分出峰不理想，葉酸、維生素B1無法檢出；而依據(jù)國標(biāo)及符金華等（2017）的研究，換為庚烷磺酸鈉-EDTA：甲醇后各組分分離能夠滿足要求，且91∶9的比例時(shí)維生素B和維生素B2能夠完全分離，而總出峰時(shí)間最短。

3 結(jié)論

該法以庚烷磺酸鈉-EDTA為離子對，加甲醇（V∶V=91∶9）配制流動(dòng)相，柱溫35℃， 流速0.65 mL/min，以酸性EDTA提取液90℃水浴提取，實(shí)驗(yàn)操作簡單，提取方便，因流動(dòng)相采用固定流速、固定體積比，方法基線穩(wěn)定，重復(fù)性理想，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差＜1%，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)在0.9996以上，六種組分分離理想，回收率高，均在92%以上，完全能夠滿足檢測需求。所以本方法作為同步測定預(yù)混合飼料中六種水溶性維生素（煙酸、煙酰胺、維生素 B6、葉酸、維生素 B1、維生素 B2）是一種理想的檢測手段。