乳果糖生產(chǎn)方法及其在肉雞生產(chǎn)中的應(yīng)用

呂路芳， 謝文惠， 姜 寧， 張愛忠

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江大慶 163319）

乳果糖（4-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-果糖）是由一分子果糖和一分子半乳糖，通過(guò)β-1,4-糖苷鍵結(jié)合的不易消化的雙糖（Wang等，2013）。作為人工合成的雙糖，乳果糖的合成主要通過(guò)化學(xué)異構(gòu)法和酶法催化，但這兩種方法都有其局限性。考慮到合成的可行性和環(huán)境因素，相比于化學(xué)異構(gòu)化，以酶法催化合成乳果糖更具吸引力。乳果糖在人類食品中已被廣泛應(yīng)用，在肉雞生產(chǎn)中應(yīng)用較少，因此本文介紹了化學(xué)法和酶法催化（例如糖苷酶和糖基轉(zhuǎn)移酶）生產(chǎn)乳果糖，并對(duì)乳果糖在肉雞生產(chǎn)中的應(yīng)用進(jìn)行了總結(jié)，同時(shí)對(duì)乳果糖生產(chǎn)技術(shù)未來(lái)的發(fā)展進(jìn)行了展望，以期為乳果糖在畜禽等方面的后續(xù)開發(fā)與利用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 化學(xué)法合成乳果糖

1.1 化學(xué)異構(gòu)化合成乳果糖 早在 1895年，Lobry de Bruyn和Van Ekenstein發(fā)現(xiàn)還原性糖在堿性溶液中會(huì)發(fā)生異構(gòu)化反應(yīng)生產(chǎn)非還原性糖，此類堿催化的醛糖-酮糖異構(gòu)化反應(yīng)被稱為洛布雷·德·布律-埃肯施泰因轉(zhuǎn)化反應(yīng) （沈秋云，2015）。1929年，Montgomery通過(guò)使用弱氫氧化鈣溶液（石灰水）對(duì)乳糖異構(gòu)化合成了乳果糖。乳糖化學(xué)異構(gòu)化為乳果糖方法，其過(guò)程可以使用酸（石灰，硫酸）、堿（三乙胺、氫氧化鈉、氧化鎂和亞硫酸鹽）和兩性催化劑 （羥基、亞硫酸鹽和硼酸鹽）（Aider等，2007）。 通過(guò)洛布雷·德·布律-?？鲜┨┮蜣D(zhuǎn)化反應(yīng)將葡萄糖異構(gòu)化成果糖基 （圖1）（Schuster等，2010），基本原理為還原性乳糖在熱處理過(guò)程中，經(jīng)過(guò)化學(xué)催化劑的催化作用，將乳糖上的葡萄糖直接異構(gòu)化為果糖從而得到乳果糖。

1.2 電化學(xué)反應(yīng)合成乳果糖 已有研究表明，在電化學(xué)催化方法的基礎(chǔ)上可以電活化合成乳果糖（Ait等，2014）。通過(guò)高濃度堿在反應(yīng)介質(zhì)中自動(dòng)發(fā)電，這種方法被認(rèn)為是一種新型節(jié)能技術(shù)。然而，這種技術(shù)產(chǎn)率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于化學(xué)異構(gòu)化合成產(chǎn)率，所以在電化學(xué)反應(yīng)合成乳果糖的研究至今還比較少。

2 酶法催化合成乳果糖

用于乳糖轉(zhuǎn)化成乳果糖的催化劑必須很容易從最終產(chǎn)物中去除，并且安全無(wú)毒和廉價(jià)環(huán)保。因此，酶法催化合成乳果糖是一個(gè)好的選擇。目前有兩種酶類能夠催化乳果糖合成，即糖苷水解酶與纖維二糖差向異構(gòu)酶（Mayer等，2004）。這兩類酶中，糖苷水解酶（如β-半乳糖苷酶）更適于工業(yè)生產(chǎn)，其在市面上已有銷售，且價(jià)格低廉，已被廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)，特別是無(wú)乳糖乳制品中。

圖1 葡萄糖異構(gòu)化成果糖基示意圖（Schuster等，2010）

2.1 通過(guò)β-半乳糖苷酶催化合成乳果糖 β-半乳糖苷酶又稱乳糖酶，是乳糖水解酶，可催化乳糖水解為半乳糖和葡萄糖，在乳糖水解過(guò)程中，乳糖本身也可以作為一個(gè)受體，與此同時(shí)，也會(huì)產(chǎn)生低聚半乳糖（GOS）。β-半乳糖苷酶首先作用于乳糖釋放葡萄糖并形成酶-半乳糖中間復(fù)合物，當(dāng)半乳糖基受體是水時(shí)形成半乳糖，當(dāng)受體是果糖時(shí)則發(fā)生轉(zhuǎn)半乳糖基反應(yīng)而得到乳果糖。因此，乳果糖是通過(guò)轉(zhuǎn)半乳糖苷酶催化乳糖和果糖合成的，高濃度的乳果糖通過(guò)某些酶 （如β-半乳糖苷酶）的作用容易發(fā)生次級(jí)水解成半乳糖和果糖。

2.2 微生物酶對(duì)乳果糖的轉(zhuǎn)糖基作用 從乳糖和果糖酶促合成乳果糖早在1978年已有報(bào)道，當(dāng)時(shí)Vaheri和Kaupinnen利用脆壁酵母β-半乳糖苷酶催化乳糖的轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)，乳果糖的產(chǎn)量達(dá)到7.8 g/L，得率只有3%左右。除了果糖之外，其他的親核試劑，如水、乳糖和低聚半乳糖都可以作為水溶液中乳果糖的合成所產(chǎn)生的半乳糖基受體。通過(guò)這些受體之間的競(jìng)爭(zhēng)，對(duì)反應(yīng)選擇性和得率都有很大的影響（Panesar等，2011）。

酶的濃度也顯著影響反應(yīng)速率。Sitanggang等（2016）研究得出，在較高的酶濃度下（＞15 U/mL），原發(fā)性水解（乳糖水解）和次級(jí)水解（乳果糖水解）降解更快；此外，該研究還表明必須考慮酶濃度與乳糖初始量的比值以提高反應(yīng)速率，提出了用互補(bǔ)酶使葡萄糖異構(gòu)化合成果糖的方法，因?yàn)槠涫莿?dòng)力學(xué)控制，次級(jí)水解后所得的乳果糖濃度達(dá)到最高。

同時(shí)應(yīng)該避免次級(jí)水解而增加的非生產(chǎn)性時(shí)間，使乳果糖持續(xù)合成，例如：酶膜反應(yīng)器（EMR）、微通道（MC）或填充床反應(yīng)器（PBR）（Sitanggang等，2014）。特別是在EMR固定體積下，沒有固相酶也可以持續(xù)合成乳果糖。酶分子可以保留在柱子內(nèi)的膜上，同時(shí)使產(chǎn)品、副產(chǎn)品和底物滲透下來(lái)。EMR系統(tǒng)的連續(xù)運(yùn)行，可以改善連續(xù)生產(chǎn)中因?yàn)榇渭?jí)水解而使乳果糖降解的問題。也有很多研究利用PBR使乳糖（乳清蛋白）和果糖連續(xù)合成乳果糖。一種新型的具有激活壁的微通道系統(tǒng)被認(rèn)為是一種可替代乳果糖連續(xù)合成的新技術(shù)，然而，微反應(yīng)器的活性壁的制備比較復(fù)雜。有相關(guān)研究得出在微反應(yīng)器中，用功能化多壁碳納米管固定的β-半乳糖苷酶催化合成乳果糖，48 h內(nèi)乳果糖的濃度保持在1.29 g/L（Song等，2012）。

2.3 通過(guò)纖維二糖差向異構(gòu)酶合成乳果糖 低反應(yīng)收率和在功能性食品市場(chǎng)對(duì)乳果糖的需求增加，要求我們需要進(jìn)一步研究生產(chǎn)乳果糖更加便宜的酶催化劑。有相關(guān)研究報(bào)道纖維二糖差向異構(gòu)酶可以催化β-1,4-糖苷鍵連接的低聚糖還原端 D-葡萄糖基差向異構(gòu)化為 D-甘露糖基（Park等，2011）。有些纖維二糖差向異構(gòu)酶還可以催化還原端 D-葡萄糖基異構(gòu)化為D-果糖基，即可以催化乳糖轉(zhuǎn)化為乳果糖。Kim等（2012）用糖熱解纖維素果汁桿菌纖維二糖異構(gòu)酶（CsCE）催化乳糖反應(yīng)，在確定的最適條件（pH 7.5，80 °C，700 g/L乳糖）下，乳果糖產(chǎn)量可達(dá) 408 g/L，乳果糖的轉(zhuǎn)化率為58%，同時(shí)有約15%的底物乳糖轉(zhuǎn)化為依匹乳糖。另有研究在CsCE催化乳果糖合成的反應(yīng)體系中加入硼酸鹽 （摩爾比，硼酸鹽∶乳糖=1∶1），乳果糖的產(chǎn)量提高到 616 g/L，轉(zhuǎn)化率提高到88%（Kim 等，2013）。Shen 等（2016）采用隨機(jī)誘變CsCE產(chǎn)生纖維二糖差向異構(gòu)酶，經(jīng)過(guò)四次連續(xù)的隨機(jī)突變和篩選，得到一個(gè)最佳的G4-C5突變酶，這個(gè)G4-C5突變酶可以使乳果糖合成收益率為76%，并且在異構(gòu)化的時(shí)候不會(huì)產(chǎn)生依匹乳糖。乳果糖在合成的過(guò)程中，純化有一定程度的復(fù)雜性。最近研究表明，乳糖通過(guò)異構(gòu)化合成乳果糖的最佳條件是80°C，pH為7.5的Hepes緩沖溶液。在此條件下，乳果糖在90 min內(nèi)濃度迅速增加，在3 h內(nèi)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，雖然是分批合成，但并沒有觀察到乳果糖有分解的現(xiàn)象 （Shen等，2016）。

通過(guò)利用CsCE合成乳果糖，酶法催化與化學(xué)異構(gòu)化反應(yīng)的產(chǎn)率基本一致。以隨機(jī)誘變的方法生產(chǎn)G4-C5酶，并在EMR固定體積下進(jìn)行連續(xù)操作，酶法催化合成乳果糖可能比化學(xué)異構(gòu)化更有效?？梢院?jiǎn)化分離回收乳果糖的步驟，從而降低生產(chǎn)成本，但是，為了使其能夠工業(yè)化生產(chǎn)，必須建立酶 （例如G4-C5纖維二糖差向異構(gòu)酶）的工業(yè)生產(chǎn)；此外，乳果糖作為功能性食品，其生產(chǎn)所用必須僅限于具有 （一般公認(rèn)安全）（GRAS）和（食品及藥物管理局）（FDA）的認(rèn)定，這些限制性問題希望在未來(lái)的研究中能夠解決。

3 乳果糖在肉雞生產(chǎn)中的應(yīng)用

乳果糖對(duì)雙歧桿菌具有增殖效果，在食品工業(yè)中往往被作為功能性食品添加劑或雙歧因子使用。乳果糖是一種合成的二糖，不被胃腸道自身的酶分解，進(jìn)入小腸后被雙歧桿菌產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶分解而成為雙歧桿菌的碳源，促進(jìn)雙歧桿菌的生長(zhǎng)，酸化腸道環(huán)境，降低腸道還原電位，抑制有害菌生長(zhǎng)。乳果糖還被歐盟飼料和食品質(zhì)量安全管理局（Quality and Safety of Feeds and Food for Europe；European Commission 2011）認(rèn)定為一種新型飼料添加劑，其可通過(guò)促進(jìn)雙歧桿菌和乳酸桿菌增殖，抑制沙門氏菌的生長(zhǎng)，提高肉雞對(duì)腸道疾病的免疫力，從而減少抗生素在飼料中的使用（鄭排云等，2017）。

3.1 乳果糖對(duì)肉雞生產(chǎn)性能和屠宰性能的影響黃海濱等（2012）研究表明，添加不同水平乳果糖替代飼用抗生素后肉仔雞的活體重、平均日增重、平均日采食量較抗生素組均有所提高，較陰性對(duì)照組均有降低料重比的趨勢(shì)；添加0.5%、1.0%乳果糖的肉仔雞宰前活重、屠體重、半凈膛重、全凈膛重、腿肌重均優(yōu)于抗生素組，并且添加0.5%、1.0%的乳果糖在一定程度上降低了肉仔雞的脂肪沉積；綜合乳果糖對(duì)肉仔雞生產(chǎn)性能及胴體品質(zhì)的影響，其中以1.0%乳果糖替代飼用抗生素的效果較佳。李虎等（2011）研究報(bào)道，在黃羽肉雞基礎(chǔ)日糧中添加不同劑量的乳果糖，能達(dá)到與添加抗生素相當(dāng)?shù)男Ч?，從期末平均體重、平均日增重、平均日采食量、料重比、死亡率等因素綜合評(píng)價(jià)，在黃羽肉雞日糧中添加5 g/kg的乳果糖可以替代飼用抗生素；79日齡時(shí)活體重、屠體重、全凈膛重、半凈膛重、胸肌重、腿肌重、腹脂重方面與添加飼用抗生素組相比有升高趨勢(shì)；屠宰率、半凈膛率、腿肌率方面與用抗生素組效果相當(dāng)；全凈膛率、胸肌率方面，與飼用抗生素組相比略有降低。就屠宰性能方面而言在黃羽肉雞基礎(chǔ)日糧中添加5 g/kg乳果糖可以替代飼用抗生素。Gheisar等（2016）在基礎(chǔ)日糧中添加0.25%和0.5%的乳果糖，結(jié)果表明在肉仔雞8～21日齡、21～35日齡和0～35日齡，都能顯著提高平均日增重 （P＜0.05）和降低料重比（P＜0.05），飼喂添加水平為0.5%乳果糖的肉仔雞胸脯肉相對(duì)重量高于其他組，滴水損失率下降（P＜0.05）。

3.2 乳果糖對(duì)肉雞腸道菌群和腸道黏膜形態(tài)的影響 崔彪等（2012）研究表明，在基礎(chǔ)日糧中添加5 g/kg乳果糖替代黃羽肉雞飼用抗生素與陰性對(duì)照組相比，乳果糖組腸道內(nèi)容物中細(xì)菌數(shù)量及回腸內(nèi)容物總酸的濃度提高，腸黏膜蛋白質(zhì)中溶菌酶的含量、十二指腸黏膜蛋白質(zhì)中SIgA含量提高，并且這種作用在45日齡時(shí)強(qiáng)于77日齡。唐倩等（2012）研究結(jié)果顯示在日糧中添加不同水平乳果糖在一定程度上促進(jìn)了小腸對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用，顯著提高了十二指腸、空腸和回腸絨毛高度，降低了隱窩深度，乳果糖使腸道內(nèi)容物中的丁酸含量增加，有利于肉仔雞腸道結(jié)構(gòu)和功能的發(fā)育和修復(fù)受損后的腸道，其中以1.0%的添加量最好。Zhao等（2016）研究結(jié)果表明，飼喂0.15%乳果糖降低了14日齡糞便中的大腸桿菌數(shù) （P＜0.05），提高了14和35日齡糞便中的乳酸菌數(shù)（P＜0.05）。Calik等（2015）在以玉米-豆粕基礎(chǔ)日糧中添加 0%、0.2%、0.4%、0.6%和 0.8%的乳果糖，在42日齡時(shí)，添加不同水平乳果糖的腸道杯狀細(xì)胞與空白對(duì)照組相比無(wú)明顯差異，對(duì)盲腸中各菌群并沒有起到飲食治療的作用。7日齡和42日齡時(shí)測(cè)得肉雞的總揮發(fā)性脂肪酸結(jié)果顯示乳果糖能顯著增加和補(bǔ)充乙酸、丙酸和丁酸的濃度。

4 總結(jié)與展望

由于功能性食品市場(chǎng)對(duì)乳果糖的需求不斷增加，應(yīng)該對(duì)如何經(jīng)濟(jì)有效地合成乳果糖作出更多研究。通過(guò)纖維二糖異構(gòu)酶固有的催化能力，與化學(xué)異構(gòu)化法相比乳糖異構(gòu)化合成乳果糖與其反應(yīng)產(chǎn)率相同，且不會(huì)產(chǎn)生副產(chǎn)物（依匹乳糖）。建議使用CsCE G4-C5纖維二糖差向異構(gòu)酶EMR固定體積，可以簡(jiǎn)化乳果糖的分離和純化過(guò)程，與化學(xué)異構(gòu)化相比，這可以降低生產(chǎn)成本。為了經(jīng)濟(jì)有效的合成乳果糖，應(yīng)該對(duì)異構(gòu)酶制劑安全問題及其商業(yè)可用性進(jìn)行更深入的研究。