高效液相色譜法測(cè)定飼料添加劑D-生物素的含量

裘丞軍，任玉琴

（浙江省獸藥飼料監(jiān)察所，浙江杭州311199）

D-生物素即生物素，又稱維生素H，輔酶R，屬于水溶性B族維生素，廣泛存在于動(dòng)植物組織內(nèi)。其主要作為體內(nèi)多種羧化酶的輔酶，參與二氧化碳的轉(zhuǎn)移固定和羧化反應(yīng)，促進(jìn)糖類、脂肪和蛋白質(zhì)代謝。D-生物素已被收錄于中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告 第2045號(hào)《飼料添加劑品種目錄（2013）》，大量應(yīng)用于生物醫(yī)藥、食品化妝中，在畜禽養(yǎng)殖應(yīng)用中有促進(jìn)動(dòng)物正常生長(zhǎng)，提高飼料轉(zhuǎn)化率等重要作用（陳宏等，2008）。目前食品和飼料中生物素含量的測(cè)定方法，有微生物測(cè)定法（國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，GB 5413.19-2010）、熒光免疫層析法（劉海英，2016）、酶聯(lián)免疫法（徐幼平等，2000）、分光光度法 （國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，GB/T 17778-2005）、高效液相色譜法（潘一斌等，2009；余林梁等，2003）、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 （劉進(jìn)璽等，2010）。其中微生物法、熒光免疫層析法和酶聯(lián)免疫法操作繁瑣，試劑昂貴，對(duì)檢測(cè)技術(shù)要求比較高，主要是針對(duì)檢測(cè)D-生物素含量較低的樣本；分光光度法操作步驟多，時(shí)間長(zhǎng)；液質(zhì)聯(lián)用法對(duì)儀器的要求比較高；而液相色譜法適用范圍大，應(yīng)用比較廣泛。目前，D-生物素原料的分析方法主要有酸堿滴定法（歐洲藥典8.0版，2014：1671-1672； 日本藥典 16 版，2011：458-459）、高效液相色譜法 （美國(guó)藥典 36版，2013：2664-2665），國(guó)內(nèi)飼料行業(yè)尚無國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。本研究為進(jìn)一步優(yōu)化相關(guān)條件建立高效液相色譜法，測(cè)定不同來源和批次的生物素原料含量，并與酸堿滴定法進(jìn)行了對(duì)比研究，結(jié)果確定該方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏、準(zhǔn)確、專屬性好，可以作為生物素飼料原料的質(zhì)量控制方法。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 生物素標(biāo)準(zhǔn)品 （中國(guó)食品藥品檢定研究院）；一水合高氯酸鈉（分析純）；磷酸（分析純）；三氟乙酸（色譜純）；乙腈（色譜純）；水（超純水）；酚酞指示劑；0.1 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定液。

飼料添加劑D-生物素樣品由四家企業(yè)提供（ 批 號(hào) ：141102、VH20150328、CS1-1502019、KXVHUSP150901）。

Agilent1260高效液相色譜儀，紫外檢測(cè)器（美國(guó)Agilent公司）；KQ-500E超聲儀（昆山超聲儀器公司）；ZP205電子天平（Mettler公司）。

1.2 色譜條件 色譜柱：Agilent XDB-C18柱，柱長(zhǎng) 150 mm，內(nèi)徑 4.6 mm，粒徑 5μm；流動(dòng)相：乙腈+緩沖液（含0.1%高氯酸鈉和0.1%磷酸的水溶液）=8.5+91.5（體積比）。 流速：1.2 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 準(zhǔn)確稱取生物素標(biāo)準(zhǔn)品40 mg（精確至0.01 mg），置于200 mL容量瓶中，加入提取液（乙腈+水=1+4）約 150 mL，50℃水浴超聲波助溶5 min，冷卻至室溫，用提取液定容至刻度，混勻。

1.4 飼料添加劑樣品前處理 準(zhǔn)確稱取飼料添加劑試樣 40 mg（精確至 0.01 mg），置于 200 mL容量瓶中，加入提取液（乙腈+水=1+4）約150 mL，50℃水浴超聲波助溶5 min，冷卻至室溫，用提取液定容至刻度，混勻。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法線性和檢測(cè)限試驗(yàn) 取適量標(biāo)準(zhǔn)品溶解稀釋成 25、50、100、200、400 μg/mL 系列濃度的溶液，取20μL注入液相色譜測(cè)定分析，記錄生物素峰面積，以濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制線性回歸曲線。結(jié)果表明生物素在25～400μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，y=7.46044x+4.06379（r=1.00000)，方法檢測(cè)限為1.5 mg/kg，滿足檢測(cè)要求。標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖1。

2.2 精密度試驗(yàn) 取四批次樣品 （批號(hào)141102、VH20150328、CS1-1502019、KXVHUSP150901）各5份，按試驗(yàn)方法1.4處理，取20μL樣品溶液注入液相色譜測(cè)定分析，外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果如表2， 平均含量分別為 100.4%、99.3%、99.9%、95.9%，RSD（n=5）為 0.1%、0.2%、0.1%、0.2%，表明精密度良好。

2.3 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 取生物素標(biāo)準(zhǔn)品約30、40、50 mg各3份（精確至0.01 mg），按試驗(yàn)方法1.4處理，取20μL樣品溶液注入液相色譜測(cè)定分析，外標(biāo)法計(jì)算含量，并計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

圖1 HPLC色譜圖

2.4 與酸堿滴定法測(cè)定含量的比較 參照美國(guó)藥典36版 （2013：2664-2665） 測(cè)定生物素的方法，稱取四批次樣品（批號(hào)CS1-1502019、141102、VH20150328、KXVHUSP150901）各 5 份，每份約500 mg（精確到0.1 mg），置于 250 mL錐形瓶中，加水100 mL。加熱攪拌溶解，加酚酞指示劑2滴，用0.1 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定液緩慢滴定至粉紅色，且保持30秒不褪色，每毫升0.1 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定液相當(dāng)于24.43 mg的生物素。計(jì)算樣品含量和RSD，結(jié)果如表2，試樣1與試樣2兩種方法含量測(cè)定結(jié)果基本一致，試樣3和試樣4用本方法測(cè)定的結(jié)果較酸堿滴定法低。進(jìn)一步分析試樣溶液色譜圖，發(fā)現(xiàn)試樣1和2色譜圖基線干凈無雜峰，而試樣3和4主峰后有雜質(zhì)峰出現(xiàn)，并呈完全的基線分離，表明酸堿滴定法定量沒有專屬性，準(zhǔn)確度較低，而本方法分離效果好，準(zhǔn)確度高。另外RSD數(shù)據(jù)表明本方法的精密度比酸堿滴定法相對(duì)更高，所以確定本方法定量更加準(zhǔn)確合理。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

表2 兩種含量測(cè)定方法結(jié)果比較

2.5 溶液放置穩(wěn)定性 取樣品 （批號(hào)KXVHUSP150901）按試驗(yàn)方法1.4處理，在室溫分別放置 0、25、50、100、150、250 min 后測(cè)定，記錄峰面積，顯示峰面積分別為1472、1469、1472、1470、1473、1472 （單位 mAU*s）；RSD=0.1%（n=6）。結(jié)果表明樣品溶液在考察的時(shí)間范圍內(nèi)有很好的穩(wěn)定性。

2.6 專屬性 取樣品（批號(hào)CS1-1502019）約20 mg（共5份），其中三份分別加5 mL 1 mol/L鹽酸溶液、5 mL 1 mol/L氫氧化鈉溶液、5 mL 30%雙氧水，放置18 h，進(jìn)行酸破壞、堿破壞、氧化破壞，pH調(diào)至中性后用提取液稀釋至100 mL；另兩份直接用提取劑稀釋后，一份在254、365 nm紫外波長(zhǎng)光照24 h，一份不做任何處理作為對(duì)照。結(jié)果表明樣品對(duì)酸、堿和光照均較穩(wěn)定，對(duì)于氧化破壞較明顯，產(chǎn)生的氧化破壞產(chǎn)物在該色譜條件下完全分離無干擾。色譜圖見圖2。

圖2 試樣破壞試驗(yàn)處理后色譜圖

2.7 耐用性 取樣品（批號(hào)KXVHUSP150901）按試驗(yàn)方法處理，在該色譜條件下通過改變色譜柱型號(hào)規(guī)格、流動(dòng)相比例以及色譜儀器型號(hào)考察，結(jié)果表明色譜系統(tǒng)耐用性良好。

3 討論

3.1 色譜條件優(yōu)化

3.1.1 波長(zhǎng)選擇 生物素在紫外波長(zhǎng)光區(qū)內(nèi)沒有特征吸收峰波長(zhǎng)，在190～235 nm波長(zhǎng)處吸光度由高到低。試驗(yàn)中選取乙腈/0.05%三氟乙酸溶液=15/85、乙腈/水=1/4、乙腈/0.1%高氯酸鈉和 0.1%磷酸溶液=8.5/91.5三種溶媒，取4批次試樣，每批試樣3份用相應(yīng)的溶媒溶解稀釋成濃度約為40μg/mL的溶液，用200、210 nm兩個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)，進(jìn)行5次重復(fù)檢測(cè)，結(jié)果見表3。在乙腈/水作為溶媒時(shí)，210 nm吸光度更穩(wěn)定。因此檢測(cè)波長(zhǎng)確定為210 nm。

表3 兩種波長(zhǎng)和三種溶媒吸光度穩(wěn)定性比較（n=5）

3.1.2 流動(dòng)相組成 生物素的化學(xué)結(jié)構(gòu)是咪唑酮環(huán)與噻吩環(huán)相結(jié)合的駢環(huán)，帶有一個(gè)戊酸側(cè)鏈，呈弱酸性。在中性和堿性溶液環(huán)境中部分或全部以離子形態(tài)存在，有較強(qiáng)極性，在C18色譜柱上幾乎不保留，但是在弱酸環(huán)境中生物素以分子形態(tài)存在，極性減弱，在C18色譜柱上保留時(shí)間長(zhǎng)。因此選擇帶弱酸性的溶液作為流動(dòng)相，并且選用在短波長(zhǎng)處吸收小的乙腈體系作為流動(dòng)相。試驗(yàn)參考美國(guó)藥典 36版（2013：2664-2665）選取乙腈磷酸高氯酸鈉緩沖液體系 （乙腈/0.1%高氯酸鈉和0.1%磷酸溶液=8.5/91.5）、參考?xì)W洲藥典8.0版（2014：1671-1672）選取乙腈三氟乙酸溶液體系（乙腈/0.05%三氟乙酸溶液=15/85），用25%乙腈水溶解稀釋試樣至200μg/mL的溶液測(cè)試對(duì)比分析，并對(duì)試劑空白進(jìn)行色譜分析，結(jié)果見表4。生物素在乙腈磷酸高氯酸鈉緩沖液體系中理論塔板數(shù)高，對(duì)稱因子大，分離度高，保留時(shí)間合理，基線噪音?。ㄒ妶D1），更適合作為流動(dòng)相。

表4 兩種流動(dòng)相體系比較

3.2 溶解方法的確定 生物素在稀堿中溶解，在水中極微溶，在50℃水中微溶，在乙腈中幾乎不溶，而本方法色譜條件是弱酸性環(huán)境，不能用稀堿溶解。結(jié)合3.1.1波長(zhǎng)選擇試驗(yàn)，生物素用乙腈水溶液作為溶媒時(shí)，吸光度更穩(wěn)定，因此試驗(yàn)中精密稱取5份試樣（批號(hào)KXVHUSP150901），選取用乙腈/水=1/4作為提取劑，分別直接振搖5 min或者50℃水浴超聲助溶 5、10、20、30 min進(jìn)行考察分析，測(cè)得樣品濃度，結(jié)果表明水浴超聲5 min就能夠有效溶解試樣。

4 結(jié)論

本文對(duì)高效液相色譜法測(cè)定飼料添加劑生物素原料的含量進(jìn)行優(yōu)化研究，并進(jìn)一步和酸堿滴定法進(jìn)行比較，結(jié)果表明，酸堿滴定法需人為判斷滴定終點(diǎn)，存在個(gè)體差異，專屬性也不強(qiáng)，精密度和準(zhǔn)確度相對(duì)較差；而本方法選用較為穩(wěn)定的210 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，乙腈高氯酸鈉磷酸緩沖液作為流動(dòng)相，保留時(shí)間合理，基線穩(wěn)定，噪音小，操作簡(jiǎn)單，樣品直接溶解后使用高效液相色譜儀外標(biāo)法定量，人為誤差減少，并且雜質(zhì)分離效果好，專屬性強(qiáng)，相對(duì)酸堿滴定法有較好的精密度和準(zhǔn)確度，非常適用于生物素原料的質(zhì)量控制。